正交法筛选组穴对脑缺血再灌注损伤模型大鼠细胞外信号调节激酶信号转导通路的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.40.004

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (40): 5953-5958.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.40.004

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正交法筛选组穴对脑缺血再灌注损伤模型大鼠细胞外信号调节激酶信号转导通路的影响

冯毅慧¹，朱志华¹，吴春晓²，周国平²

¹广西中医药大学附属瑞康医院针灸科，广西壮族自治区南宁市 530011；²南方医科大学，广东省广州市 510515

修回日期:2016-08-25 出版日期:2016-09-30 发布日期:2016-09-30
通讯作者: 周国平，主任医师，南方医科大学，广东省广州市 510515
作者简介:冯毅慧，女，1982年生，湖南中医药大学博士，主治医师，主要从事针刺作用机制研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81173355)

Effects of electroacupuncture at points selected by orthogonal experiment on the extracellular signal regulated kinase signal pathway in a rat model of cerebral ischenia-reperfusion injury

Feng Yi-hui¹, Zhu Zhi-hua¹, Wu Chun-xiao², Zhou Guo-ping²

¹Department of Acupuncture, Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; ²Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China

Revised:2016-08-25 Online:2016-09-30 Published:2016-09-30
Contact: Zhou Guo-ping, Chief physician, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
About author:Feng Yi-hui, M.D., Attending physician, Department of Acupuncture, Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81173355

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

缺血再灌注损伤：脑组织缺血所引起的组织损伤是致死性疾病的主要原因。缺血再灌注损伤时间越长，兴奋性递质含量越低，脑组织超微结构改变越明显：线粒体肿胀，有钙盐沉积，并可见线粒体嵴断裂、核染色质凝集、内质网高度肿胀，结构明显破坏、星形细胞肿胀，Nissl体完整性破坏、胶质细胞、血管内皮细胞肿胀，周围间隙增大并有淡红色水肿液、白质纤维间隙疏松，血管内由微血栓、髓鞘分层变性，呈现不可逆损伤。

信号转导通路：在细胞中，各种信号转导分子相互识别、相互作用，将信号进行转换和传递，构成信号转导通路。当外界环境变化时，单细胞生物可以直接做出反应，多细胞生物则通过复杂的信号传递系统来传递信息，从而调控机体活动。传导方式包括相邻细胞直接接触、细胞分泌各种化学物质来调节其他细胞代谢和功能。在脑缺血再灌注损伤中，信号通路是近年来研究的热点之一，丝裂原活化蛋白激酶级联反应是近年发现的细胞质和细胞核联系的枢纽，其在接受不同通路的上游信号后，激发即早基因和转录因子的表达和活化，并通过相应的靶基因、靶蛋白等的表达与合成来完成对各种胞外刺激的反应，在细胞凋亡的信号传导方面起着关键性的作用。

摘要

背景：既往电针治疗脑缺血再灌注损伤观察的针刺穴位搭配较少。

目的：探讨电针正交实验所选组穴对脑缺血再灌注损伤后细胞外信号调节激酶信号通路的影响。

方法：150只SD大鼠随机等分为5组，假手术组只暴露大脑中动脉；模型组及正交1，2，3号组建立脑缺血再灌注模型。正交1，2，3号组采用正交法筛选的穴位组合进行电针刺激。正交1号组为百会、曲池、足三里、尺泽，正交2号组为百会、足三里、尺泽、三阴交，正交3号组为合谷、足三里、尺泽、三阴交。

结果与结论：与模型组相比，正交1，2，3号组大鼠神经功能缺损评分降低，脑梗死面积缩小，脑缺血区微血管密度数量及缺血侧皮质和海马CA1区中磷酸化细胞外信号调节激酶表达水平增加，且正交3号组变化最为显著。提示电针经正交法筛选的合谷、足三里、尺泽、三阴交能有效减少脑缺血再灌注大鼠的梗死面积，且该效应可能与其调节受损脑组织中细胞外信号调节激酶信号通路密切相关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

ORCID: 0000-0002-5496-3342(冯毅慧)

关键词: 实验动物, 神经损伤与修复动物模型, 电针, 脑缺血再灌注, 正交实验, 细胞外信号调节激酶信号通路, 微血管密度, 细胞凋亡, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Acupuncture point matching is little reported in the electroacupuncture for cerebral ischemia-reperfusion injury.

OBJECTIVE: To explore the influence of electroacupuncture acupoints selected by orthogonal experiment on rats with cerebral ischemia reperfusion and extracellular signal regulated kinase (ERK) signal pathway.

METHODS: 150 Sprague-Dawley rats were randomly divided into five groups: sham operation group rats were exposed the middle cerebral artery only; models of cerebral ischemia reperfusion were established in the rats in model and orthogonal groups. Then rats in the orthogonal groups 1 (Baihui (DU 20), Quchi (LI 11), Zusanli (ST 36), and Chize (LU 5)), 2 (Baihui (DU 20), Zusanli (ST 36), Chize (LU 5), and Sanyinjiao (SP 6)) and 3 (Hegu (LI 4), Zusanli (ST 36), Chize (LU 5) and Sanyinjiao (SP 6)) were given electroacupuncture at acupoints selected by orthogonal experiment, respectively.

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the model group, in all orthogonal groups, the neurological function deficit scores were decreased, infarct volume was smaller, the number of microvessel density in the ischemia region and the p-ERK expression level in the cortex and hippocampal CA1 region of ischemic hemisphere were increased, and significant changes were found in the orthogonal group 3. These findings indicate that electroacupuncture at points of Hegu (LI 4), Zusanli (ST 36), Chize (LU 5) and Sanyinjiao (SP 6) selected by orthogonal experiment can significantly reduce the infarct volume of cerebral ischemia-reperfusion injury in rats possibly by regulating the ERK signaling pathway.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

Key words: Electroacupuncture, Brain Ischemia, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

冯毅慧，朱志华，吴春晓，周国平. 正交法筛选组穴对脑缺血再灌注损伤模型大鼠细胞外信号调节激酶信号转导通路的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(40): 5953-5958.

Feng Yi-hui, Zhu Zhi-hua, Wu Chun-xiao, Zhou Guo-ping. Effects of electroacupuncture at points selected by orthogonal experiment on the extracellular signal regulated kinase signal pathway in a rat model of cerebral ischenia-reperfusion injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(40): 5953-5958.

图/表（结果） 3

参考文献

[1] Schulz JB, Weller M, Moskowitz MA. Caspases as treatment targets in stroke and neurodegenerative diseases. Ann Neurol. 1999;45(4):421-429.
[2] 于淼,高维娟,钱涛.脑缺血/再灌注信号转导通路的研究进展[J].承德医学院学报,2010,27(1):65-67.
[3] 张海湃,苏思骢,周垚,等.近5年电针治疗脑缺血再灌注损伤的实验研究进展[J].辽宁中医杂志,2014,41(8): 1780-1781.
[4] Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 1989;20(1):84-91.
[5] 李辞蓉,华兴邦,周浩良,等.豚鼠针灸穴位图谱的研制[J].上海针炙杂志,1992(2):28-30.
[6] 李忠仁.实验针灸学[M].北京:中国中医药出版社,2003.
[7] Weidner N. Current pathologic methods for measuring intratumoral microvessel density within breast carcinoma and other solid tumors. Breast Cancer Res Treat. 1995;36(2):169-180.
[8] 朱惠斌,陈懿,谭琥,等.脑泰方提取物对局灶性脑缺血大鼠CD34表达的影响[J]中药新药与临床药理,2011,22(2): 141-144.
[9] 曹莹,戴建武,胡志兵,等.依达拉奉联合电刺激小脑顶核治疗急性脑梗死疗效观察[J].中国医药导报,2009,6(16): 100-101.
[10] Beretta S, Pastori C, Sala G, et al. Acute lipophilicity-dependent effect of intravascular simvastatin in the early phase of focal cerebral ischemia. Neuropharmacology. 2011;60(6):878-885.
[11] Jin H, Hwang SK, Yu K, et al. A high inorganic phosphate diet perturbs brain growth, alters Akt-ERK signaling, and results in changes in cap-dependent translation. Toxicol Sci. 2006;90(1):221-229.
[12] Shioda N, Han F, Fukunaga K. Role of Akt and ERK signaling in the neurogenesis following brain ischemia. Int Rev Neurobiol. 2009;85:375-387.
[13] 田北方.MAPK级联途径在脑发育与损伤修复中的作用[J].国外医学:生理病理科学与临床分册,2000,20(3): 184-186.

引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年7月至2015年3月在广西医科大学动物实验中心完成。

1.3 材料

实验动物：选取清洁级成年健康雄性SD大鼠150只，鼠龄9周，体质量260-300 g，由南方医科大学实验动物中心提供，许可证号SCXK(粤)2011-0015，饲喂以标准育成饲料，自由饮水。动物于实验前适应环境一周，控制室温20-22 ℃，相对湿度65%-70%。实验前大鼠在安静环境下饲养24 h以上，术前禁食12 h，不禁水。

主要试剂及仪器：蛋白酶K工作液购自上海翊圣生物科技有限公司；DAPI由北京索莱宝科技有限公司提供；EDTA抗原修复缓冲液购自上海鲁汶生物科技有限公司；牛血清白蛋白由南京安培化工科技有限公司提供；TTC，二甲基亚砜购自Sigma公司；免疫组化试剂盒，DAB显色试剂的生产厂家是北京中杉金桥生物技术有限公司；TUNEL检测试剂盒由凯基生物有限公司提供；毫针(直径0.3×25 mm)购自苏州天协针灸器械有限公司；CJ-2F型医用净化工作台购自苏州苏洁净化设备有限公司；AEU-210电子天平由厦门欣锐仪器仪表有限公司提供；-20 ℃低温冰箱由北京福意电器有限公司提供；电热恒温干燥箱购自上海丙林电子科技有限公司；DSC-RX100M2数码相机购自索尼(中国)有限公司；Bx-70显微成像系统购自上海普赫光电科技有限公司；Leica Qwin图像信号采集与分析系统、Image-ProPlus图像分析处理系统购自徕卡仪器有限公司；XS-200型双目显微镜由上海彼爱姆(BM)光学仪器制造有限公司提供；英迪KWD-808I全能脉冲电子针灸电疗仪的生产厂家是常州英迪电子医疗器械有限公司。

1.4 方法

1.4.1 正交配穴设计按照张海湃等^[3]归纳总结近5年治疗缺血再灌注损伤针刺治疗的有效穴位：百会、水沟、大椎、足三里、曲池、少海、尺泽、合谷、三阴交9个穴位，将每一个穴位作为一个因素，每个因素设/10和/00两个水平(/10为有此穴位，/00为无此穴位)，选择L₁₂(2¹¹)正交表，共得12个配方。

根据醒脑开窍、活血通络治则，选取百会、曲池、足三里、尺泽配对；百会、足三里、尺泽、三阴交配对；三阴交、足三里、尺泽、合谷配对。

1.4.2 动物分组 150只SD大鼠随机等分为5组：假手术组、模型组及正交1，2，3号组。

1.4.3 模型制备假手术组只做手术暴露大脑中动脉，不予线栓，缝合伤口。其他各组采用改良Longa等^[4]方法，制作大鼠脑缺血再灌注模型。术后待大鼠生命体征稳定后，按照Longa五级4分法进行评分：0分：无神经功能缺失症状；1分：轻度局灶神经功能缺失(不能完全伸展左侧前肢)；2分：中度局灶神经功能缺失(向左侧转圈)；3分：重度神经功能缺失(向左侧倾斜)；4分：不能自发行走，意识水平降低。评分为1-3分大鼠，造模成功纳入实验。成模后大鼠在室温20 ℃环境下单笼饲养，自由进食、水，必要时滴管喂水。大鼠解剖后，取全脑可见脑梗死灶位于颞叶皮质区，与大脑中动脉支配的脑供血区域一致，说明实验的模型制作成功。取脑时发现有明显蛛网膜下腔出血者，剔除出实验。

1.4.4 穴位定位选取大鼠百会、及左侧曲池、合谷、尺泽、三阴交、足三里为电针穴位^[5]；利用华佗牌不锈钢银针(直径为0.38 mm，长度为1寸)取“百会”穴斜刺入头皮1寸，直刺“合谷”、“尺泽”、“三阴交”、“足三里”穴2 mm，通电刺激，每组通电方式均要形成环路，电针治疗仪采用频率为2/20 Hz，波型为疏密波，刺激时间为30 min，强度以大鼠肢体轻度颤动为度^[6]，正交1，2，3号组大鼠按同一时间点每天电针1次，直至取材。

1.4.5 取材于再灌注后2 h，6 h，1 d，3 d及1周时将大鼠经水合氯醛麻醉后开胸，先后用生理盐水、预冷的 40 g/L多聚甲醛固定液灌流取出全脑，石蜡包埋，切片。

1.4.6 微血管密度计数采用SP法染色，使用血管内皮细胞标志物鼠抗人CD34单克隆抗体进行检测，阴性对照为PBS。参照Weidner^[7]的方法并稍加改进：在100倍镜下寻找微血管高密度区，在400高倍镜下计数5个视野中微血管数量，取平均值。每个被染成棕黄色的内皮细胞或内皮细胞簇(不论有无管腔)，只要独立于周围血管或其他结缔组织的就可被判定为1个微血管；呈管状者只要结构不连续，其分支结构也作为1个微血管计算分辨不清或染色模糊的细胞不计数；肌性厚壁血管不计数；管腔大于50 μm或直径大于8个红细胞大小的血管也不计数^[8]。

1.4.7 脑梗死体积的测定将储存于-80 ℃冰箱新鲜脑组织置于-20 ℃冰箱保存20 min后，再用pH 7.2的PBS配置2% TTC溶液50 mL，在37 ℃水浴锅中避光预热；用刀片自距大脑额部2 mm处沿冠状面将脑组织切成2 mm厚薄片，每个脑组织切成5片薄片；在暗室中将脑组织切片置2%TTC中，放入37 ℃水浴锅中30 min，每5 min翻动脑片，使脑组织均匀完全接触到染色液；染色完成后，梗死部分被染成白色，未梗死区域被染成红色，40 g/L多聚甲酸磷酸盐缓冲液(pH 7.2)固定过夜；将染色后的脑组织切片整齐的置于带有刻度的标尺上，用高分辨率数码相机拍照输入计算机，应用Image- ProPlus图像分析处理系统计算每片脑组织脑梗死体积(梗死体积=每个脑片梗死面积×2 mm)，每个脑组织梗死的总体积由连续切割的5片脑组织的梗死体积相加所得。

1.4.8 磷酸化细胞外信号调节激酶(phospho- ertracellular-singnal regulated kinase，p-ERK)表达水平的检测采用免疫组化检测p-ERK表达水平，将石蜡切片脱蜡至水：二甲苯孵育，梯度乙醇复水，蒸馏水洗。EDTA抗原修复缓冲液(pH 9.0)微波炉抗原修复。PBS(pH 7.4)洗，在体积分数3%过氧化氢溶液室温避光孵育20 min，PBS(pH 7.4)洗。一抗(1∶200)湿盒内4 ℃孵育过夜。PBS(pH 7.4)洗。滴加HRP标记的二抗室温孵育50 min。PBS(pH 7.4)洗。DAB显色，自来水冲洗终止反应。Harris苏木精复染3 min左右，自来水洗，体积分数1%的盐酸乙醇分化数秒，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。将切片依次放入梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。分别在大脑缺血侧皮质及海马CA1区随机取5个视野，计算平均灰度值。

1.5 主要观察指标 ①大鼠神经功能评分；②脑梗死面积；③p-ERK表达水平；④微血管密度。

1.6 统计学分析 数据均用x(_)±s表示，应用SPSS 16.0版统计软件处理，统计分析采用单因素方差分析，多组间进一步比较采用LSD检验，相关分析采用Spearman相关分析，检验水准a=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

针刺作为治疗脑缺血再灌注损伤疾病的一种非药物治疗手段，可有效地改善脑缺血的症状及预后^[9]。实验采用正交实验对近年来报道较为有效的穴位，在中医基础理论的指导下，重组优化得到的3号组穴配方——合谷、尺泽、足三里及三阴交，是手阳明和手太阴相配，足阳明和足太阴相配，取其气血阴阳同补之意，迎合表里配穴法，彰显针灸辩证论治的优势。四穴相配可起到醒脑开窍、舒经活络、平肝熄风、祛瘀化痰的作用，是脑卒中治疗最常选取的基础穴。缺血再灌注后72 h，正交1，2，3号组大鼠神经行为学评分均与模型组差异有显著性意义(P < 0.01)，且正交3号组大鼠神经行为学评分低于正交1，2号组(P < 0.05)，且72 h后正交3号组大鼠的脑组织梗死面积也低于模型组和正交1，2号组。

ERK是MAPK家族重要成员之一，主要分布于胞浆中，接受NGF-Ras-Raf-MEK顺序激活转至胞核，对转录因子磷酸化而调节转录活性，促进神经元作出相应的反应，EPK还可被多种刺激(如神经递质、氧应激、缺血等)激活，Beretta等^[10]研究发现，MEK-ERK1/2和ERK1/2MAPK是其保护作用细胞外信号传导的重要机制。研究证实，在大鼠脑缺血再灌注模型中，缺血耐受性强的海马CA3/DG区ERK活性增强较缺血敏感的CA1区明显，且随缺血后再灌注时间的延长CA3/DG区ERK的活性有所降低，但在再灌注24 h后仍高于对照水平，而CA1区ERK活性随再灌注时间延长，很快就降至对照水平以下。同时观察到CA3/DG区相对分子质量为180 000的生长因子受体的磷酸化在缺血再灌注后24 h持续增加，此变化可能是ERK水平的升高所引起的神经胶质细胞释放生长因子所致。因此可以看出在大鼠缺血再灌注损伤时ERK活性的增加是针对缺血缺氧刺激启动的修复和促进细胞存活的保护机制，对发生缺血损伤的神经元有保护作用^[11-13]。

实验结果显示，正交3号组大鼠在提高信号通路表达方面起到的作用较其他两组显著，表明电针刺激相关穴位可以有效改善大脑梗死后脑组织的缺血情况，促进梗死区域血管的再生，而这些作用跟激发脑缺血再灌注后的信号通路的表达关系密切。说明电针刺激由正交试验优化组穴配方的在治疗卒中后遗症方面效果显著，证明该选穴方法的科学性和有效性；就该组穴治疗脑缺血再灌注损伤疗的效机制来讲，仅对单一一条信号通路的影响是否可以起到对脑组织的保护作用还有待进一步证实，而该组穴的深一层次的疗效机制还需要做更深一步的研究。

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[1]	闵友江, 姚海华, 孙洁, 周璇, 余航, 孙前谱, 洪恩四. 磁共振评价“三通针法”对脊髓损伤患者脑功能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-8.
[2]	耿秋东, 葛海雅, 王和鸣, 李楠. 基于网络药理学探讨龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1229-1236.
[3]	李时斌, 赖渝, 周毅, 廖建钊, 章晓云, 张璇. 激素性股骨头坏死发病机制及相关信号通路的靶点效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(6): 935-941.
[4]	李琰, 王佩, 邓东焕, 严伟, 李磊, 姜红江. 电针干预全膝关节置换后疼痛的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(6): 957-963.
[5]	徐银琴, 史红美, 王光义. 通痹方热敷联合针刺治疗对退变椎间盘细胞凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2 mRNA的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 713-718.
[6]	张雯雯, 金颂峰, 赵国梁, 宮丽鸿. 复方中药稳斑汤减少同型半胱氨酸诱导大鼠心肌微血管内皮细胞凋亡的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 723-728.
[7]	刘青, 万碧江. 针刀治疗胶原诱导性关节炎大鼠滑膜组织Bcl-2/Bax的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 729-734.
[8]	马子越, 巨啸晨, 张磊, 孙荣鑫. 保留与不保留残端重建前交叉韧带后移植物腱骨愈合的比较[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 582-587.
[9]	朱蕊, 曾庆, 黄国志. 铁死亡与脑卒中[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3734-3739.
[10]	左振魁, 韩佳瑞, 计树灵, 贺璐璐. 银杏酮酯预处理减轻辐射所致模型小鼠的急性肠损伤[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3666-3671.
[11]	张亮, 马晓燕, 王佳虹. 肾衰饮调控慢性肾功能衰竭大鼠肾脏细胞凋亡的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3672-3677.
[12]	严秀蕊, 陶金, 梁雪云. 人胎盘间充质干细胞来源外泌体保护氧化应激损伤肺上皮细胞的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 2994-2999.
[13]	王冬慧, 武鑫, 孙宁宁, 张晗, 高剑峰. 电针干预放射性脑损伤小鼠海马区突触可塑性相关蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(14): 2205-2210.
[14]	赵宁, 于洪丹, 冯珍, 丁佳媛, 刘学政. 红景天苷抑制高糖诱导大鼠视网膜Müller细胞的凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(11): 1664-1669.
[15]	赵春涛, 卿明松, 余浪波, 彭笳宸. 运动学对线和机械力学对线指导全膝关节置换效果的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(9): 1435-1442.

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