骨髓间充质干细胞移植对糖尿病模型大鼠肾脏的保护作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.28.011

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
2型糖尿病：原名叫成人发病型糖尿病，又称非胰岛素依赖型糖尿病，多在35-40岁之后发病，占糖尿病患者90%以上。患者体内产生胰岛素的能力并非完全丧失，有的患者体内胰岛素甚至产生过多，但患者出现胰岛素抵抗，因此出现血糖升高。
间充质干细胞移植：是指将胚胎发育过程中分化成多种成体间叶组织的原始细胞进移植。间充质干细胞具有长期自我更新和发生多向分化的潜能，主要存在于结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，由于骨髓是其主要来源，因此统称为骨髓间充质干细胞。

摘要
背景：国内外关于干细胞移植对糖尿病慢性并发症的治疗作用已有较多理论研究，但其对糖尿病肾病的治疗作用尚无动物实验证实。
目的：观察骨髓间充质干细胞移植对糖尿病模型大鼠肾脏的保护作用。
方法：将大鼠用高糖高脂饮食配方喂养4周后注射链脲佐菌素，建立2型糖尿病模型大鼠，造模成功的第2天开始经尾静脉注射骨髓间充质干细胞单细胞悬液，并设对照组和糖尿病组大鼠作对照。细胞移植后第21天检查大鼠尾静脉血的血糖、三酰甘油和胰岛素水平，并进行肾脏和胰腺组织的病理学观察。
结果与结论：①生化指标：糖尿病组大鼠血糖、血清胰岛素和三酰甘油水平均明显高于对照组(P < 0.05)。干细胞移植组大鼠血糖和血清胰岛素水平明显低于糖尿病组(P < 0.05)；②肾脏和胰腺组织的病理学变化：干细胞移植组大鼠肾小球系膜面积与肾小球体积均明显小于糖尿病组(P < 0.05)；③结果证实：骨髓间充质干细胞移植后可降低血糖及血清胰岛素水平，修复受损的胰腺及肾脏损伤。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-4930-2363(甘利明)

关键词: 干细胞, 移植, 骨髓间充质干细胞, 大鼠, 糖尿病, 肾脏, 胰岛素, 动物实验, 胰腺, 血糖, 三酰甘油, 胰岛素抵抗

Abstract:

BACKGROUND: So far numerous theoretical studies have shown the treatment effect of stem cell transplantation for chronic complications of diabetes, while its treatment effects on diabetic nephropathy have not yet been confirmed in animal models.
OBJECTIVE: To investigate the protective effect of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on the kidney in rat models of diabetes.
METHODS: Rats were fed with high-sugar and high-fat diet for 4 weeks, and then were given injection of streptozotocin to establish type 2 diabetic rat models. At 2 days after modeling, bone marrow mesenchymal stem cells were injected via the tail vein (stem cell transplantation group). In the meanwhile, control and diabetes groups were established. At 21 days after cell transplantation, levels of glucose, triglyceride and insulin in the tail vein were detected. Additionally, morphological observations of kidney and pancreatic tissues were performed.
RESULTS AND CONCLUSION: The levels of blood sugar, insulin and triglycerides in the diabetes group were significantly higher than those of the control group (P < 0.05). Blood glucose and insulin levels in the stem cell transplantation group were significantly lower than those of the diabetes group (P < 0.05). In addition, mesangial area and glomerular volume in the stem cell transplantation group were significantly lower compared with the diabetes group (P < 0.05). These results confirm that bone marrow mesenchymal stem cell transplantation can reduce levels of blood glucose and serum insulin, contributing to the repair of damaged pancreas and kidney.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem cells, Tissue Engineering, Diabetes Mellitus

中图分类号:

R394.2

甘利明. 骨髓间充质干细胞移植对糖尿病模型大鼠肾脏的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(28): 4176-4181.

Gan Li-ming. Stem cell transplantation protects the kidney in diabetic rat models[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(28): 4176-4181.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 纳入大鼠60只，无死亡和感染，均进入结果分析。

2.2 大鼠骨髓间充质干细胞的培养形态和鉴定结果 骨髓间充质干细胞的分离培养采用淋巴细胞分离液和贴壁培养法，通过倒置显微镜观察发现，细胞在骨髓间充质干细胞原代培养12 h后开始贴壁，细胞贴壁伸展在24 h后开始出现，细胞呈梭形。贴壁伸展的细胞在72 h后开始增多，呈散在分布，并出现多个细胞集落；骨髓骨髓间充质干细胞簇状增殖灶在第4，5天开始形成，细胞排列较紧密，分布均匀并且数量增多，形态呈长梭形；骨髓间充质干细胞数量在第5天后扩增迅速，簇状增生灶数量和范围均增大。细胞在第7-9天可达到80%-90%的融合，显微镜下见细胞呈长梭形、星形、成纤维细胞形及不规则形生长，胞浆丰富，如图1所示。经过多次换液，绝大多数的非附壁细胞已被清除。接种4 h后传代细胞开始贴壁伸展，经过12 h活细胞附壁基本完成，在第3天增殖迅速，第7天80%-90%的细胞融合，长梭形形状更为均匀。骨髓间充质干细胞呈S型生长曲线，细胞在第一两天处于潜伏期状态，呈缓慢增殖，第3-6天生长迅速，第7天以后呈缓慢增殖状态。第2，4，6代细胞均能旺盛增殖，呈相似的生长曲线形态，骨髓间充质干细胞细胞传至第6代时并未发现增殖速度减慢。第3代细胞的G₀/G₁期细胞比例约为92.91%，S+G₂+M期比例约为7.09%。仅有较少部分细胞增殖状态活跃，其他大部分细胞处于静止期。

定向诱导脂肪细胞和成骨细胞：光学显微镜观察，第5天开始有黄色圆形脂滴沉着细胞，外观表现为圆形和椭圆形，细胞核靠向一侧。油红O染色显示细胞核呈现蓝色，脂滴呈现红色，脂肪细胞比例随诱导时间延长而逐渐增高。诱导3周后，对照组细胞形态无变化，光学显微镜和油红O染色并未见到有红色脂滴细胞。细胞形状在第7天变为立方形，折旋光性强，立方形细胞所占比重随诱导时间延长而增高，细胞逐渐形成复层。矿化物沉着在培养皿底部较明显，VonKossa染色表现为黑色致密结节，而对照组未发现矿化物沉积和黑色结节。

流式细胞术鉴定结果：经鉴定发现，CD44，CD71和CD105呈阳性表达，阳性率分别为94.25%，73.18%，97.16%；CD34和CD45呈阴性表达，分别为0.37%和1.42%。

2.3 大鼠血液生化指标检测情况 造模成功后糖尿病组和干细胞移植组均标表现出多饮，多食，多尿的“三高”症状，毛色变灰、暗淡无光，消瘦。糖尿病组大鼠与对照组大鼠相比，血糖、血清胰岛素和三酰甘油均明显升高(P < 0.05)。干细胞移植组大鼠通过骨髓间充质干细胞移植治疗，血糖和血清胰岛素明显低于糖尿病组(P < 0.05)，三酰甘油下降不明显(P > 0.05)，见表1。
2.4 各组大鼠肾脏病理形态变化情况 大鼠肾组织切片经苏木精-伊红染色和过碘酸-雪夫染色，置显微镜下计数，经比较分析发现干细胞移植组大鼠治疗后肾小球系膜面积与肾小球体积均明显小于糖尿病组(P < 0.05)，见表2。大鼠胰腺冰冻切片免疫荧光染色发现，糖尿病大鼠的胰岛组织破坏较为严重，干细胞移植组大鼠的胰岛病变有一定程度缓解，说明骨髓间充质干细胞植入后可修复受损胰岛组织。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 于2015年6月至2015年9月在首都医科大学实验动物中心及病理教研室完成。

1.3 材料

实验动物：健康清洁级雄性Wistar大鼠60只，体质量180-200 g，用于建模分组干预；4月龄Wistar大鼠用于细胞培养，均由首都医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：SYXK(京)2013-0004。

试剂配制：配制pH 7.4的1×PBS、0.25%胰蛋白酶、脂肪细胞诱导液和成骨细胞诱导液和MTT溶液。

高糖高脂饲料：高糖高脂饲料由10%猪油，20%蔗糖，2.5%胆固醇，1%胆酸盐，66.5%常规饲料配制，由首都医科大学动物实验中心按要求制备，常规饲料也由首都医科大学动物实验中心提供。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养、纯化及鉴定

培养及鉴定骨髓间充质干细胞：①制备细胞悬液：麻醉处死4月龄Wistar大鼠，皮肤进行局部消毒；在无菌操作下将双侧股骨和胫骨取出，进行灭菌处理；暴露骨髓腔并反复冲洗，骨髓液收集后放入之前已加入DMEM培养基的50 mL无菌离心管，反复抽吸骨髓液并打散后制成细胞悬液。②分离细胞：将细胞悬液离心20 min，吸取单个细胞层；PBS漂洗2次，离心10 min，上清液弃除后留细胞沉淀液。③细胞接种和传代培养：加入L-DMEM培养基，对细胞密度进行调整，接种到25 cm²的细胞培养瓶中，放到恒温细胞培养箱中培养。培养基在48 h后更换，将未贴壁细胞去除，3-5 d进行1次换液。弃除旧培养基并漂洗1次，然后在室温条件下加入体积分数0.25%胰酶并消化5 min，当细胞形态变圆时加入L-DMEM培养基使消化终止，消化液放入50 mL无菌离心管离心5 min，保留细胞沉淀液，加入L-DMEM低糖培养基，按1∶2比例传代。

骨髓间充质干细胞的鉴定：用流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞特异性抗原CD34，CD45，CD71 和CD105，以此来鉴定骨髓间充质干细胞纯度。CD34，CD44，CD45和CD71的检测采用直接标记法，CD105的检测采用间接标记法。

1.4.2 建立2型糖尿病大鼠模型^[5] 将大鼠饲养1周后随机分为20只对照组和40只高血糖组，保证所有大鼠充足饮水和光照正常。高血糖组大鼠用高糖高脂饮食配方喂养，4周后对40只大鼠腹腔一次性注射链脲佐菌素(Sigma公司)。1周后检测在正常饮食下血糖、血清胰岛素和三酰甘油水平。如正常饮食下血糖≥ 16.70 mmol/L并伴有胰岛素抵抗则可以判断2型糖尿病大鼠造模成功。将40只大鼠造模成功后随机分为糖尿病组和干细胞移植组，每组20只。

1.4.3 骨髓间充质干细胞移植和相关指标检测 干细胞移植组大鼠造模成功的第2天经尾静脉注射骨髓间充质干细胞单细胞悬液(1×10⁹ L^-¹，2 mL)；对照组和糖尿病组大鼠尾静脉注射相同剂量的PBS。骨髓间充质干细胞移植后的第21天检查大鼠尾静脉血的血糖、三酰甘油和胰岛素水平；收集大鼠24 h尿液，检测24 h尿白蛋白水平。进行肾脏和胰腺组织的病理学观测，主要包括组织脱水、包埋及切片、苏木精-伊红染色和过碘酸-雪夫染色，然后对肾脏组织形态学进行定量分析，即计算平均肾小球系膜截面积和平均肾小球体积。

1.5 主要观察指标 各组大鼠生化指标，即血糖、血清胰岛素和三酰甘油水平；各组大鼠肾脏病理形态变化情况，计算平均肾小球系膜截面积和平均肾小球体积。

1.6 统计学分析 用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料用x(_)±s表示，组间数据差异的比较采用两样本t 检验。以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

糖尿病肾病也称肾小球硬化症，是糖尿病主要的微血管病变之一^[6]。2型糖尿病胰岛素抵抗及胰岛素分泌障碍为主要发病特点，而且大量相关研究显示，高糖高脂饮食可诱发胰岛素抵抗而最终引起糖尿病^[7]。糖尿病肾病是以高血糖为发病基础，由高血糖引起的相关代谢紊乱使糖尿病肾病被更深入的了解，肾小体呈高灌注压、高滤过状态而导致蛋白尿^[8-10]。高脂血症能加重高血糖的病情程度，高血糖反过来促进血脂升高，因此脂质和葡萄糖对肾脏均具有毒性^[11]。

糖尿病肾病早期发病较为隐匿，临床诊断较为困难，因此通过建立糖尿病肾病的动物模型可以使和糖尿病肾病大鼠相关的临床难题得以解决^[12-13]。近几年来，干细胞治疗糖尿病的相关研究也越来越多，但由于胚胎干细胞存在伦理方面的问题，因此骨髓间充质干细胞就成为治疗糖尿病的重要研究课题。

由于骨髓中含有的骨髓间充质干细胞极少，体外培养有一定的难度，为此实验将骨髓间充质干细胞放入一定浓度的胎牛血清中培养，骨髓间充质干细胞细胞能够贴壁生长，迅速增殖，传到5-7代时，每个贴壁细胞形成一克隆，它们之间相互融合，第3代时每瓶细胞就得到1×10⁷个，这就为接下来的试验奠定了坚实的基础。实验通过骨髓间充质干细胞生长曲线发现，第2，4，6代骨髓间充质干细胞的生长并没有缓慢下来，这和充质干细胞的生长特点相符，提示骨髓间充质干细胞增殖能力极强^[14-15]。实验鉴定骨髓间充质干细胞的标准细胞选取CD34，CD44，CD45，CD71和CD105。目前还没有发现可以识别骨髓间充质干细胞的特异性表面标记物，因此实验对这些细胞的检测也只能最为反映细胞的生长特性的一个方面。干细胞的自我更新能力较强，实验对骨髓间充质干细胞进行细胞周期检测，结果发现，G₀/G₁期细胞约为92.91%，S+G₂+M期约为7.09%。这就提示大部分细胞并不活跃，处于静止时期，处于活跃增殖状态的细胞只有一小部分^[16-17]。干细胞的自我更新方式只能在机体受到损伤时才发生改变，间充质干细胞的多向分化能力较强，在通常情况下均可分化为成骨、软骨何脂肪细胞^[18]。实验经Von kossa和油红O染色显示，大鼠骨髓间充质干细胞定向诱导成骨及脂肪细胞成功实现，这说明实验采取的分离和培养方法正确。

干细胞移植研究中，移植细胞的标记以及在体内的跟踪情况至关重要，标记细胞的方法很多，BrdU标记法是其中的一种^[19-21]。BrdU属于嘧啶类似物，细胞处于DNA合成期中将BrdU掺入到新合成DNA中，BrdU能在胞核DNA中长期保留，如果不受紫外线照射，标记BrdU的细胞对其它细胞不存在功能的损害^[22-23]。国内外在近几年已经采用这种技术来解决移植细胞存活、分化和跟踪功能状态，BrdU标记法的操作方法简单，准确性和标记率高，检测时间短，可以快速反映细胞增殖状态^[24-26]。实验采用BrdU标记法跟踪骨髓间充质干细胞，经体外观察显示，48 h后细胞标记率在90%以上，而且细胞的形态和生长情况，细胞的增殖和分化情况均未受到影响。

实验采用低剂量的链脲佐菌素加入高脂食物来喂养大鼠从而制造2型糖尿病肾病大鼠模型，用骨髓间充质干细胞来治疗尚属首次，之后又将糖尿病肾病大鼠模型随机分为2组，一组是实验组，采用干细胞移植治疗，在大鼠尾静脉注射BrdU标记的骨髓间充质干细胞单细胞悬液，另一组和对照组一样，大鼠尾静脉注射相同剂量的PBS^[27-28]。然后对所有大鼠的血糖、血脂等指标进行观察，注意胰腺和肾脏的病理学改变，通过这些数据结果来预测骨髓间充质干细胞的治疗机制^[29-31]。实验结果显示，糖尿病大鼠移植骨髓间充质干细胞后病情明显缓解，因此预测骨髓间充质干细胞移植后，骨髓间充质干细胞和胰腺细胞两者相互作用，使糖尿病大鼠体内的糖代谢紊乱情况得到了控制。和对照组相比，糖尿病大鼠血糖水平在骨髓间充质干细胞移植治疗后下降明显，但还是没有达到正常生理水平。在糖尿病大鼠的胰腺、肾组织中均可见到 BrdU标记的阳性细胞，这就说明尾静脉注射骨髓间充质干细胞可在2型糖尿病大鼠的胰腺和肾脏定植下来，大鼠的胰岛体积在植入骨髓间充质干细胞后出现了改善性的增大^[32-33]。实验经过实验造模后，被制造出的2型糖尿病肾病大鼠的胰腺被严重破坏，血清胰岛素水平明显升高，经骨髓间充质干细胞植入治疗后血清胰岛素水平明显降低，但也未达到正常生理水平。

2型糖尿病患者除了高血糖外，另一个特点就是明显的胰岛素抵抗^[34]。实验通过检测大鼠血清脂联素水平来反应胰岛素抵抗程度，结果发现，血清脂联素水平在注射骨髓间充质干细胞后出现升高的状态，这就提示骨髓间充质干细胞可以改善糖尿病胰岛素抵抗状态。糖尿病肾病患者的肾小球发生硬化以及肾小管坏死，实验结果显示，植入骨髓间充质干细胞后糖尿病大鼠的肾小球系膜变大，肾小球体积也变大、24 h尿白蛋白排泄减少，这就说明骨髓间充质干细胞对糖尿病肾病肾功能具有明显的改善作用，但三酰甘油的变化没有其它指标明显，这可能由于实验设定的观察时间、注射骨髓间充质干细胞方式和注射频率的原因。

总之，2型糖尿病大鼠受损的胰腺及肾脏在移植骨髓间充质干细胞后可以修复，并且具有降低血糖、血清胰岛素水平和改善胰岛素抵抗等作用。但由于条件限制，实验还存在一些不足之处，今后将进一改进实验设计和方法，以便日后提出更好的研究计划。