灌胃给予六味地黄丸后椎间盘退变组织蛋白多糖成分的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.42.006

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
椎间盘退变：椎间盘退变所引起的椎间盘源性腰痛已成为社会上常见的多发病，并常常引起复杂的腰椎病变。目前临床上针对治疗椎间盘退变的治疗方法尚存在局限性，且疗效并不尽如人意。因此利用中医中药治疗不良反应小、成本低、疗效高的特点，治疗椎间盘退变的已越来越体现其自身特点及优势，具有积极的临床意义。
蛋白多糖：蛋白多糖是维持椎间盘的正常结构、代谢及生物力学性能的基础结构。其中主要含量糖胺多糖反映了椎间盘的生物功能。糖胺多糖中含有硫酸软骨素、硫酸角质素、透明质酸，其含量的改变对椎间盘的结构和生物力学性能有着重要影响。

摘要
背景：蛋白多糖、硫酸软骨素、硫酸角质素、透明质酸均是维持椎间盘正常结构的重要物质，影响整个椎间盘的生理功能。
目的：观察六味地黄丸对兔椎间盘退变模型椎间盘蛋白多糖成分的影响，探讨六味地黄丸防治椎间盘退变的疗效。
方法：将80只新西兰兔随机分为六味地黄丸组、模型组、假手术组、空白对照组，每组20只。模型组、六味地黄丸组予建立椎间盘退变动物模型；假手术组行相同手术入路进入腰椎，再依次缝合组织；六味地黄丸组给予六味地黄胶囊混悬液10 mg/kg灌胃，1次/d；模型组、假手术组、空白对照组灌予等量生理盐水，1次/d，自然喂养。于2，4，6，8周后每个时间点处死动物，每次每组处死5只。留取椎间盘标本，测量椎间盘细胞蛋白多糖成分。
结果与结论：随着给药时间的延长，六味地黄丸能上调椎间盘退变模型中糖胺多糖含量、硫酸软骨素/硫酸角质素比值及透明质酸含量，从而稳定蛋白多糖含量，在一定程度上延缓椎间盘的退变。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-8685-7771(王乐)

关键词: 组织构建, 软骨组织工程, 椎间盘退变, 蛋白多糖, 糖胺多糖, 硫酸软骨素, 硫酸角质素, 透明质酸, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Proteoglycan, chondroitin sulfate and keratan sulfate, and hyaluronic acid are important substances in the maintenance of intervertebral discs of normal structure. They impact the physiological function of intervertebral disc.
OBJECTIVE: To observe the influence of Liuwei Dihuang Wan on proteoglycan in rabbit models of intervertebral disc degeneration, and to study the efficacy of Liuwei Dihuang Wan on prevention and treatment of intervertebral disc degeneration.
METHODS: 80 New Zealand rabbits were randomly divided into Liuwei Dihuang Wan group, model group, sham surgery group and blank control group (n=20 per group). Animal models of intervertebral disc degeneration were established in the model and Liuwei Dihuang Wan groups. In the sham surgery group, surgery via the same approach to expose the lumbar spine was conducted followed by layer-by-layer suturing. In the Liuwei Dihuang Wan group, rabbits were given 10 mg/kg Liuwei Dihuang Wan by lavage, once a day. In the model group, sham surgery group and blank control group, rabbits were given an equal volume of physiological saline, once a day, by natural feeding. At 2, 4, 6 and 8 weeks, five rabbits from each group were sacrificed, and intervertebral disc specimens were taken to measure proteoglycan components in the intervertebral disc.
RESULTS AND CONCLUSION: With the extension of feeding time, Liuwei Dihuang Wan could increase sugar amino polysaccharide content, chondroitin sulfate/acid ratio of keratin, and hyaluronic acid content in the intervertebral disc degeneration model, and stabilized the proteoglycan content. Thus, it delayed the degeneration of the intervertebral disc to a certain extent.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Animal, Models, Intervertebral Disk Degeneration, Chondroitin Sulfates, Hyaluronic Acid, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 1

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引言

腰痛是现代脊柱疾病中最为常见的症状之一。有调查显示，国内大多数人都经历过腰痛，并已成为常见病、多发病^[1]，并由此导致巨大的经济负担与社会负担^[2]。现代人由于长久坐立、坐姿不正等等原因，导致遭受腰痛的人越来越多^[3-5]。

如今椎间盘源性腰痛逐渐被作为一种独立的疾病用于临床诊断，并常常参与构成一些复杂的腰椎疾病的临床表现，因此，深入研究椎间盘源性腰痛的病理机制及其防治措施有着重大的现实意义^[6]。椎间盘退变是导致椎间盘源性腰痛的主要原因^[7]。现有研究提示椎间盘内的蛋白多糖是影响椎间盘结构和功能的主要成分，其改变直接导致髓核的结构和组成发生改变，进而椎间盘组织发生退变^[8]。在临床上往往表现为椎管狭窄、脊柱节段不稳、椎间盘突出等病症，椎间盘退变据认为是腰椎病发生发展的根本原因，并严重影响患者的生活质量^[9-11]。

中医药在世界医学发展的过程中已经越来越体现其自身特点及优势。在防治腰痛的疾病中，有着不良反应小、成本低、疗效高的特点。中医学认为，肝主筋，肾主骨，肾虚会引起腰府失养，再加上外伤、受到风寒湿邪等诱因最终导致经络阻滞，气血凝滞不通，引发腰痛，腰椎间盘退变性疾病应属于中医学的“腰痛”、“痹证”范畴。腰痛的主要病因病机为肝肾亏虚，气血不足，劳作损伤致瘀血闭阻经络，气血运行不畅，中医治法在于以补益肝肾为主。

六味地黄丸为补肝肾名方，在临床上已取得了良好的疗效。实验通过建立椎间盘退变动物模型，探讨六味地黄丸对椎间盘蛋白多糖成分的变化，从细胞和分子水平阐明六味地黄丸用于防治椎间盘源性腰痛及椎间盘退变相关性疾病的科学理论依据，为中医药防治椎间盘源性腰痛方面的研究提供实验依据，具有鲜明的中西医结合特色。同时有利于六味地黄丸的在临床推广应用，早期干预寻求有效的治疗方法，逆转或阻断病情的发展，从而减轻腰痛患者的痛苦，具有积极的临床意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机分组设计，对比观察实验。

1.2 时间及地点动物喂养于2014年3至12月在湖南中医药大学动物实验室完成，酶联免疫法检测、放射免疫法检测在基尔顿生物科技(上海)有限公司完成。

1.3 材料

实验动物：6月龄清洁级新西兰兔80只，雌雄各半，体质量2.3-3.5 kg，由湖南中医药大学动物实验室提供，实验动物质量合格许可证号：SCXK(湘)2009-0012；动物设施使用证明许可证号：SYXK(湘)2013-0005。

实验用药：六味地黄胶囊(国药准字号Z22024016)购自长春经开药业有限公司，其成分为熟地黄、山萸肉、山药、牡丹皮、茯苓、泽泻。

1.4 实验方法

动物分组：选取6月龄清洁级新西兰兔80只，按随机数字表法分为六味地黄丸组、模型组、假手术组、空白对照组，每组20只。

建立椎间盘退变模型：模型组、六味地黄丸组参照胡绪江等^[12-13]的方法建立椎间盘退变动物模型。全麻后消毒铺巾，经左腹前外侧入路依次切开皮肤、腹外斜肌、腹内斜肌、腹横肌，沿腰大肌肌间隙推开后腹膜和大血管，暴露L_4/5和L_5/6椎间隙，用10 μL的微量注射器随机选择椎间盘注射入10 mg/L肿瘤坏死因子α溶液1 μL，用咬骨钳咬断该椎间盘邻近椎体的横突作为标记。后予生理盐水冲洗，依层次缝合，放回笼中。对假手术组行相同手术入路显露腰椎，再依次缝合组织。切口予络合碘涂擦消毒。术后给予青霉素400×10⁴ U肌注防感染，1次/d，连续使用3 d。假手术组行相同手术入路显露腰椎，再依次缝合组织。空白对照组不予任何手术干预。

灌胃剂量：将六味地黄胶囊溶于生理盐水后，六味地黄丸组给予六味地黄胶囊混悬液10 mg/kg灌胃， 1次/d；模型组、假手术组、空白对照组灌予等量生理盐水，1次/d，自然喂养。于2，4，6，8周后每个时间点处死动物，每次每组处死5只。灌胃剂量根据人与动物体表面积换算公式：D1∶D2=R1∶R2求得D2为所求剂量，D1为已知剂量，R1为相应已知值，R2为待求剂量D2相应动物体表面积换算比值。本实验R1为346.68，R2为37.71。

灌胃操作：两人合作，一人左手紧握兔双耳固定头部，右手抓住两前肢。另一人将木制开口器横放于兔口中，压在舌头上面，取8号导尿管由开口器中部小孔插入食管约15 cm，为避免误入气管，可将导尿管外口浸入水中，不见气泡表示插入胃中，然后注入药液。

标本采集：采用空气栓塞法处死动物，于2，4，6，8周后每个时间点处死动物，每次每组处死5只。将兔置于操作台，切开背部皮肤，逐层分离肌肉，显露脊柱后，用咬骨钳取出L₃-L₇椎体，剥离附着的肌肉韧带，找到缺少横突所对应的椎间盘，观察退变后变化并拍照，可以明显看到造模椎间盘的注射肿瘤坏死因子处有骨赘形成(见图1)。留取椎间盘标本，将椎间盘放入冻存管中，放入-80 ℃冰箱冻存待测。

酶联免疫法检测：取标本后第2天，标准品稀释并加样于酶标板孔底部，温育后配液洗涤30倍，重复5次；每孔加入酶标试剂50 μL，在反复洗涤5次后加入显色剂显色；加入终止液15 min以内测定吸光度(A)值，带入方程式计算出样品浓度。

放射免疫法检测：取标本后第2天，静脉血分离血清，48 h内测量可在2-8 ℃密闭保存；超过48 h-20 ℃密闭冷冻保存，至少稳定2个月，但要避免反复冻融。先平衡到室温，取若干聚苯乙烯试管进行加样，加样时摇匀试剂以避免产生泡沫。联机处理：由电脑自动处理得出结果。采用四参数法数据处理模式。

1.5 主要观察指标椎间盘终板糖胺多糖总量、硫酸软骨素和硫酸角质素比值、透明质酸含量。

1.6 统计学分析实验数据均用x(_)±s表示，全部实验均采用SPSS 17.0统计学软件进行分析，满足正态性和方差齐性，用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用LSD检验；不满足正态性和方差齐性，采用秩和检验；检验水准取α=0.05，P < 0.05认为差异有显著性意义。

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讨论

蛋白多糖能够维持椎间盘的正常结构、代谢及生物力学性能，是主要生化基础之一，而且对调节营养物质在椎间盘组织中的分布和转运有一定作用^[14-15]。蛋白多糖个体由核心蛋白和糖胺多糖链组成，糖胺多糖水平的变化可反映蛋白多糖的水平变化，其主要结构包括硫酸软骨素、硫酸角质素、透明质酸。透明质酸链连接着超过100个的蛋白聚糖单体，这种蛋白连接非常稳定^[16]。其核心由3部分组成，1个硫酸角质素，2个硫酸软骨素，他们通过重复的糖链连接^[17]。硫酸软骨素与硫酸角质素的独特结构能使椎间盘内形成高渗透压从而吸附大量的水分，以维持椎间盘的生物力学特征^[18-19]。硫酸软骨素比硫酸角质素可吸附更多的水分^[20-21]。生命早期，大多是硫酸软骨素，而硫酸角质素较少，随着年龄增长，硫酸角质素逐渐成为主要成分^[22]。聚合体含量的变化是椎间盘退变的早期过程^[23-25]。新生儿椎间盘中聚合体比例较高，之后在逐渐成长中由于降解酶活性升高，聚合体被分解成为较小的蛋白多糖分子，主要分布在细胞间质中^[26-27]。

实验研究发现，由于退变的椎间盘内蛋白多糖的含量降低，可以将蛋白多糖含量作为椎间盘退变的指标之一^[28]，同时，组成成分(硫酸软骨素/硫酸角质素)明显下降，进一步导致其结构和生物力学性能改变^[29-30]。随着蛋白聚糖的丢失，椎间盘渗透压下降^[31]，椎间盘在负重时很难维持水合作用，因此水分降低、高度下降、硬度降低。这些变化使椎间盘变性更大，因而对脊柱结构产生重要影响^[32]。

文章结果表明，模型组糖胺多糖含量减低、透明质酸含量降低、硫酸软骨素/硫酸角质素比值降低，与假手术组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，说明椎间盘退变的造模成功。而经过六味地黄胶囊混悬液灌胃后的糖胺多糖、透明质酸、硫酸软骨素硫酸角质素比值的下降趋势减缓，表明六味地黄丸对于防治椎间盘退变是有积极作用的。

中医学认为，肾虚会引起腰府失养，再加上外伤、受到风寒湿邪等诱因最终导致经络阻滞，气血凝滞不通，引发腰痛，腰椎间盘退变性疾病应属于中医学的“腰痛”、“痹证”范畴^[33]。对于腰痛的治疗，祖国医学已经积累了长期的经验^[34]。认为腰痛虽属实证，但往往在肾虚的基础上感受外邪。肝主筋，肾主骨，椎间盘属于中医“筋”的范畴。腰痛发生于下腰部，腰为肾之府，因而，腰痛多与肾虚相关^[35]。《证治准绳》中记载，腰痛“有风、有湿、有寒、有热、有挫闪、有瘀血、有滞气、有痰积，皆标也；肾虚，其本也”。《诸病源候论•腰脚疼痛候》记载，“肾气不足，受风邪之所为也，劳则伤肾，虚则受于风冷，风冷与正气交争，故腰脚痛”。这提示肝肾亏虚，气血不足，劳作损伤以致瘀血痹阻经络，气血运行不畅为椎间盘退行性变的主要病因病机^[36]。因此，中医治疗椎间盘退变及其并发症以补益肝肾为主，辅以补脾益气、活血通络等治法^[37-38]。中药制剂副作用小、成本低，能相对减轻病人的痛苦，治疗效果能得到肯定。

以补益肝肾为原则，发挥中医的优势，目前许多研究者从中医治法着手，对椎间盘退变进行了大量的实验和临床研究。有研究表明，益气化瘀中药结合骨髓间充质干细胞移植的治法可以增加椎间盘营养供应，减少基质降解及细胞凋亡，在一定程度上对椎间盘退变的治疗达到良好效果^[39]。张华^[40]认为补肾活血舒筋方可以增强机体免疫能力，改善人体代谢功能，同时延缓椎间盘退变，还能促进组织的修复和再生，有利于骨、关节及周围软组织与神经的功能恢复。椎间盘退变的根本病机是肾气亏虚，以“痹伤”为因，以“虚”为本，故治宜补肾壮腰，辅以活血通络。有研究者用由肉苁蓉、熟地、葛根、黄芪、泽泻、牛膝、地龙、鸡血藤、丹参、川芎、白芍、当归、独活、女贞子、骨碎补、红花、秦艽等组成补肾活血方灌胃治疗椎间盘退变模型，结果显示退变的椎间盘模型中成纤维细胞增多，促使合成的胶原纤维增多，延缓了椎间盘的退变^[41]。

补肾是在祖国医学长期发展过程中，历代医家治疗腰痛的基本方法之一。六味地黄丸为补肝肾名方，出自宋•钱乙《小儿药证直决》。六味地黄丸由熟地黄、山药、山萸肉、泽泻、丹皮、茯苓等组成，具有滋阴补肾、填精益髓的功效。临床用于肝肾阴虚，腰膝酸软，头晕目眩，耳鸣耳聋，遗精，盗汗，消渴，骨蒸潮热，手足心热，口燥咽干，牙齿动摇，足跟作痛，小便淋沥，以及小儿囟门不合，舌红少苔，脉沉细数。有降血糖、降血压、降血脂、增强免疫功能、延缓衰老及抗肿瘤，保肝、调节钙磷代谢、增强性功能，减轻耳中毒等作用，对泌尿生殖系统、内分泌系统及心血管系统有明显影响^[42-43]。王秋娟等^[44]研究六味地黄丸汤剂及三补、三泄、一补、一泄组成的5个拆方煎剂对正常小鼠耐缺氧及实验性高血脂小鼠血脂、肝中脂肪的影响，发现全方对于耐缺氧的作用优于各种组合。全方、三补、拆方均能明显降低肝脏中脂肪的含量，三泄和三补何用效果更佳。六味地黄丸中，熟地黄滋阴填精为主；山药健脾胃，养肺肾；山萸肉酸温收敛，养肝涩精；泽泻祛肾之湿浊，使熟地滋而不腻；丹皮清泻肝火，并抑制山萸肉之温；茯苓渗湿，以助山药健脾，合为三补三泻，补中寓泻，补泻结合，以补为主。

作者既往研究的实验发现六味地黄丸可以通过减少髓核细胞凋亡，抑制JNK与p38MAPK通路的全面激活，保护髓核细胞，使细胞稳定，对椎间盘退变有明显的防治作用。临床上通过使用补益肝肾的六味地黄丸治疗椎间盘退变引起的腰痛也可以取得较好的效果^[45]。

实验通过研究六味地黄丸对兔椎间盘退变模型椎间盘细胞外基质组分的影响，证实了六味地黄丸能延缓椎间盘退变模型中糖胺多糖含量、硫酸软骨素/硫酸角质素比值、透明质酸含量的下降，稳定了蛋白多糖，在一定程度上延缓椎间盘的退变。六味地黄丸对改善因椎间盘退变引起的腰痛可能有缓解作用，其作用机制还有待今后进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程