3D打印羊椎骨粉/聚乙烯醇支架、纳米级羟基磷灰石/聚乙烯醇支架、羊椎骨粉/聚乙烯醇无孔骨板的性能比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.52.014

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (52): 7851-7857.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.52.014

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3D打印羊椎骨粉/聚乙烯醇支架、纳米级羟基磷灰石/聚乙烯醇支架、羊椎骨粉/聚乙烯醇无孔骨板的性能比较

周琦琪¹，韩祥祯¹，宋艳艳¹，吕明凡²，胡杨¹，何惠宇¹

¹新疆医科大学第一附属医院口腔修复科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；²新疆财经大学金融学院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830012

收稿日期:2016-10-05 出版日期:2016-12-16 发布日期:2016-12-16
通讯作者: 何惠宇，主任医师，教授，硕士、博士生导师，新疆医科大学第一附属医院口腔修复科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:周琦琪，女，1989年生，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市人，新疆医科大学在读硕士，主要从事口腔修复学及组织工程研究。
基金资助:
新疆维吾尔自治区科技厅科技支疆项目(201291173)

Performance comparison of 3D printing sheep vertebral bone meal/polyvinyl alcohol scaffold, nano-hydroxyapatite/polyvinyl alcohol scaffold and sheep vertebral bone meal/polyvinyl alcohol nonporous bone plate

Zhou Qi-Qi¹, Han Xiang-zhen¹, Song Yan-yan¹, Lv Ming-fan², Hu Yang¹, He Hui-yu¹

¹Department of Prosthodontics, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; ²Financial institute, Xinjiang University of Finance & Economics, Urumqi 830012, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2016-10-05 Online:2016-12-16 Published:2016-12-16
Contact: He Hui-yu, Master, Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Department of Prosthodontics, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Zhou Qi-qi, Studying for master’s degree, Department of Prosthodontics, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Scientific Support Program for Xinjiang Uygur Autonomous Region, China, No. 201291173

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
羊椎骨粉/聚乙烯醇支架：羊椎骨粉作为天然的骨质材料，具有其他无机材料所不可比拟的生物相容性和骨传导特性。聚乙烯醇水凝胶是一种在组织工程中应用广泛的高分子材料，作为黏结剂无毒且易降解，机械性能良好，吸水量大，生物相容性好。实验以天然绵羊脊柱松质骨为原料，通过选择化学试剂浸泡法、物理高温煅烧法处理，去除羊松质骨中易引起免疫反应的各种异种抗原成分，制成骨粉，以备与聚乙烯醇水凝胶混合，制成羊椎骨粉/聚乙烯醇组织工程骨支架。
支架微孔结构：支架材料是否能良好发挥其材料性能，合适的微孔结构关是键。孔隙过大易造成支架力学性不良，难以应用于例如牙槽骨等力学要求较高的功能区域；孔径过小会导致新生细胞及组织难以长入。已有研究证实，最小孔径为100-150 µm，即可满足组织再生，并发现支架材料的孔径在300-600 μm间，最有利于新骨长成。

背景：随着3D打印技术的推广，3D打印组织工程骨支架成为颌骨缺损修复的新方向。
目的：对比3D打印羊椎骨粉/聚乙烯醇支架、纳米级羟基磷灰石/聚乙烯醇支架、羊椎骨粉/聚乙烯醇无孔骨板的理化与生物性能。
方法：利用3D打印技术，分别打印出羊椎骨粉/聚乙烯醇支架、纳米级羟基磷灰石/聚乙烯醇支架、羊椎骨粉/聚乙烯醇无孔骨板，进行孔隙率、扫描电镜、吸水率及压缩力学性能测定；将3种支架分别与骨髓间充质干细胞共培养1，4，7 d，采用CCK-8法检测细胞增殖。
结果与结论：①扫描电镜观察：纳米级羟基磷灰石/聚乙烯醇支架、羊椎骨粉/聚乙烯醇支架孔隙规则，网状结构清晰，孔隙间存在广泛交通，连续性好；羊椎骨粉/聚乙烯醇无孔骨板没有明显孔隙，但表面有大小不一微孔，材料致密，分布均匀；②孔隙率：纳米级羟基磷灰石/聚乙烯醇支架孔隙率低于羊椎骨粉/聚乙烯醇支架(P < 0.05)；③吸水率：在不同时间点，纳米级羟基磷灰石/聚乙烯醇支架>羊椎骨粉/聚乙烯醇支架>羊椎骨粉/聚乙烯醇无孔骨板(P < 0.05)；④压缩力学性能：羊椎骨粉/聚乙烯醇支架的韧性高于纳米级羟基磷灰石/聚乙烯醇支架，低于羊椎骨粉/聚乙烯醇无孔骨板；⑤细胞毒性：羊椎骨粉/聚乙烯醇支架的细胞增殖活性高于其余两组支架(P < 0.05)；⑥结果表明：3D打印羊椎骨粉/聚乙烯醇支架具有良好的物理及化学性能。

ORCID: 0000-0003-1918-579X(何惠宇)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 组织工程骨, 3D打印, 羟基磷灰石, 羊椎骨粉, 聚乙烯醇

Abstract:

BACKGROUND: With the promotion of 3D printing technology, 3D printing scaffolds for bone tissue engineering have become the new ideas for jaw bone repair.
OBJECTIVE: To compare the physical and biological properties of sheep vertebral bone meal/polyvinyl alcohol (PVA) scaffold, nano-hydroxyapatite (nHA)/PVA scaffold, and sheep vertebral bone meal/PVA nonporous bone plate.
METHODS: 3D printing technology was used to print sheep vertebral bone meal/PVA scaffold, nHA/PVA scaffold, and sheep vertebral bone meal/PVA nonporous bone plate. Porosity, morphology, water absorption rate and mechanical properties of different scaffolds were detected. Three kinds of scaffolds were all used to culture bone marrow mesenchymal stem cells, and cell proliferation ability was detected using cell counting kit-8 at 1, 4, 7 days of culture.
RESULTS AND CONCLUSION: Under scanning electron microscope, the sheep vertebral bone meal/PVA scaffold and nHA/PVA scaffold exhibited regular and interconnected pores with good continuity and clear network structure; the sheep vertebral bone meal/PVA nonporous bone plate had no obvious pores; however, it had dense and evenly distributed micropores with different sizes on its surface. The porosity of nHA/PVA scaffold was lower than that of the sheep vertebral bone meal/PVA scaffold (P < 0.05). The water absorption rate was highest for the nHA/PVA scaffold followed by the sheep vertebral bone meal/PVA scaffold and the sheep vertebral bone meal/PVA nonporous bone plate (P < 0.05). In contrast, the scaffold toughness was highest for the sheep vertebral bone meal/PVA nonporous bone plate, followed by the sheep vertebral bone meal/PVA scaffold and nHA/PVA scaffold. In addition, the cell proliferation activity of cells cultured on the sheep vertebral bone meal/PVA scaffold was significantly higher than that cultured on the other two kinds of scaffolds. Taken together, the 3D printing sheep vertebral bone/PVA scaffold has good physical and chemical performance.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Hydroxyapatites, Cytotoxicity Tests, Immunologic, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

周琦琪，韩祥祯，宋艳艳，吕明凡，胡杨，何惠宇. 3D打印羊椎骨粉/聚乙烯醇支架、纳米级羟基磷灰石/聚乙烯醇支架、羊椎骨粉/聚乙烯醇无孔骨板的性能比较[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(52): 7851-7857.

Zhou Qi-Qi, Han Xiang-zhen, Song Yan-yan, Lv Ming-fan, Hu Yang, He Hui-yu.

Performance comparison of 3D printing sheep vertebral bone meal/polyvinyl alcohol scaffold, nano-hydroxyapatite/polyvinyl alcohol scaffold and sheep vertebral bone meal/polyvinyl alcohol nonporous bone plate

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(52): 7851-7857.

图/表（结果） 4

2.1 支架超微形态结构观察结果扫面电镜显示，纳米级羟基磷灰石/聚乙烯醇支架及羊椎骨粉/聚乙烯醇支架孔隙近似正方形，孔隙规则，网状结构清晰，孔隙间存在广泛的交通，连续性好，层与层之间搭接良好；纳米级羟基磷灰石/聚乙烯醇支架孔径范围330-500 μm，羊椎骨粉/聚乙烯醇支架孔径范围240-600 μm，而羊椎骨粉/聚乙烯醇无孔骨板没有明显的孔隙，但表面具有大小不一微孔，材料致密，分布均匀。相同倍数显示，纳米级羟基磷灰石/聚乙烯醇支架表面颗粒明显小于羊椎骨粉/聚乙烯醇支架，但由于羊椎骨粉/聚乙烯醇支架及羊椎骨粉/聚乙烯醇无孔骨板材料颗粒大，所以其表面微孔数大于纳米级羟基磷灰石/聚乙烯醇支架，见图1。

2.2 支架孔隙率测定结果纳米级羟基磷灰石/聚乙烯醇支架及羊椎骨粉/聚乙烯醇支架的孔隙率分别为(33.35±4.60)%、(49.43±8.21)%，将测定所得的平均孔隙率整理，设定检验水准α=0.05水准。实验方法测定条件下的数据经SPSS 17.0软件Levene检验方差齐性，P > 0.05，可认为各组在同一检测法下具有方差齐性；同一测定方法条件下，采用单因素方差分析检测得出F=37.93，P < 0.05，说明各组间孔隙率差异不全相同。

2.3 支架吸水率测定结果将所得数据进行整理，采用单因素方差分析，分别比较3组材料每个时点的吸水率，设定检验水准α=0.05水准，结果见表1。

数据显示，在不同时间，3组材料的吸水率有显著差异；在0.5，1，2 h时间点，吸水率纳米级羟基磷灰石/聚乙烯醇支架>羊椎骨粉/聚乙烯醇支架>羊椎骨粉/聚乙烯醇无孔骨板；24 h后，因在蒸馏水中开始溶解，质量减少，故测定羊椎骨粉/聚乙烯醇支架吸水率减少；而在24-48 h之间，纳米级羟基磷灰石/聚乙烯醇支架吸水率变化范围很小，说明其在48 h左右吸水率趋近饱和。

2.4 压缩力学性能检测结果采用非金属材料压缩实验观测3组样本的应力-应变曲线，见图2。

最大加压200 MPa时，羊椎骨粉/聚乙烯醇支架、纳米级羟基磷灰石/聚乙烯醇支架、羊椎骨粉/聚乙烯醇无孔骨板的应变分别为25%、30%、24.5%。当应变同为20%时，各组承受的应力，羊椎骨粉/聚乙烯醇无孔骨板>羊椎骨粉/聚乙烯醇支架>NHA/聚乙烯醇支架。比较应变值同为20%时各组曲线斜率，发现羊椎骨粉/聚乙烯醇无孔支架>羊椎骨粉/聚乙烯醇支架>纳米级羟基磷灰石/聚乙烯醇支架，提示羊椎骨粉/聚乙烯醇架材料的韧性比纳米级羟基磷灰石/聚乙烯醇支架高。各组在最大仪器所能施加的最大加压200 MPa时均产生形变，但由于支架高度仅为2 mm，故形变量并不明显，其中形变量羊椎骨粉/聚乙烯醇无孔骨板<羊椎骨粉/聚乙烯醇支架<纳米级羟基磷灰石/聚乙烯醇支架，提示各组支架的抗压形变能力为：羊椎骨粉/聚乙烯醇无孔骨板>羊椎骨粉/聚乙烯醇支架>纳米级羟基磷灰石/聚乙烯醇支架最强。

2.5 材料细胞毒性检测结果骨髓间充质干细胞在3种材料表面的增殖呈时间依赖性，随培养时间延长细胞数目明显增加，羊椎骨粉/聚乙烯醇支架组表面活细胞数量明显高于其他两组(P < 0.05)；培养1，4 d后，纳米级羟基磷灰石/聚乙烯醇支架材料表面的细胞数略高于羊椎骨粉/聚乙烯醇无孔骨板组，但这两种材料表面的细胞增殖无明显差异(P > 0.05)；培养7 d后，羊椎骨粉/聚乙烯醇无孔骨板组表面活细胞数量明显低于其他两组(P < 0.05)，见图3。

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引言

材料方法

1.1 设计观察性实验。

1.2 时间及地点实验于2015年10月至2016年1月在新疆医科大学第一附属医院医学研究中心完成。

1.3 材料市售成年羊椎骨；甲醇(分析纯)；氯仿(分析纯)；体积分数30%过氧化氢溶液(分析纯)；0.09 mol/L焦磷酸钠溶液(分析纯)；粒径20 nm纳米级羟基磷灰石(南京埃普瑞纳米材料公司)；聚乙烯醇(分析纯)；电子天平(Sartorius BSA124S)(新疆医科第一附属医院提供)；茂福炉(AX-4-10，天津爱鑫公司)；JEOL-JSM-6390LV(日本)扫描电子显微镜(新疆医科大学电子显微镜室提供)；三维打印成型机(新疆大学提供)；微机控制电子万能试验机(济南方辰仪器设备有限公司)；SD大鼠骨髓间充质干细胞由新疆医科大学第一附属医院动物中心提供。

1.4 实验方法

羊椎骨粉的制备：取二三岁羊椎骨，去除皮质及软组织，仅保留椎体松质骨，荡洗后放入体积分数30%双氧水4 ℃浸泡24 h；体积分数75%乙醇冲洗，放入甲醇与氯仿体积比为1：1浸泡液，4 ℃浸泡24 h；体积分数75%乙醇及双氧水重复冲洗，室温(25 ℃)晾干；浸入0.09 mol/L焦磷酸钠溶液，70 ℃水浴12 h，取出自然干燥；放入茂福炉升温至1 100 ℃，持续煅烧1 h，自然冷却后取出。经研磨仪得粉末，过300目标准筛，制得羊椎骨粉。

羊椎骨粉/聚乙烯醇支架、纳米级羟基磷灰石/聚乙烯醇支架、羊椎骨粉/聚乙烯醇无孔骨板的制备：根据课题组前期研究，使用15%聚乙烯醇溶液，称取3组15 g聚乙烯醇颗粒，分别与100 mL超纯水混合，90 ℃水浴加热直至溶解，震荡排除气泡，制得15%聚乙烯醇凝胶。分别将纳米级羟基磷灰石、羊椎骨粉与聚乙烯醇溶液以量筒称量，粉末敦实，按照体积比为1∶1与1.2∶1与1.2∶1混匀，装入3D打印成型机，使用G代码编程及调整打印喷头控制支架孔径，打印出5 mm×5 mm×2 mm的羊椎骨粉/聚乙烯醇支架、纳米级羟基磷灰石/聚乙烯醇支架、羊椎骨粉/聚乙烯醇无孔骨板^[4]。

1.5 主要观察指标

支架超微形态结构观察：各组取5块样品，表面喷金，使用JEOL-JSM-6390LV(日本)扫描电子显微镜观察表面的超微形态结构，并随机选择样品表面不同区域，采集图像。

支架孔隙率测定：孔隙率的测定，根据项目组前期研究者崔杰及许慧芬等^[5-6]的研究，使用Photoshop软件分析法，将羊椎骨粉/聚乙烯醇支架与纳米级羟基磷灰石/聚乙烯醇支架的扫描电镜照片在软件中打开，使用直方图(histogram)计算功能，分别统计样品表面孔隙所占象素数p(pixel)和样品表面所占总象素数P，采用公式= p/P×100%，选取不同视野范围多次统计，取平均值。羊椎骨粉/聚乙烯醇无孔骨板没有明显孔隙，不列入计算范围。

支架吸水率测定：各组取5块样品，用电子天平称得各组材料吸水前质量K0，放入5 mL装有蒸馏水的EP管中，浸泡0.5，1，2，24，48 h，每个时间点取出各组5个样本，吸去表面多余的水分后称质量，即得到支架和内部水分的总质量K1，检测试支架吸水率。吸水率(water absorption，Wa)计公式如下：Wa=[(K1-K0)/K1]×100%。

支架压缩力学性能检测：挑选各组样品中形态标准者，随机选取5块样品，分别平放于微机控制电子万能试验机加载平台上，启动并施加垂直压力，加载速度为1 mm/min，观测其应力-应变实时曲线图，检测其最大形变、最大抗压强度等力学数据。

材料细胞毒性检测：将3组材料清洗、干燥、消毒，移入24孔板中备用。待第2代SD大鼠骨髓间充质干细胞融合至80%时，制备细胞悬液，经细胞计数，以2×10⁷ L^-1的细胞浓度接种于含有3组材料的24孔板中。在接种培养的第1，4，7 天，PBS轻柔漂洗后转移到新24孔板中。避光条件下加入新鲜配制的CCK-8检测液(培养液和CCK-8混合比例为10∶1)，置细胞培养箱中避光孵育2 h，在酶联免疫检测仪450 nm波长下测吸光光度(A值)。

1.6 统计学分析使用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。所得计量资料先行方差齐性检验，再以x(_)±s表示，采用方差进行多组样本均数比较，得出P值以α=0.05为检验水准，判断差异是否有统计学意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

使用3D打印构建个性化组织工程骨，在近几年取得了一系列令人惊喜的成果。研究表明，理想的骨组织工程支架材料应具备以下特性^[7-13]：良好的生物相容性和细胞相容性；体内降解速率合适；表面无细胞毒性，且活性应有利于细胞有效黏附；有高孔隙率的结构以保存和促进细胞功能；有特定的生物活性，能介导细胞间信号传导、诱导新骨形成等。

羊椎骨粉作为天然的骨质材料，具有其他无机材料所不可比拟的生物相容性和骨传导特性^[14]。羊椎骨在新疆地区有广泛来源，特有的地区优势使羊椎骨可作为异种骨支架材料制备的原材料，供骨来源广泛。纳米级羟基磷灰石可作为成骨细胞、血管及神经生长的支架，具备良好的细胞黏附、支架功能，可促进骨组织再生^[15-16]。实验结合地区优势选择了羊椎骨作为原材料，并使用纳米级羟基磷灰石作为对照^[17-18]。经过化学处理脱脂脱蛋白后进行高温煅烧处理^[19-20]，进而经电子显微镜扫描、孔隙率测定、吸水率测定、细胞毒性等方法检测它们的理化性能。

聚乙烯醇水凝胶是一种在组织工程中应用广泛的高分子材料，作为黏结剂无毒且易降解^[21]。聚乙烯醇机械性能良好，吸水量大，生物相容性好，在生物医学领域有广泛应用^[22-32]。

支架材料是否能良好发挥其材料性能，合适的微孔结构关是键。孔隙过大易造成支架力学性不良，难以应用于例如牙槽骨等力学要求较高的功能区域；孔径过小会导致新生细胞及组织难以长入。有学者认为，正常生理骨的骨松质孔径应为200-400 μm，成骨细胞静态时直径应为20 μm左右，附着时直径约30 μm，由此可知成骨细胞迁移的最小孔径为100 μm^[³¹^]。已有研究证实，最小孔径为100-150 µm，即可满足组织再生，并发现支架材料的孔径在300-600 μm间，最有利于新骨长成^[32]；当孔隙率超过30%时，孔隙之间相互连通，新生组织可长入孔内，相互结合，形成新骨，且孔隙率越高，越有利于成骨细胞在支架的黏附^[33]。3D打印较常规方法，能更好满足孔隙之间的相互连通。实验测定羊椎骨粉/聚乙烯醇支架的孔径均在240-600 μm，孔隙率在(49.43± 8.21)%，可实现细胞进入材料并进行黏附生长。

由于颌骨需承担咀嚼力，所以不仅要求支架材料具有一定的孔隙率，也需要材料具有良好的力学性能，且材料应与周围组织的力学性能相似^[34]。实验通过万能力学测试仪测试，发现羊椎骨粉/聚乙烯醇无孔骨板的抗压性能及韧性最好，但由于其内部没有明显孔隙，不利于成骨细胞进入附着，所以不适合作为骨缺损的修复材料。而羊椎骨粉/聚乙烯醇支架不论在型变量还是韧性的对比中，均体现出优势。羊椎骨粉的主要成分为羟基磷灰石及少量的β-磷酸三钙^[35-36]，成分与人骨成分相似，通过与聚乙烯醇复合，提高其力学性能。

细胞生物活性是检测组织工程骨材料是否合适的关键。生物工程材料应用于体内，首先要求材料对机体没有毒性，不能给机体带来额外损害。实验使用的CCK-8法是一种快速高灵敏度的细胞毒性检测方法，对细胞没有杀伤，误差小于传统MTT法。体外实验结果显示羊椎骨粉/聚乙烯醇支架、纳米级羟基磷灰石/聚乙烯醇支架、羊椎骨粉/聚乙烯醇无孔骨板均无急性毒性、无刺激性和无细胞毒性^[37]。可以看出羊椎骨粉经过化学浸泡和物理煅烧后，可彻底消除其抗原性，不会产生免疫排斥反应，细胞相容性和生物安全性好。

综上所述，实验初步验证了3D打印羊椎骨粉/聚乙烯醇支架具有良好的力学性能及生物相容性，临床应用前景广阔，为使用3D打印这项技术重建骨缺损这一新方向奠定了一定的科学基础。3D打印羊椎骨粉/聚乙烯醇支架的物理化学性能符合骨组织工程支架材料的要求，并且优于传统材料，其作为组织工程骨研究中的新亮点，具有巨大的临床应用价值。实验为后期体内降解实验提供了依据，能否通过体内检测，其组织相容性等仍需动物实验来进一步验证。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

3D打印羊椎骨粉/聚乙烯醇支架、纳米级羟基磷灰石/聚乙烯醇支架、羊椎骨粉/聚乙烯醇无孔骨板的性能比较

Performance comparison of 3D printing sheep vertebral bone meal/polyvinyl alcohol scaffold, nano-hydroxyapatite/polyvinyl alcohol scaffold and sheep vertebral bone meal/polyvinyl alcohol nonporous bone plate

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