骨组织工程学通过将多孔形态的三维支架与骨髓间充质干细胞或成骨细胞、成骨诱导因子整合在一起,模拟骨生长的微环境,从而达到刺激骨生成的目的,Hench将其产物称为第3代骨替代物
[4]。
成骨微环境是细胞、细胞外基质、成骨诱导因子相互作用的复杂整体。骨组织工程学的理念是通过尽可能理想化的模拟成骨微环境来制作骨骼替代物,从而达到修复骨缺损,促进骨再生的目的。支架材料及种子细胞的选择在骨组织工程中尤为重要。
通常认为骨折愈合的过程是由多种干细胞共同参与完成的,这些干细胞可以来源于骨髓、骨膜、周边软组织,甚至离骨折区域更远的部位
[5],其中骨髓间充质干细胞在骨折愈合中的作用越来越受到重视。Colnot
[5]通过静脉注射的方式将骨髓间充质干细胞植入大鼠骨折模型中,生物发光检测发现,骨折后第3天就可以在骨髓及骨内膜检测到骨髓间充质干细胞存在。骨髓间充质干细胞目前被作为种子细胞广泛应用于骨组织工程学研究中。骨髓间充质干细胞的供体适宜选取年轻、活力强的个体,因为这类个体的干细胞往往增殖活性更强,且具备更优秀的分化潜能。研究选用了体质量350-400 g、周龄6-8周龄大鼠作为骨髓间充质干细胞的供体,传代过程中估测细胞倍增时间约48 h,增殖状态良好。但当研究中提取的骨髓间充质干细胞传代至第10代后,细胞的老化现象严重,茜素红染色及碱性磷酸酶染色显示其成骨分化能力也显著下降,因此作者认为随着骨髓间充质干细胞传代次数增加,其增殖能力及成骨分化能力逐渐下降。Sachs等
[1]利用大鼠骨髓间充质干细胞作为跟腱组织工程体系的种子细胞,选取了体质量200 g左右的SD大鼠作为种子细胞供体,实验中种子细胞状态良好。结合以往的研究,作者认为研究中选取的大鼠周龄、体质量仍偏大,选取体质量300 g以下、4周龄以下的大鼠可能会获取增殖、分化活性更佳的骨髓间充质干细胞。
研究采用了聚己内酯作为支架的制作,聚己内酯因具有良好的生物相容性、生物降解性、力学性能、药物通过性及易加工等特点,并且该材料在体内降解之后的产物对机体没有毒害作用,已被广泛应用于组织工程生物材料领域,但由于聚己内酯表面缺乏细胞亲和位点且降解速度较慢,因此其临床应用受到一定限制
[6]。理想的骨组织工程支架应当是3D结构,同时具备良好的骨诱导性,这样可促进组织的血管化及新骨生成
[7]。Hollister
[8]提出的支架材料4F准则包含性能诉求和功能诉求。性能诉求是指支架必须具备充足的力学性能,可在组织完成修复前满足日常活动的需求;功能诉求是指支架材料能够通过释放生长因子和提供合适环境来促进组织再生。随着复合支架材料的研究进展,骨细胞外基质的作用越来越受到关注。骨细胞外基质是由骨细胞合成并分泌到胞外,形成分布于细胞表面和细胞之间的复杂网状结构,它支撑并连接了骨骼的整体结构,并是动物体内骨细胞生长、分化、代谢的场所。骨母细胞接受环境产生的刺激信号后开始迁移、增殖并分化成为成骨细胞,成骨细胞最初的功能就是分泌骨细胞外基质,随后这些细胞外基质逐渐矿化以形成新骨。骨细胞外基质在调节成骨细胞的分化及活性中有着十分重要的作用,它的蛋白组成主要包括胶原蛋白和糖蛋白
[9],前者主要包括Ⅰ型胶原和很少量的Ⅴ型胶原;后者是由糖胺聚糖包裹一个核心蛋白分子组成,这种结构在骨组织中随处可见。组织来源的细胞外基质可直接作为优良的天然骨性支架应用到骨组织工程中,但其来源受限,而且具备一定的免疫原性,因此一些骨组织工程研究者对这类细胞外基质支架的临床应用持怀疑态度。而利用直接由自体细胞分泌合成的细胞外基质则更符合骨组织工程学的理念。
2005年Datta等
[10]研究发现,利用Ti金属和骨髓间充质干细胞衍生的细胞外基质构建的骨组织工程支架具备良好的骨诱导能力,在相同的培养时长及培养条件下,Ti-细胞外基质支架上培养的细胞表达的碱性磷酸酶活性显著高于普通Ti支架组,而钙定量分析结果也显示,Ti-细胞外基质支架组的矿化情况显著优于普通Ti支架组。2010年,Liao等
[11]利用大鼠骨髓间充质干细胞体外动态灌注培养制作出了聚己内酯-细胞外基质复合支架,研究利用了相似的方法,利用3D打印技术将支架设计为孔径更加开阔、孔隙率更高的支架,使得培养基更加容易渗透支架内部环境,从而有利于细胞的新陈代谢。
研究中利用扫描电镜观察不同实验时间点支架纤维表面的变化,结果提示,随着诱导培养时间的延长,支架纤维表面的沉积物逐渐增多,羟脯氨酸和糖胺聚糖定量分析结果提示,支架纤维表面的沉积物为胶原、糖蛋白等细胞外基质成分。研究结果与Liao等
[11]学者的结果是一致的,研究中均证实3D环境下,随着培养时间的延长,骨髓间充质干细胞能够分泌更多的细胞外基质。但与其有所区别的是,在实验中采用的培养方式是3D静态细胞培养,以往研究认为,动态培养过程中的液体剪切力,能够促进骨髓间充质干细胞的成骨分化及细胞外基质的分泌,因此,去除了液体剪切力会使得骨髓间充质干细胞衍生的细胞外基质成分减少,为促进骨髓间充质干细胞分泌细胞外基质,作者将骨髓间充质干细胞的种植密度由通常的 25 000-40 000个/cm
2提高到200 000个/cm
2,并且将更换培养液的频率调整为12 h/次,但在实验中测得的细胞外基质含量仍低于动态培养研究中报道的数据。
为检测细胞外基质复合支架的骨诱导能力,再次将骨髓间充质干细胞以同样的密度种植到复合支架上,并且利用成骨诱导培养液在完全相同的培养条件下进行诱导培养,在培养结束后,进行样本碱性磷酸酶活性检测、钙定量分析及茜素红染色,并与普通聚己内酯支架组的数据及染色结果进行比对。选取碱性磷酸酶活性及钙定量分析分别作为成骨早期及后期的定量分析指标,实验中没有探测到碱性磷酸酶活性的峰值。但在 Liao等
[11]的研究中,碱性磷酸酶活性值在PE4组(普通聚己内酯支架组培养4 d后脱细胞所得细胞外基质复合支架)已比普通聚己内酯表现出了明显的升高,而在研究中,BE1组碱性磷酸酶活性值与普通聚己内酯支架并未表现出显著统计学差异,这可能与动态培养所得的细胞外基质产量及成熟度更高有关。钙定量分析及茜素红染色的结果也进一步证实了细胞外基质的骨诱导作用,在整个实验过程中,并未出现细胞外基质产量及成熟度的峰值,结合文献分析,认为通过延长培养时间、采用持续动态灌注培养等方式,能够进一步促进骨细胞外基质的分泌及成熟。 Liao等
[11]在研究中利用DNA总量测定的方式估算细胞计数,发现普通聚己内酯支架组的DNA总量在4-8 d时间段内呈现上升趋势,培养至第8天的DNA总量超过其他所有样本,而细胞外基质复合支架组培养至16 d后,各组之间的DNA总量没有显著统计学差异。作者采用同样的方法来评估骨髓间充质干细胞增殖的情况,结果提示各组间DNA总量没有显著统计学差异,但认为由此不能得出细胞外基质不具备促细胞增殖作用的结论,考虑这是由于成骨诱导培养条件下细胞的增殖受到抑制,同时在研究中,为获取足量的细胞外基质成分,将骨髓间充质干细胞的种植密度提高为200 000个/cm
2,使得细胞之间产生了接触抑制,进一步限制了细胞的分裂增殖。
研究存在一些不足之处。首先,研究采用的聚己内酯支架孔径均为300 μm,没有设立不同孔径及孔隙率的支架进行对比,因此无法观察孔径及孔隙率变化对细胞外基质产量及成熟度的影响;其次,采用的是体外3D培养的方式,并没有进行相应的体内实验,因此细胞外基质复合支架的骨重建性能需要体内实验进一步证实,作者认为可以利用大鼠的颅骨缺损模型完善体内实验;第三,研究中支架-细胞共培养的时长设定为3周,相对于骨髓间充质干细胞成骨分化的需要时间而言相对较短,因此在培养过程中,碱性磷酸酶活性并没有观察到峰值,同时钙定量分析及茜素红染色的结果均提示矿化结节的生成量偏低,这一点可以通过延长培养时间弥补,但由于静态培养过程中代谢产物沉积及培养液成分消耗等因素存在,样本感染的风险可能会升高,同时已经有研究证实,骨髓间充质干细胞诱导时间过长会导致细胞恶性变,这些都需要研究者保持警惕;第四,细胞外基质复合支架的成骨诱导性能虽然在研究中得到了证实,但作为对照组的聚己内酯支架本身就不具备骨诱导性能,由于受到实验经费及时间的限制,并没有设立具备不同骨诱导性能的支架组作为对照。这些均可以在以后的研究中进一步完善。