白细胞介素1β对软骨细胞miR-27b和基质金属蛋白酶13蛋白表达的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.29.003

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
基质金属蛋白酶：作为结构相似的能够降解细胞外基质的最重要的一大类蛋白酶，构成了细胞外基质降解最重要的蛋白水解系统，对组织的重建及修复发挥着重要作用。基质金属蛋白酶13被认为是能够使关节的Ⅱ型胶原被分解、在骨性关节炎的发病中起重要作用的一种胶原酶，由于Ⅱ型胶原可达胶原总量的80%-95%，对关节的承受力而言具有重要的作用，因此，其分解能够使关节软骨不断破坏，给关节造成不可逆的严重损伤。
白细胞介素1β：作为一种基质金属蛋白酶的诱导剂，能够改善软骨细胞的代谢，将细胞外基质降解，采用抗体对白细胞介素1β进行中和能够对软骨和骨的破坏起到明显地抑制作用。

摘要
背景：基质金属蛋白酶13对软骨细胞外基质中的Ⅱ型胶原蛋白的降解能力最为活跃，白细胞介素1β被认为是基质金属蛋白酶的诱导剂，参与关节软骨的降解和退变。
目的：分析白细胞介素1β对大鼠软骨细胞miR-27b和基质金属蛋白酶13蛋白表达的影响。
方法：雄性Wistar大鼠7只，体外分离培养软骨细胞，并分组为白细胞介素1β刺激组及对照组。对照组不采取任何刺激；白细胞介素1β刺激组采用10 μg/L白细胞介素1β的无血清培养基培养大鼠软骨细胞，于第0，24，48 小时分别采用倒置显微镜观察细胞生长情况，并收集细胞，提取RNA检测软骨细胞基质金属蛋白酶13表达以及不同的miRNAs的表达变化。
结果与结论：①白细胞介素1β诱导大鼠软骨细胞0，24，48 h时基质金属蛋白酶13相对表达量逐渐增加(P < 0.05)；②白细胞介素1β诱导大鼠软骨细胞24，48 h时miR-27b、miR-31表达均逐渐下降 (P < 0.05)；miR-26a、miR-26b、miR-23和miR-204表达均逐渐加强 (P < 0.05)，白细胞介素1β诱导大鼠软骨细胞48 h后，miR-27b表达的降低最为显著(P < 0.05)；③结果说明白细胞介素1β诱导大鼠软骨细胞，miR-27b表达显著下降，靶定调控基质金属蛋白酶13的能力降低，导致软骨细胞的损伤，加剧了骨性关节炎的发病及进展。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-3288-1183(石晶)

关键词: 组织构建, 软骨细胞, 白细胞介素, 基质金属蛋白酶13, 微小RNA, 骨性关节炎, 白细胞介素1β

Abstract:

BACKGROUND: Matrix metalloproteinase-13 is most active in the degradation of collagen type II in the extracellular matrix of cartilage. Interleukin-1 (IL-1) is thought to be the inducer of matrix metalloproteinases, and participates in the degradation and degeneration of articular cartilage.
OBJECTIVE: To study the influence of IL-1β on microRNA-27b (miR-27b) and matrix metalloproteinase-13 expression of chondrocytes in rats.
METHODS: Chondrocytes isolated from seven male Wistar rats were cultured and divided into IL-1β stimulation group and control group. No stimulus was given in the control group; 10 μg/L of serum free medium was used to culture rat chondrocytes in the IL-1β stimulation group. Cell growth was observed at 0, 24, and 48 hours under an inverted microscope. miR-27b and matrix metalloproteinase-13 expression in the cultured chondrocytes were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: The relative expression of matrix metalloproteinase-13 in rat chondrocytes was gradually increased when induced by IL-1β at 0, 24, and 48 hours (P < 0.05). Expression of miR-27b and miR-31 in rat chondrocytes at 24 and 48 hours induced by IL-1β gradually decreased (P < 0.05); conversely, expression of MiR-26a, miR-26b, miR-23, and miR-204 gradually increased (P < 0.05). After 48 hours of IL-1β induction, expression of miR-27b was the lowest in rat chondrocytes (P < 0.05). These findings suggest that IL-1β inhibits miR-27b expression, strengthens the expression of matrix metalloproteinase-13, and damages chondrocytes, contributing to both the onset and progression of osteoarthritis.

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Key words: Interleukins, Matrix Metalloproteinases, MicroRNAs, Osteoarthritis

中图分类号:

R318

石晶，李彤，左灿辉，智良，魏戎，王伟民，刘营杰. 白细胞介素1β对软骨细胞miR-27b和基质金属蛋白酶13蛋白表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(29): 4277-4283.

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图/表（结果） 2

2.1 白细胞介素1β诱导大鼠软骨细胞形态学和细胞核的变化接种之后，采用光学显微镜观察见：悬浮的小圆形的软骨细胞；静置24 h可见：大部分细胞贴壁、增殖，甚至慢慢融合，呈单层不规则“铺路石”样。予以DAPI染色后可见：细胞核均匀着色，且胞核仍为正常结构。白细胞介素1β诱导24 h后可见：部分细胞慢慢变成长梭形，细胞膜的完整性遭到破坏，见图1。予以DAPI染色后可见：部分胞核核区出现致密浓染，核区荧光出现发白、发亮，见图2。白细胞介素1β诱导48 h，以上细胞形态学的变化更为显著，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.2 白细胞介素1β诱导大鼠软骨细胞不同时间点基质金属蛋白酶13相对表达量的对比白细胞介素1β诱导大鼠软骨细胞0，24，48 h时基质金属蛋白酶13相对表达量分别为0.22±0.01、0.48±0.06和0.79±0.05，诱导24和48 h显著高于诱导0 h(P < 0.05)；诱导48 h显著高于诱导24 h(P < 0.05)。说明白细胞介素1β诱导大鼠软骨细胞0，24，48 h时基质金属蛋白酶13相对表达量逐渐增加，差异均有显著性意义(P < 0.05)。

2.3 白细胞介素1β诱导大鼠软骨细胞不同时间点不同miRNAs表达的变化白细胞介素1β诱导大鼠软骨细胞24，48 h时miR-27b、miR-31表达均逐渐下降；miR-26a、miR-26b、miR-23和miR-204表达均逐渐加强，差异有显著性意义(P < 0.05)。见表1。其中，白细胞介素1β诱导大鼠软骨细胞48 h后，miR-27b表达的降低最为显著。

2.4 miR-27b对大鼠基质金属蛋白酶13表达的靶定调控 Targetscan及PicTar软件分析结果显示，于基质金属蛋白酶13 3’-UTR基因处预测到miR-27b作用的靶点。软骨细胞在将miR-27b拟似物进行转染后，基质金属蛋白酶13蛋白的表达明显下降(相对荧光素酶活性：1.13±0.25 vs. 0.56±0.16)，差异有显著性意义(P < 0.05)。

miR-27b拟似物与荧光素酶表达质粒对软骨细胞进行共转染后，荧光素酶活性明显降低(0.93±0.15比0.34± 0.09)；miR-27b拟似物和pGLO-MMP13-3’-UTR-mut对软骨细胞进行共转染后，荧光素酶活性与对照组相比(1.14±0.15 vs 1.03±0.12)，差异无显著性意义(P > 0.05)。

转染miR-27b拮抗剂对大鼠内源性miR-27b表达进行抑制后，荧光素酶活性与对照组相比(1.06±0.15 vs 0.95±0.15)，差异无显著性意义(P > 0.05)。

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引言

骨性关节炎作为负重关节出现的软骨进行性破坏和关节边缘逐渐形成骨赘，以受累关节疼痛、功能活动受到限制及关节畸形等为主要临床表现的一种慢性关节疾病^[1-4]，系由于增龄、肥胖、劳损、创伤、关节先天性异常、关节畸形等诸多因素引起的关节软骨退化损伤、关节边缘和软骨下骨反应性增生，又称骨关节病、退行性关节炎、老年性关节炎、肥大性关节炎等。以往的研究认为，细胞因子和自由基、肥胖、雌激素缺乏等在骨关节炎发病中具有重要作用，但其病因病机尚未完全明确^[5-8]。

骨性关节炎主要的治疗方法是减少关节的负重和过度的大幅度活动，以延缓病变的进程。目前药物治疗是公认的消除疼痛、矫正畸形、改善功能的有效方法，可以明显提高患者的生活质量。药物治疗常采用软骨保护剂如硫酸氨基葡萄糖，具有缓解症状和改善功能的作用，同时长期服用可以延迟疾病的结构性进展。

基质金属蛋白酶是一种Zn²⁺依赖的肽链内切酶。尽管所有基质金属蛋白酶均可降解细胞外基质，但仅有部分基质金属蛋白酶对软骨细胞外基质中Ⅱ型胶原的降解起作用。Ⅱ型胶原是呈三螺旋状，其降解需要特定的基质金属蛋白酶，其中基质金属蛋白酶13是这一过程中关键的酶类，基质金属蛋白酶13对软骨细胞外基质中的Ⅱ型胶原蛋白的降解能力最为活跃^[9-11]。随骨关节炎的进展，关节液中基质金属蛋白酶的水平逐渐增高，而增高的基质金属蛋白酶又会加重关节的破坏。多种细胞可以合成基质金属蛋白酶，包括软骨细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞、上皮细胞等。

白细胞介素1β被认为是基质金属蛋白酶的诱导剂，参与关节软骨的降解和退变^[12-15]。研究显示基质金属蛋白酶的合成是由白细胞介素1β诱导的，骨关节炎软骨细胞白细胞介素1β炎症因子的分泌是增加的，进而促进基质金属蛋白酶的分泌，导致软骨基质的破坏。

近年来，有研究认为，微小RNA(microRNAs，miRNAs)的异常表达在骨性关节炎患者的软骨细胞损伤进程中发挥着重要作用^[16-18]。但在白细胞介素1β对miR-27b和基质金属蛋白酶13蛋白表达的影响方面的报道甚少。

此次研究将大鼠的软骨细胞确定为研究对象，探讨白细胞介素1β对大鼠软骨细胞miR-27b和基质金属蛋白酶13蛋白表达的影响，旨在为骨性关节炎的预防和治疗提供一定的实验基础。

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材料方法

1.1 设计分组对照细胞学实验。

1.2 时间及地点实验于2014年11月至2015年6月在郑州大学附属洛阳中心医院完成。

1.3 材料

实验动物：雄性Wistar大鼠，体质量为180-220 g，购自天津医科大学实验动物中心、动物合格证编号为04084。所有大鼠均属于无特定病原体SPF级别。将实验室的温度调整为20-25 ℃，湿度为50%-60%，大鼠均自由饮水。

大鼠软骨细胞培养实验用仪器、试剂：
仪器及试剂	来源
倒置显微镜	日本Olympus公司
CO₂ 培养箱	美国Thermo公司
LightCycler 96实时荧光定量聚合酶链式反应仪	瑞士罗氏公司
凝胶成像仪	美国SynGene公司
电子天平	上海精密仪器科技有限公司
台式离心机	北京东迅天地医疗仪器有限公司
DMEM胎牛血清和胰蛋白酶	美国 Gibco公司
Lipofectamine 2000及NCode™ VILO™ miRNA cDNA 合成试剂盒	美国 Invitrogen 公司
mirvana™miRNA 分离试剂盒、TaqMan MicroRNA Arrayv2.0	美国Applied Biosystems公司
基质金属蛋白酶13兔抗大鼠单克隆抗体	美国Santa Cruz公司
miR-27b 拟似物、miR-27b 拮抗剂及阴性对照	上海吉玛制药技术公司
双荧光素酶报告基因实验系统	美国 Promega 公司

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠软骨细胞的分离培养及分组采用体积分数10%的水合氯醛以3.5 mL/kg的剂量对7只雄性Wistar大鼠进行腹腔注射麻醉，遵照无菌操作的要求，将髋关节、膝关节、肩关节的软骨切除，并切制成大小为1.0-2.0 mm³的碎块，采用0.25%的胰蛋白酶对其进行消化后，加入10 mL 0.2%的Ⅱ型胶原酶，于放置于37 ℃的细胞培养箱进行消化，4.0-5.0 h后，将软骨组织滤去，按照3 000 r/min的转速对滤液进行离心，5 min后，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液，在培养箱中进行培养。当细胞贴壁的融合率为85%-90%之时，用胰蛋白酶进行消化后传代，按1×10⁶/孔的标准将第3代软骨细胞在6孔板中进行接种。每3孔设为一组，分别设为白细胞介素1β刺激组及对照组。对照组不采取任何刺激；白细胞介素1β刺激组采用含10 μg/L 白细胞介素1β的无血清培养基对大鼠的软骨细胞进行培养，第24，48小时分别用倒置显微镜对细胞的生长情况进行观察，并收集细胞，提取其RNA。

1.4.2 细胞核形态的荧光显微镜观察采用磷酸盐缓冲液将培养好的软骨细胞洗涤3遍，用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2-phenyl-indole，DAPI)染色10 min后冲去并用滤纸将多余水分吸除，加入荧光封片液1滴，用荧光显微镜进行观察，激发360-400 nm的波长。

1.4.3 miRNA的微阵列分析采用mirvana™miRNA分离试剂盒按照说明书提取5 μg软骨细胞总RNA，采用分光光度计对其浓度及纯度进行评估。对提取的RNA采取微阵列进行分析。

1.4.4 实时荧光定量PCR技术检测按照NCode™ VILO™miRNA cDNA合成试剂盒的操作说明进行反转录反应，合成cDNA，根据GenBank基因序列将U6设为内参设计miR-23、miR-26a、miR-26b、miR-27b、miR-31及miR-204等的引物。PCR反应的程序：在95 ℃的环境下预变性5 min、变性15 s，50 ℃温度下退火30 s，72 ℃温度下延伸40 s，40个循环之后，再延伸40 min。采用Applied Biosystems SDS软件包(2.2版)对所得结果进行分析，每组实验均采取同样的步骤重复3次。

1.4.5 靶基因验证方法采用生物信息学软件Targetscan以及PicTar对miR-27b可能的靶基因进行分析后。将基因组DNA设为模板，对基质金属蛋白酶13的3’-UTR予以扩增，将PmeⅠ、XbaⅠ的酶切点及保护碱基引入引物之中。引物序列设定为^[19]：上游：5’-GAC AGC AUA GGC GAU AAG AGC GCC GAA AG-3’；下游5’-GCG GAA GAC CCG ACG GAC CCG GAG GCC CG-3’，引物序列测定正确后，将其克隆至pmirGLO荧光素酶质粒，得到pGLO-MMP13-3’-UTR重组质粒。在大鼠体外合成含有以上位点突变体且序列正确的DNA片段后，克隆至pmirGLO荧光素酶质粒，命名突变质粒为pG-LO-MMP13-3’-UTR-mut。将细胞在24孔板中进行接种，遵照Lipofectamine 2000说明书的操作规范分别对pGLO-MMP13-3’-UTR序列和-mut序列、miR-27b 拟似物序列和拮抗剂序列、对照序列予以瞬时转染。培养24 h，按照荧光素酶检测试剂盒的操作方法对萤火虫荧光素酶活性及海肾荧光素酶活性的比值进行测定，由此推断细胞荧光素酶的表达水平。采用Real-time PCR及Western blot方法对转染效率进行检测。

1.4.6 基质金属蛋白酶13蛋白的表达采用可溶性蛋白裂解液(radio-immunoprecipitation assay，RIPA)对细胞进行裂解、离心，然后取其上清液对其总蛋白进行提取。采用40 μg蛋白量对每条泳道予以上样，用7.5%SDS-PAGE对蛋白质予以分离，用湿法转移蛋白电至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，用5%脱脂奶粉进行封闭，1 h后将制好的基质金属蛋白酶13一抗加入于4℃温度下过夜并洗膜，采用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的二抗进行1 h的常规孵育，在采用增强化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)试剂发生反应1 min后，曝光成像。实验中将β-actin设定为内参。

1.5 主要观察指标 ①白细胞介素1β诱导大鼠软骨细胞形态学和细胞核的变化；②白细胞介素1β诱导大鼠软骨细胞不同时间点基质金属蛋白酶13相对表达量的对比；③白细胞介素1β诱导大鼠软骨细胞不同时间点不同miRNAs表达的变化；④miR-27b对大鼠基质金属蛋白酶13表达的靶定调控。

1.6 统计学分析统计资料以x(_)±s表示。将所得数据导入SPSS 15.0软件进行分析，计量资料采用t 检验，计数资料采用χ²检验，以P < 0.05作为有统计学差异的标准。

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讨论

随着世界人口的老龄化，骨关节炎正迅速成为主要医疗和经济负担，其病理学特征主要为关节软骨的侵蚀，骨赘形成，软骨下骨硬化，以及滑膜和关节腔的一系列生化和形态学改变。目前认为与骨关节炎发病密切相关的危险因素有年龄、关节部位、肥胖、遗传易感性、关节对线不良、创伤和性别等。除了遗传易感性和性别，其余危险因素均与力学因素息息相关，如随年龄增长关节负重时间延长、肥胖导致关节负重增加、关节对线不良和创伤导致关节负重不均等，这些危险因素均可启动关节内多种组织的损伤修复过程，诱导多种炎症递质如细胞因子、趋化因子、蛋白酶的产生，引发级联退行性反应，逐渐导致软骨、骨和滑膜的破坏，导致骨关节炎特征性的病理改变。因此炎症因子及遗传因素被认为是骨关节炎重要的致病因素，对其深入研究可为骨关节炎的靶向治疗提供理论依据。

软骨细胞是软骨中唯一存在的细胞，骨关节炎的软骨细胞可以产生多种炎症因子，例如白细胞介素1β，而这些炎症因子可进一步促进其他炎症因子的产生如白细胞介素8、白细胞介素6、基质金属蛋白酶等，从而降低软骨细胞胶原蛋白的合成，促进软骨细胞外基质的分解。实验结果说明，正常的大鼠软骨细胞基质金属蛋白酶13蛋白的表达极其微量，甚至不表达，白细胞介素1β诱导大鼠软骨细胞24，48 h，基质金属蛋白酶13蛋白的表达呈现出不断增加的趋势，miR-27b的表达则逐渐下降，miR-27b能够对大鼠软骨细胞基质金属蛋白酶13的表达进行靶定调控，由此可见，miR-27b对骨性关节炎的发病过程发挥着调控枢纽的作用。

基质金属蛋白酶作为结构相似的能够降解细胞外基质的最重要的一大类蛋白酶^[20-22]，构成了细胞外基质降解最重要的蛋白水解系统，对组织的重建及修复发挥着重要作用。基质金属蛋白酶13被认为是能够使关节的Ⅱ型胶原被分解、在骨性关节炎的发病中起重要作用的一种胶原酶，由于Ⅱ型胶原可达胶原总量的80%-95%，对关节的承受力而言具有重要的作用，因此，其分解能够使关节软骨不断破坏，给关节造成不可逆的严重损伤^[23-25^]。白细胞介素1β作为一种基质金属蛋白酶的诱导剂，能够改善软骨细胞的代谢，将细胞外基质降解，采用抗体对白细胞介素1β进行中和能够对软骨和骨的破坏起到明显地抑制作用^[26-28]。白细胞介素1β广泛存在于关节液中，被不少学者认为是骨性关节炎进展中关键的促炎症性细胞因子^[29-31]。基质金属蛋白酶表达过度或者表达时间过长均能诱发骨性关节炎，生成基质金属蛋白酶需有多重机制发挥调控作用。研究结果显示，白细胞介素1β诱导大鼠软骨细胞，基质金属蛋白酶13的表达增强，并表现出时间的依懒性。主要考虑与转录后的调控机制有关。

miRNAs是真核生物中一类内源性的非编码RNA，可以通过对靶基因表达的调控，使细胞得生物学行为受到影响^[32-34]。单个miRNA分子能够调控的基因达数十个至数百个，内源性miRNA仅仅约为人类基因总数的2%，调控的基因却达人类基因总数的30%以上，能够在基因表达及蛋白质翻译的过程中发挥重要的调节作用^[35-37]。miRNAs的差异表达可能参与骨性关节炎的发病。mi R-27b靶定调控基质金属蛋白酶13 miRNAs是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，通过调控靶基因表达影响细胞生物学行为。单个mi RNA分子可以调控数十到数百个基因，内源性mi RNA虽然只占人类基因总数的2%，却调控着人类全基因组中30%以上的基因，其作为基因表达和蛋白质翻译过程中的调节分子，miRNAs 差异表达可能与骨关节炎有关。研究结果显示，白细胞介素1β诱导大鼠软骨细胞24，48 h时miR-27b、miR-31表达均逐渐下降，且miR-27b表达的下降最为显著。Targetscan以及PicTar软件分析结果显示，于基质金属蛋白酶13 3’-UTR基因处预测到miR-27b作用的靶点。且通过荧光素酶报告及基因实验验证可以认为，基质金属蛋白酶13是miR-27b发挥作用的靶基因。

在大鼠19号染色体上，有2个miR- 27基因，即为miR- 27a、miR- 27b，2种基因成熟后，在3’-UTR 只存在1个不一样的核苷酸序列。此次实验中，并未检测到软骨细胞miR-27a的差异表达，可以推断，miR-27b是白细胞介素1β的应答基因。白细胞介素1β的诱导下，miR-27b的表达显著降低，不能对基质金属蛋白酶13的表达进行靶定下调，使得基质金属蛋白酶13的表达出现显著上调。亦有研究认为，核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB) 可能参与调控miRNA的表达^[38-40]，白细胞介素1β介导基质金属蛋白酶13的表达有赖于核因子κB的激活，且核因子κB的激活能够负性调节miR-27b 的表达。在本实验中，白细胞介素1β诱导后，miR-27b表达显著下降，基质金属蛋白酶13表达增强，主要考虑与核因子κB 的激活关系密切。

综上所述，白细胞介素1β诱导大鼠软骨细胞，miR-27b表达显著下降，靶定调控基质金属蛋白酶13的能力降低，导致软骨细胞的损伤，加剧了骨性关节炎的发病及进展。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程