胰岛素干预对糖尿病大鼠骨折愈合及骨痂内细胞因子的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.29.002

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (29): 4269-4276.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.29.002

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胰岛素干预对糖尿病大鼠骨折愈合及骨痂内细胞因子的影响

周强1，陆骅1，王占朝2，张豪杰2，蒋雷生1

1上海交通大学医学院附属新华医院骨科，上海市 200092；2上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院骨科，上海市 202150

收稿日期:2016-04-24 出版日期:2016-07-08 发布日期:2016-07-08
通讯作者: 蒋雷生，博士，主任医师，博士生导师，上海交通大学医学院附属新华医院骨科，上海市 200092
作者简介:周强，男，1984年生，江西省丰城市人，汉族，上海交通大学医学院在职硕士，主治医师，主要从事创伤与关节置换方面研究。

Insulin effects on fracture healing and cytokines in the osteotylus in experimental diabetic rats

Zhou Qiang1, Lu Hua1, Wang Zhan-chao2, Zhang Hao-jie2, Jiang Lei-sheng1

1Department of Orthopedics, Xin Hua Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200092, China; 2Department of Orthopedics, Chongming Branch, Xin Hua Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 202150, China

Received:2016-04-24 Online:2016-07-08 Published:2016-07-08
Contact: iang Lei-sheng, M.D., Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Orthopedics, Xin Hua Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200092, China
About author:Zhou Qiang, Master, Attending physician, Xin Hua Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200092, China

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
细胞因子：是指主要由免疫细胞分泌的、能调节细胞功能的小分子多肽。在免疫应答过程中，细胞因子对于细胞间相互作用、细胞的生长和分化有重要调节作用。由于基因工程、细胞工程研究的飞速发展，不仅克隆了早先发现的生物活性肽的cDNA，而且发现了许多新的细胞因子，并对各种细胞因子产生来源、分了子结构和基因、相应的受体、生物学功能以及与临床的关系等进行了大量的研究，成为当今基础免疫学和临床免疫学研究中一个活跃的领域。
胰岛素：胰岛素是由胰脏内的胰岛β细胞受内源性或外源性物质刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素作为降糖药物被广泛作用于临床，是机体内降低血糖的最关键激素，研究还发现它同时具备促进骨组织再生的特性。

摘要
背景：糖尿病是一种以高血糖为特征表现的内分泌代谢紊乱，从而损伤身体多个系统的全身性疾病，并且糖尿病患者骨折后的愈合情况一般都不理想。
目的：动态检测胰岛素治疗前后，糖尿病大鼠在骨折愈合过程中细胞因子的变化趋势。
方法：SD大鼠120只，随机取90只静脉注射5%四氧嘧啶溶液建立糖尿病大鼠模型；另取30只静脉注射等量的生理盐水做对照。糖尿病大鼠模型随机分为胰岛素治疗组和糖尿病组。将3组大鼠右胫骨中段标准横断骨折，胰岛素治疗组每日胰岛素皮下注射1次，糖尿病组及对照组给予等容量的生理盐水。次日检测大鼠血糖情况；骨折后第1，4，8周拍X射线片观察大鼠骨折的愈合情况；造模后第4，6，8周测定每组大鼠离断后右胫骨骨痂的生物力学强度；免疫组织化学和原位杂交技术检测骨痂内多种细胞因子的表达情况。
结果与结论：① X射线片结果显示：糖尿病组骨痂形成时间和骨折愈合速度明显低于胰岛素治疗组和对照组，而后2组差异无显著意义；造模后4，6，8周糖尿病组骨折处骨痂的机械强度均明显低于胰岛素治疗组和对照组，而后2组差异无显著意义；②骨折后1-4周：骨形态发生蛋白2、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子、血管内皮生长因子在骨痂中广泛表达，糖尿病组中的表达明显低于和滞于胰岛素治疗组和对照组，而后2组差异无显著性意义；③结果表明：糖尿病大鼠骨折愈合过程中较正常大鼠，骨痂形成速度和生物力学强度降低，骨折断处组织细胞的生长因子表达水平明显滞后和下降，运用胰岛素干预治疗后可显著提高骨折部位细胞因子的水平，促进成骨细胞增殖和骨折愈合。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-8517-6854(周强)

关键词: 组织构建, 骨组织工程, 糖尿病, 胰岛素, 骨痂, 骨折愈合, 细胞因子

Abstract:

BACKGROUND: Fracture healing in diabetic patients is usually unsatisfactory because of hormones and metabolic disorder, and an eventual multiple organ dysfunction resulting from high blood glucose.
OBJECTIVE: To dynamically observe the changes of cytokines during the fracture healing process in diabetic rats before and after insulin treatment.
METHODS: A total of 120 Sprague-Dawley rats were included in this study. Of them, 90 rats intravenously injected with 5% tetraoxypyrimidine to induce rat models of diabetes were randomized into insulin treatment and diabetes groups, respectively. The remaining 30 rats were intravenously injected with equal volume of saline and selected as control group. The next day, blood glucose was determined. Healing at 1, 4, and 8 weeks after fracture were observed by the X-ray film. Biomechanical strength of the injured right tibia was measured at 4, 6, and 8 weeks after modeling. Cytokines in the osteotylus were determined by immunohistochemical staining and in situ hybridization technique.
RESULTS AND CONCLUSION: The X-ray films showed that the speed of fracture healing in the diabetes group was slower than insulin treatment and control groups. Biomechanical strength of the osteotylus in the diabetes group was significantly decreased compared with the insulin treatment and control groups. However, there were no significant differences in above-mentioned parameters between the control and insulin treatment groups. Bone morphogenetic protein 2, basic fibroblast growth factor, transforming growth factor-beta, and vascular endothelial growth factor were widely expressed in the osteotylus and their expressions in diabetes group were significantly lower and slower than those in the control and insulin treatment groups. There was no statistical difference between control and insulin treatment groups. These results indicate that osteotylus formation speed, biomechanical strength, and growth factor expressions at the fracture site in diabetes rats were decreased compared with normal rats. Insulin treatment can enhance cytokine levels at the fracture site, thereby promoting the osteoblast proliferation and fracture healing.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Diabetes Mellitus, Insulin, Fracture Healing, Cytokines, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

周强，陆骅，王占朝，张豪杰，蒋雷生. 胰岛素干预对糖尿病大鼠骨折愈合及骨痂内细胞因子的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(29): 4269-4276.

Zhou Qiang, Lu Hua, Wang Zhan-chao, Zhang Hao-jie, Jiang Lei-sheng. Insulin effects on fracture healing and cytokines in the osteotylus in experimental diabetic rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(29): 4269-4276.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析实验选用SD大鼠120只，其中30只大鼠静脉注射生理盐水并选作对照组，90只大鼠

静脉注射5%四氧嘧啶，选取连续3 d血糖> 16.7 mmol/L的糖尿病造模成功大鼠进行实验。成功造模74只，建模成功率82.2%。将建模成功的大鼠分为2组，糖尿病组37只，胰岛素治疗组37只。

2.2 不同时期的血糖水平变化分别于建模前和建模后的48 h以及第1，4，6，8周测量空腹血糖值，见表1。造模前，对照组、糖尿病组和胰岛素治疗组之间的基础血糖没有差异。大鼠注射四氧嘧啶48 h后，血糖浓度与对照组比较显著升高(P < 0.01)，达到(28.71±2.20) mmol/L。骨折造模1周后，胰岛素治疗组血糖值明显低于糖尿病组，且糖尿病组相较于胰岛素治疗组和对照组，血糖值差异有显著性意义(P < 0.01)。结果表明，实验成功建立了糖尿病和胰岛素治疗组的大鼠骨折模型。

2.3 各组大鼠X射线片观察骨折愈合情况见图1。骨折后第1周(图1A)骨折端骨折线清楚，骨膜增厚，对照组和胰岛素治疗组可见形成少量骨痂，然而糖尿病组中并未观察到明显的骨痂形成现象。骨折后第4周(图1B)对照组和胰岛素治疗组可以看到，骨折区域的X射线片透亮度显著下降，骨量较多，并能观察到骨小梁发生连接，而在糖尿病组观察到骨折区域的X射线片透亮度较高，骨量较少，仍能观察到清晰的骨折线。骨折后第8周(图1C)对照组和胰岛素治疗组可以看到，骨折区域的骨量进一步增加，观察到的骨折线模糊不清，而在糖尿病组的骨折区域可见大量的骨痂包裹，但相比对照组和胰岛素治疗组骨折线仍较清晰。

2.4 生物力学检测结果将对照组、糖尿病组、胰岛素治疗组造模后的第4，6，8周大鼠取出完整胫骨干置于力学测试机的夹具上固定测定。破坏性三点弯曲力学测试结果见图2A，B，扭转强度测试结果见图2C，D。由计算机软件自动计算弯曲强度、扭转强度和每对标本的参数比率。结果显示，糖尿病组生物力学特征的数值相比对照组差异有显著性意义(P < 0.01)，而胰岛素治疗后检测数值明显上升，差异有显著性意义(P < 0.01)。

2.5 免疫荧光检测相关细胞因子的表达为了检测糖尿病和胰岛素干预治疗对糖尿病大鼠骨折愈合的影响，实验通过免疫荧光技术检测骨痂内多种常见细胞因子的表达情况。在第4周，分别选取对照组、糖尿病组、胰岛素治疗组中骨形态发生蛋白2、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子、血管内皮生长因子的免疫荧光结果(图3)。骨形态发生蛋白2、碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子呈绿色荧光的阳性表达，可以明显观察到对照组和胰岛素治疗组的荧光强度较高，糖尿病组中则较弱；转化生长因子呈红色荧光的阳性表达，同样可以观察到对照组和胰岛素治疗组的荧光强度较高，糖尿病组中则较弱。结果表明，糖尿病组中各细胞因子骨形态发生蛋白2、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子、血管内皮生长因子相比于对照组免疫染色结果均下降，而糖尿病组进行胰岛素治疗后，骨形态发生蛋白2、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子、血管内皮生长因子的免疫染色显著增强，且与对照组染色结果区别不大。

2.6 原位杂交检测相关细胞因子的表达为了进一步观察3组大鼠骨折愈合过程中细胞因子的动态变化，实验运用原位杂交技术检测骨形态发生蛋白2、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子、血管内皮生长因子在造模后1，2，3，4，6，8周的表达情况(图4A)，并计算平均灰度值，代表各细胞因子的含量。对照组和胰岛素治疗组的骨形态发生蛋白2在第1周和第2周的阳性表达逐步升高，第2周达顶峰，第3，4，6，8周逐渐呈下降趋势，而糖尿病组骨形态发生蛋白2阳性表达第3周达顶峰，且阳性表达明显低于对照组(P < 0.01)(图4B)。对照组和胰岛素治疗组的碱性成纤维细胞生长因子表达自第1周至第3周逐步提高，呈现高阳性的持续表达，第3周达表达顶峰，在第4，6，8周表达逐渐降低，而糖尿病组碱性成纤维细胞生长因子阳性表达在第4周达顶峰，且阳性表达明显低于对照组(P < 0.01)(图4C)。对照组和胰岛素治疗组的转化生长因子阳性表达自第1周至第3周逐步升高，第3周达顶峰，第4，6，8周逐渐下降，而糖尿病组转化生长因子阳性表达在第4周达顶峰，且阳性表达明显低于对照组(P < 0.01)(图4D)。对照组和胰岛素治疗组的血管内皮生长因子表达第1至3周逐步升高，呈持续性的高阳性表达，在第3周时达顶峰，第4，6，8周逐渐下降，而糖尿病组血管内皮生长因子阳性表达在第4周达顶峰，且阳性表达明显低于对照组(P < 0.01)(图4E)。

参考文献

[1] Ishikawa K, Fukui T, Nagai T,et al.Type 1 diabetes patients have lower strength in femoral bone determined by quantitative computed tomography: A cross-sectional study. J Diabetes Investig. 2015;6(6): 726-733.
[2] 李溪,向盈盈,龚跃昆,等. 糖尿病骨折大鼠骨痂组织中成骨细胞增殖和骨钙素表达与骨形态发生蛋白2干预的关系[J].中国组织工程研究与临床康复, 2009, 13(20): 3857-3861.
[3] Zhang Q, Dong H, Li Y,et al. Microgrooved Polymer Substrates Promote Collective Cell Migration To Accelerate Fracture Healing in an in Vitro Model. ACS applied materials & interfaces.2015;7(41):23336-23345.
[4] Takeyama K,Chatani M,Takano Y,et al.In-vivo imaging of the fracture healing in medaka revealed two types of osteoclasts before and after the callus formation by osteoblasts.Developmental biology.2014;394(2): 292-304.
[5] Murata K,Ito H,Yoshitomi H,et al.Inhibition of miR-92a enhances fracture healing via promoting angiogenesis in a model of stabilized fracture in young mice.J Bone Miner Res.2014;29(2):316-326.
[6] Wang CY, Yang HB, Hsu HS,et al. Mesenchymal stem cell-conditioned medium facilitates angiogenesis and fracture healing in diabetic rats. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 2012;6(7): 559-569.
[7] Alblowi J, Tian C, Siqueira MF,et al.Chemokine expression is upregulated in chondrocytes in diabetic fracture healing. Bone. 2013;53(1):294-300.
[8] Kottstorfer J,Kaiser G,Thomas A,et al.The influence of non-osteogenic factors on the expression of M-CSF and VEGF during fracture healing. Injury.2013;44(7): 930-934.
[9] 马骋,高岩,苟三怀,等.神经生长因子对大鼠胫骨骨折愈合的影响[J].中国组织工程研究与临床康复,2008, 12(46): 9032-9035.
[10] Krakauer JC, McKenna MJ, Buderer NF,et al.Bone loss and bone turnover in diabetes.Diabetes. 1995; 44(7):775-782.
[11] Krakauer JC, McKenna MJ, Rao DS,et al. Bone mineral density in diabetes. Diabetes care. 1997; 20(8):1339-1340.
[12] Li R,Nauth A,Gandhi R,et al.BMP-2 mRNA expression after endothelial progenitor cell therapy for fracture healing. J Orthop Trauma.2014;28 Suppl 1:S24-27.
[13] Saito W, Uchida K, Matsushita O,et al.Acceleration of callus formation during fracture healing using basic fibroblast growth factor-kidney disease domain- collagen-binding domain fusion protein combined with allogenic demineralized bone powder. Journal of orthopaedic surgery and research. 2015;10:59.
[14] Poniatowski LA,Wojdasiewicz P,Gasik R,et al. Transforming growth factor Beta family: insight into the role of growth factors in regulation of fracture healing biology and potential clinical applications. Mediators of inflammation.2015;2015:137823.
[15] Wang CJ,Huang KE,Sun YC,et al.VEGF modulates angiogenesis and osteogenesis in shockwave- promoted fracture healing in rabbits. J Surg Res. 2011; 171(1):114-119.
[16] Levy JR, Murray E, Manolagas S,et al. Demonstration of insulin receptors and modulation of alkaline phosphatase activity by insulin in rat osteoblastic cells. Endocrinology.1986;119(4):1786-1792.
[17] 李溪,向盈盈,龚跃昆,刘劲松.胰岛素样生长因子1在糖尿病骨折大鼠骨痂组织中对成骨细胞增殖和骨钙素表达的影响[J].中国组织工程研究与临床康复, 2009, (15):2865-2868.
[18] Feng X, Huang D, Lu X,et al. Insulin-like growth factor 1 can promote proliferation and osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells via mTOR pathway.Development, growth & differentiation. 2014;56(9):615-624.
[19] Chen Y, Ke J, Long X,et al.Insulin-like growth factor-1 boosts the developing process of condylar hyperplasia by stimulating chondrocytes proliferation. Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarthritis Research Society.2012;20(4):279-287.
[20] Petrou M, Niemeyer P, Stoddart MJ,et al.Mesenchymal stem cell chondrogenesis: composite growth factor-bioreactor synergism for human stem cell chondrogenesis. Regenerative medicine. 2013;8(2): 157-170.
[21] Wong MC, Leung MC, Tsang CS,et al. The rising tide of diabetes mellitus in a Chinese population: a population-based household survey on 121,895 persons. Int J Public Health.2013;58(2):269-276.
[22] Driessen JH,van Onzenoort HA,Henry RM, et al.Use of dipeptidyl peptidase-4 inhibitors for type 2 diabetes mellitus and risk of fracture. Bone.2014;68:124-30.
[23] Mishima T,Motoyama K,Imanishi Y,et al.Decreased cortical thickness, as estimated by a newly developed ultrasound device, as a risk for vertebral fracture in type 2 diabetes mellitus patients with eGFR of less than 60 mL/min/1.73 m2. Osteoporos Int. 2015;26(1): 229-236.
[24] Liao CC,Lin CS,Shih CC,et al.Increased risk of fracture and postfracture adverse events in patients with diabetes: two nationwide population-based retrospective cohort studies. Diabetes care. 2014; 37(8):2246-2252.
[25] Roy B.Biomolecular basis of the role of diabetes mellitus in osteoporosis and bone fractures. World J Diabetes. 2013;4(4):101-113.
[26] Kayal RA,Siqueira M,Alblowi J, et al.TNF-alpha mediates diabetes-enhanced chondrocyte apoptosis during fracture healing and stimulates chondrocyte apoptosis through FOXO1. J Bone Miner Res. 2010; 25(7):1604-1615.
[27] Lee SN,Lee DH,Lee MG,et al.Proprotein convertase 5/6a is associated with bone morphogenetic protein-2-induced squamous cell differentiation. Am J Respir Cell Mol Biol. 2015;52(6):749-761.
[28] 徐晓峰,李阳,钱栋,等.骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子mRNA在股骨骨不连大鼠损伤区域的动态表达[J].中国组织工程研究与临床康复,2010, 14(37): 6857- 6860.
[29] Hughes-Fulford M, Li CF. The role of FGF-2 and BMP-2 in regulation of gene induction, cell proliferation and mineralization. J Orthop Surg Res. 2011;6:8.
[30] Cals FL,Hellingman CA,Koevoet W,et al.Effects of transforming growth factor-beta subtypes on in vitro cartilage production and mineralization of human bone marrow stromal-derived mesenchymal stem cells. J Tissue Eng Regen Med..2012;6(1):68-76.
[31] Kazemi-Lomedasht F,Behdani M,Bagheri KP,et al.Inhibition of angiogenesis in human endothelial cell using VEGF specific nanobody.Molecular Immunology. 2015;65(1):58-67.
[32] Chamorro-Jorganes A, Lee MY, Araldi E,et al. VEGF-Induced Expression of miR-17~92 Cluster in Endothelial Cells is Mediated by ERK/ELK1 Activation and Regulates Angiogenesis. Circ Res. 2016;118(1): 38-47.
[33] Blakytny R, Spraul M, Jude EB. Review: The diabetic bone: a cellular and molecular perspective. Int J Low Extrem Wounds. 2011;10(1):16-32.
[34] Courcoulas AP,Belle SH,Neiberg RH,et al.Three-Year Outcomes of Bariatric Surgery vs Lifestyle Intervention for Type 2 Diabetes Mellitus Treatment: A Randomized Clinical Trial. JAMA surgery.2015;150(10):931-940.
[35] Pramojanee SN,Phimphilai M,Chattipakorn N,et al. Possible roles of insulin signaling in osteoblasts. Endocrine research.2014;39(4):144-151.

引言

糖尿病可引发人体多系统的慢性损伤并导致多种相关的骨关节疾病，愈合情况一般较不理想^[1-2]。骨折的愈合包括细胞的迁移^[3]、骨痂生成^[4]、血管生成等多种复杂的生理过程^[5]。国内外相关报道表明，相比正常人群，糖尿病患者在骨折后愈合能力显著降低^[6-9]。Krakauer等^[10-11]做过一个有关糖尿病的前瞻性临床研究，统计结果显示糖尿病患者相比于正常人，骨形成能力明显下降。相关细胞和细胞因子在骨折愈合的过程中存在着复杂多变的关联，而在糖尿病中这种关系则更为复杂。糖尿病可能是通过降低骨折区域相关生长因子的表达水平来抑制细胞的增殖；也有可能通过抑制初期基因表达及炎性细胞的生长因子释放来影响骨折的愈合能力。

随着细胞生物学和分子生物学的进展，骨形态发生蛋白2、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子、血管内皮生长因子等细胞因子在骨折愈合过程中的作用日益受到重视^[12-15]。而在骨折愈合过程中胰岛素具有非常重要的作用，在大鼠的成骨细胞上就发现有胰岛素受体^[16-17]。体内实验表明胰岛素对于成骨细胞核苷酸合成的能力显著提升，促进其增殖水平^[18-19]。相反地，在体外研究中发现，软骨形成和骨化/钙化水平在胰岛素不足的条件下会出现明显的延迟和降低^[20]。说明胰岛素可能参与并调节结缔组织的形成，然而其具体机制仍不明确。

实验成功建立糖尿病大鼠骨折动物模型并给予胰岛素治疗，动态检测不同组间在愈合过程中细胞因子的变化趋势，为糖尿病患者骨折后的恢复治疗提供新的根据，对于指导临床具有深远的意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2015年6至10月在中国科学院上海药物研究所完成。

1.3 材料

实验动物：120只SD大鼠购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司(合格证编号：2008001631340)，体质量250-300 g，实验过程中对于动物的处置符合科学技术部2006年公布的《关于善待实验动物的指导性意见》相关说明。

试剂及仪器：四氧嘧啶(美国Sigma公司)；胰岛素(丹麦诺和诺德公司)；抗骨形态发生蛋白2、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子、血管内皮生长因子抗体(英国Abcam公司)；羊抗鼠IgG二抗；羊抗兔IgG二抗(美国Invitrogen公司)：骨形态发生蛋白2、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子、血管内皮生长因子mRNA原位杂交试剂盒(博士德生物)；血糖仪及试纸(瑞士罗氏公司)；共聚焦显微镜(日本Olympus公司)；冰冻切片机(德国Leica公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 糖尿病模型制作将模型制作组90只大鼠适应性喂养3 d，以生理盐水配制5%四氧嘧啶溶液，按当日体质量(130±2) mg/kg剂量，从大鼠静脉缓慢注入，持续观察10 h，维持静脉通道，给予适当处理，连续3 d血糖> 16.7 mmol/L视为建模成功。对照组30只注射等量的生理盐水。

1.4.2 大鼠胫骨骨折模型制作以上述糖尿病大鼠模型90只平均分为2组：胰岛素治疗组和糖尿病组，30只非糖尿病组作为对照组，在无菌条件下，所有大鼠用手术方法造成右胫骨中段标准横断骨折，术后不予固定。制作骨折模型成功后次日，糖尿病组大鼠给予胰岛素治疗，胰岛素(6-8 U)每日下午4-6点皮下注射。糖尿病组和对照组给予注射等容量的生理盐水。实验中所用的大鼠均给予相同的普通饮食。

1.4.3 标本采集造模后第4，6，8周断颈法处死，以骨折端为中心，切取0.5 cm长标本，单面刀片将骨标本分割成0.5 cm×0.2 cm×0.2 cm小块，生理盐水冲洗干净，立即置入40 g/L多聚甲醛中固定12 h。

1.4.4 检测指标随机抽取5只大鼠进行检测：①大鼠血糖检测；② X射线片观察骨痂生长情况。

1.4.5 生物力学强度检测造模后第4，6，8周，每个时间点将对照组、糖尿病组、胰岛素治疗组大鼠取出完整胫骨干，清除软组织，纱布包裹，生理盐水浸透，将标本两端用自凝牙托粉包埋后，固定于生物力学测试机夹具上，方向位置保持一致，进行弯曲强度和扭转强度测试。

1.4.6 免疫荧光检测将大鼠右胫骨骨折断端组织置于体积分数10%甲醛溶液中固定12 h，经5% EDTA脱钙3周，随后梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片厚度5 μm。将组织切片进行抗原修复后，血清封闭，过夜敷育蛋白对应的一抗，随后荧光二抗敷育1 h，封固。运用OLYMPUS FV100 Viewer自动数码图像分析系统进行观察，骨形态发生蛋白2、碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子绿色荧光为阳性表达，转化生长因子红色荧光为阳性表达。

1.4.7 原位杂交检测将骨折断端的组织切片置于APES处理的载玻片上，然后检测骨形态发生蛋白2、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子、血管内皮生长因子的表达，实验方法按试剂盒操作进行。以IPP (Image-Pro Plus 6.0)图像分析软件测定平均灰度值，取算数平均数作为每张切片的平均灰度值，代表单位面积内细胞因子的含量。

1.5 主要观察指标大鼠血糖浓度，骨折愈合情况，生物力学强度，骨痂内骨形态发生蛋白2、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子、血管内皮生长因子的表达情况。

1.6 统计学分析实验运用SPSS 22.0 统计学分析软件处理实验数据，处理后所得数据以x(_)±s予以表示。并运用t 检验方法进行组间分析，P < 0.01则为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

近几年来，全国糖尿病患病人数呈急剧上升之势。病症多发于中年，少数为青少年患者^[21]。众多研究表明，糖尿病患者可引发人体多系统慢性损伤，引起骨质疏松，并易发生骨折，愈合速度慢或不愈合，因此糖尿病与骨折的关系也受到越来越多的关注^[22-24]。而影响糖尿病患者骨折愈合的原因目前仍不清楚，许多科学家认为可能是通过细胞和细胞因子的作用影响骨折愈合^[25-26]。其中，骨形态发生蛋白对于间充质细胞分化为成骨细胞和成软骨细胞起着决定性的作用^[27-28]；碱性成纤维细胞生长因子可促进成骨细胞和血管内皮细胞增殖，对维持软骨细胞的表型发挥着重要作用^[29]；转化生长因子促使间质细胞分化为软骨细胞，并促使软骨细胞成熟，从而进一步刺激软骨基质的合成^[30]；血管内皮生长因子可以显著促进内皮细胞的增殖和血管的生成，对软骨内成骨和骨修复过程中的血管入侵具有重要作用^[31-32]。因此，从分子水平对糖尿病骨折愈合过程进行深入研究有着深远的指导意义。

众多的临床和动物研究提示，在糖尿病环境下，胰岛素干预治疗可有效促进骨折愈合，并且大鼠的成骨细胞上就存在胰岛素受体^[33-34]。体内实验表明胰岛素对成骨细胞核苷酸合成的能力有显著提高，并能促进其增殖能力^[35]。然而其作用机制尚不清楚，需要进一步研究和阐明。本实验建立糖尿病大鼠骨折动物模型并给予胰岛素治疗，比较不同组间骨折区域在愈合过程中多个细胞因子的动态变化趋势，为临床治疗糖尿病患者骨折修复提供新的依据。

实验结果显示：相比于正常大鼠，糖尿病大鼠骨折愈合过程中骨痂形成速度变慢，生物力学强度降低，骨痂内骨形态发生蛋白2、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子、血管内皮生长因子的表达量明显下降。糖尿病大鼠中碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子、血管内皮生长因子阳性表达在第4周到达顶峰，骨形态发生蛋白2在第3周到达阳性表达顶峰，均落后于正常大鼠1周。采用胰岛素干预治疗后，骨折部位细胞因子的水平显著提高，骨痂形成速度加快，促进成骨细胞增殖和骨折愈合。研究提示胰岛素可能通过结合成骨细胞上的胰岛素受体，激活下游信号分子骨形态发生蛋白2、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子、血管内皮生长因子的表达，提高成骨细胞的增殖和骨折愈合水平。本实验为糖尿病患者骨折后的治疗提供新的理念，对于临床指导具有深远的意义。对于胰岛素干预治疗糖尿病骨折愈合的下游途径和作用机制还有待于深入研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

胰岛素干预对糖尿病大鼠骨折愈合及骨痂内细胞因子的影响

Insulin effects on fracture healing and cytokines in the osteotylus in experimental diabetic rats

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[1]	唐辉, 姚志浩, 罗道文, 彭双麟, 杨双林, 王浪, 肖金刚. 高脂高糖饮食结合链脲佐菌素建立2型糖尿病性骨质疏松症大鼠模型[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1207-1211.
[2]	樊全宝, 罗惠娜, 王丙云, 陈胜锋, 崔连旭, 江文康, 赵明明, 王静静, 罗冬章, 陈志胜, 白银山, 刘璨颖, 张晖. 低氧培养犬脂肪间充质干细胞的生物学特性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1002-1007.
[3]	王晗月, 李富荣, 杨晓菲, 胡巢凤. 高效靶向激活肝细胞内源基因直接重编程为胰岛样细胞[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1056-1063.
[4]	杨卫强, 丁童, 杨卫可, 蒋振刚. 组合式可变应力接骨板内固定干预山羊股骨骨折断端的骨组织细胞功能及骨密度变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(6): 890-894.
[5]	张咪, 吴赛璇, 董明, 陆颖, 牛卫东. 根尖周炎模型小鼠白细胞介素24的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 679-684.
[6]	杨洋, 姚羽, 沈孝天, 刘佳佳, 薛建华. 退变腰椎间盘中白细胞介素21的表达及意义[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 690-694.
[7]	吴子健, 胡昭端, 谢有琼, 王峰, 李佳, 李柏村, 蔡国伟, 彭锐. 3D打印技术与骨组织工程研究文献计量及研究热点可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 564-569.
[8]	李晓壮, 段浩, 王伟舟, 唐志宏, 王旸昊, 何飞. 骨组织工程材料治疗骨缺损疾病在体内实验中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 626-631.
[9]	成世高, 王万春, 蒋栋, 李腾飞, 李洵, 任炼. 标准柄与加长柄骨水泥型假体置换治疗高龄转子间骨折的比较[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 362-367.
[10]	高珊, 黄东静, 洪海漫, 贾京桥, 孟斐. 人胎盘间充质干细胞及诱导的胰岛样细胞移植治疗妊娠期糖尿病大鼠效果比较#br#[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3981-3987.
[11]	陈子扬, 蒲锐, 邓爽, 袁凌燕. 外泌体对运动介导胰岛素抵抗类疾病的调控作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 4089-4094.
[12]	陈崧, 何远丽, 谢雯佳, 钟林娜, 王剑. 磷酸钙纳米颗粒药物递送系统在骨组织工程研究与应用中的优势[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3565-3570.
[13]	张振华, 刘姿辰, 禹宝庆. 聚己内酯及其复合材料在组织工程骨构建中的地位与问题[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3571-3577.
[14]	甘丽莉, 熊娜, 刘燕飞. 水凝胶药物支架修复皮肤创面：临床应用可能性的挑战[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3578-3583.
[15]	刘玉琳, 李国泰. 高压氧、振动训练与虾青素联合干预糖尿病骨质疏松模型大鼠骨密度、糖代谢及氧化应激的变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(20): 3117-3124.