皮下注射碱性成纤维细胞生长因子促进血管性痴呆大鼠海马神经干细胞的增殖

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.23.019

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
血管性痴呆：是老年期痴呆的第二病因，在痴呆中占10%-50%。血管性痴呆是一个综合征，不是一个单一的疾病，不同的血管病理变化均可引起血管性痴呆症状，包括大、小动脉病变，弥漫性缺血性白质病变，心脏脱落栓子的栓塞，血液动力学改变，出血，血液学因素和遗传性疾病等。与血管性痴呆有关的病理生理机制包括局灶性缺血性损害、白质病变、其他与缺血有关的因子、功能因素。
碱性成纤维细胞生长因子：最初是Gospodarowicz从牛脑垂体中纯化出来的一种细胞生长因子，对成纤维细胞系BALB/C3T3有明显的促分裂增殖活性，命名为碱性成纤维细胞生长因子，其等电点为9.6，后来发现脑组织中尚有另外一种与其同源性较强、功能相似但等电点为5.6的碱性成纤维细胞生长因子，故将前者命名为碱性成纤维细胞生长因子，后者命名为酸性成纤维细胞生长因子。

摘要
背景：碱性成纤维细胞生长因子是一种神经营养因子，在中枢神经系统内广泛分布，可以与其相应受体结合，发挥重要的生理作用。
目的：探讨皮下注射碱性成纤维细胞生长因子对血管性痴呆大鼠学习记忆能力和海马nestin阳性神经干细胞增殖的影响。
方法：纳入30只SD大鼠，随机分为3组(n=10)：血管性痴呆组、假手术组以及治疗组。血管性痴呆组和治疗组制备血管性痴呆模型，治疗组皮下注射碱性成纤维细胞生长因子。治疗后4周，采用Morris水迷宫实验检测大鼠的学习记忆能力，免疫组织化学染色检测海马nestin阳性细胞数的变化。
结果与结论：①血管性痴呆组的潜伏期显著长于假手术组和治疗组，进出目标象限次数显著少于假手术组和治疗组(P < 0.05)。假手术组和治疗组间比较，差异无显著性意义(P > 0.05)；②在荧光显微镜下，治疗组海马CA1，CA2，CA3区均可观察到带有黄绿色荧光的碱性成纤维细胞生长因子阳性神经元；③治疗组海马CA1区分布大量nestin阳性神经元，假手术组也分布较多nestin阳性神经元，血管性痴呆组nestin阳性神经元分布较为稀疏；④结果表明，皮下注射的碱性成纤维细胞生长因子能迁移至海马区，刺激海马nestin阳性神经干细胞增殖，进而改善大鼠学习记忆能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-3997-581X(刘森)

关键词: 干细胞, 神经干细胞, 血管性痴呆, 碱性成纤维细胞生长因子, 海马区

Abstract:

BACKGROUND: As a neurotrophic factor, basic fibroblast growth factors extensively distribute in the central nervous system, and play an important physiological role by combination with their relative receptors.
OBJECTIVE: To investigate the effect of basic fibroblast growth factors on the learning ability and proliferation of nestin-positive hippocampal neural stem cells in rats with vascular dementia.
METHODS: Totally 30 Sprague-Dawley rats were randomly divided into vascular dementia, sham operation and treatment groups. The vascular dementia and treatment groups were for preparing vascular dementia model, and the treatment group was given subcutaneous injection of basic fibroblast growth factors. Subsequently, at 4 weeks, the learning ability of rats and the number of nestin-positive hippocampal neural stem cells was detected by the Morris water maze test and immunohistochemical staining, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the vascular dementia group the latency period was significantly shorter in the sham operation and treatment groups, and the number of times crossing the target quadrant was significantly higher in the sham operation and treatment groups (P < 0.05). But there was no significant difference between the sham operation and treatment groups (P > 0.05). Under fluorescence microscope, yellow-green fluorescence stained neurons positive for basic fibroblast growth factor could be found in the CA1, CA2 and CA3 of the treatment group. Additionally, the number of nestin-positive neurons in the CA1 area of the hippocampus was the most in the treatment group, followed by the sham operation group, and the least in the vascular dementia group. These results suggest that the subcutaneous injection of basic fibroblast growth factors can migrate to the hippocampus, , and improve the learning ability of rats by inducing proliferation of nestin-positive hippocampal neural stem cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Dementia, Vascular, Fibroblast Growth Factor 2, Neural Stem Cells, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

刘森，戴振霞，吴春芳，胡敬，崔蓓. 皮下注射碱性成纤维细胞生长因子促进血管性痴呆大鼠海马神经干细胞的增殖[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(23): 3470-3475.

Liu Sen, Dai Zhen-xia, Wu Chun-fang, Hu Jing, Cui Bei . Subcutaneous injection of basic fibroblast growth factors promotes the proliferation of hippocampal neural stem cells in rats with vascular dementia[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(23): 3470-3475.

图/表（结果） 2

参考文献

[1] 叶建新,林航,穆军山,等.bFGF对血管性痴呆大鼠海马神经干细胞的影响[J].中国比较医学杂志,2009,19(11):1-4,插1.
[2] 邢雪松,吕威力,赵海,等.碱性成纤维细胞生长因子促进血管性痴呆大鼠音猬蛋白的表达[J].解剖学杂志,2014, 37(6):771-774.
[3] 王小月,周丽莎.电针对AD模型大鼠海马神经干细胞bFGF及学习记忆能力的影响[J].湖北中医学院学报, 2008,10(1):12-14.
[4] 王振宇,佟雷,季丽莉,等.表皮生长因子培养条件下脑源性神经生长因子诱导大鼠海马神经干细胞向神经元分化的最佳浓度[J].中国组织工程研究与临床康复,2008,12(16): 3171-3174.
[5] López-Toledano MA, Redondo C, Lobo MV, et al. Tyrosine hydroxylase induction by basic fibroblast growth factor and cyclic AMP analogs in striatal neural stem cells: role of ERK1/ERK2 mitogen-activated protein kinase and protein kinase C. J Histochem Cytochem. 2004;52(9):1177-1189.
[6] 佟雷,谢大龙,高海,等.联合应用碱性成纤维细胞生长因子和脑源性神经营养因子对成年大鼠脑海马神经干细胞分化为神经元的影响[J].中国组织工程研究与临床康复, 2009,13(27):5331-5335.
[7] Chen YJ, Deutsch G, Satya R, et al. A semi-quantitative method for correlating brain disease groups with normal controls using SPECT: Alzheimer's disease versus vascular dementia. Comput Med Imaging Graph. 2013;37(1):40-47.
[8] Fu JL, Zhang T, Chang C, et al. The value of diffusion tensor imaging in the differential diagnosis of subcortical ischemic vascular dementia and Alzheimer's disease in patients with only mild white matter alterations on T2-weighted images. Acta Radiol. 2012;53(3):312-317.
[9] 吕威力,邢雪松,张玲,等.bFGF在局灶性脑缺血后内源性神经干细胞增殖过程中对Id2的影响[J].解剖学研究, 2011, 33(1):9-12.
[10] Meguro K, Tanaka N, Nakatsuka M, et al. Vascular lesions in mixed dementia, vascular dementia, and Alzheimer disease with cerebrovascular disease: the Kurihara Project. J Neurol Sci. 2012;322(1-2):157-160.
[11] 黄斐,赵际童,沈强,等.神经球方法体外无血清含生长因子培养的神经干细胞主要向神经胶质细胞分化[J].中国组织工程研究,2012,16(1):81-84.
[12] Ihl R, Tribanek M, Bachinskaya N, et al. Efficacy and tolerability of a once daily formulation of Ginkgo biloba extract EGb 761® in Alzheimer's disease and vascular dementia: results from a randomised controlled trial. Pharmacopsychiatry. 2012;45(2):41-46.
[13] Choi SH, Kim S, Han SH, et al. Neurologic signs in relation to cognitive function in subcortical ischemic vascular dementia: a CREDOS (Clinical Research Center for Dementia of South Korea) study. Neurol Sci. 2012;33(4):839-846.
[14] Stasiak A, Mussur M, Unzeta M, et al. Effects of novel monoamine oxidases and cholinesterases targeting compounds on brain neurotransmitters and behavior in rat model of vascular dementia. Curr Pharm Des. 2014; 20(2):161-171.
[15] 曾维军.神经营养因子和生长因子在神经干细胞中的研究进展[J].临床与病理杂志,2015,35(3):484-489.
[16] Wang N, Sun C, Huo S, et al. Cooperation of phosphatidylcholine-specific phospholipase C and basic fibroblast growth factor in the neural differentiation of mesenchymal stem cells in vitro. Int J Biochem Cell Biol. 2008;40(2):294-306.
[17] Meguro K, Akanuma K, Meguro M, et al. Prognosis of vascular mild cognitive impairment includes vascular dementia onset and death by cardiovascular disease: reanalysis from the Osaki-Tajiri project. J Stroke Cerebrovasc Dis. 2012;21(7):607-611.
[18] 李飞.大鼠脊髓损伤模型植入低氧启动血管内皮生长因子表达的神经干细胞的意义[D]. 呼和浩特市:内蒙古医科大学,2015.
[19] 何精选,王艳炜,程雄飞,等.小鼠胚胎皮质、海马来源的神经干细胞在体外增殖特性的比较研究[J].解剖科学进展, 2010,16(3):277-280.
[20] Suzuki Y, Yanagisawa M, Yagi H, et al. Involvement of beta1-integrin up-regulation in basic fibroblast growth factor- and epidermal growth factor-induced proliferation of mouse neuroepithelial cells. J Biol Chem. 2010;285(24):18443-18451.
[21] 李蕊,戴园园,刘娜,等.发育期癫大鼠移植骨髓源性神经干细胞对海马BDNF和bFGF表达的影响[J].中国临床神经科学,2015,23(1):17-22.
[22] Kuhad A,Arora V,Takyar J, et al. Neotric advances in vascular dementia - Highlights from the 7th International Congress on Vascular Dementia, October 20-23, 2011, Riga, Latvia. Drugs of the Future.2012; 37(3):209-219.
[23] Zhang H, Sun R, Liu XY, et al. A tetramethylpyrazine piperazine derivate CXC137 prevents cell injury in SH-SY5Y cells and improves memory dysfunction of rats with vascular Dementia. Neurochem Res. 2014; 39(2):276-286.
[24] 刘阳,刘卫平,王孝安,等.神经生长因子与表皮生长因子干预创伤性脑损伤后内源性神经干细胞的增殖[J].中国组织工程研究,2012,16(1):65-69.
[25] Ma F, Xiao Z, Chen B, et al. Accelerating proliferation of neural stem/progenitor cells in collagen sponges immobilized with engineered basic fibroblast growth factor for nervous system tissue engineering. Biomacromolecules. 2014;15(3):1062-1068.
[26] Gu Y, Xue C, Zhu J, et al. Basic fibroblast growth factor (bFGF) facilitates differentiation of adult dorsal root ganglia-derived neural stem cells toward Schwann cells by binding to FGFR-1 through MAPK/ERK activation. J Mol Neurosci. 2014;52(4):538-551.
[27] 何峻峰,顾国妹,龙大宏,等.神经生长因子重组反转录病毒载体在神经干细胞中的表达[J].中国组织工程研究,2014, (19):3100-3104.
[28] Zhang XL, Zheng SL, Dong FR, et al. Nimodipine improves regional cerebral blood flow and suppresses inflammatory factors in the hippocampus of rats with vascular dementia. J Int Med Res. 2012;40(3): 1036-1045.
[29] Meguro K, Akanuma K, Ouchi Y, et al. Vascular dementia with left thalamic infarction: neuropsychological and behavioral implications suggested by involvement of the thalamic nucleus and the remote effect on cerebral cortex. The Osaki-Tajiri project. Psychiatry Res. 2013;213(1):56-62.
[30] 龙琦,尹晓娟,封志纯,等.神经生长因子和碱性成纤维细胞生长因子对缺氧缺血脑损伤新生大鼠内源性神经干细胞的影响[J].实用医学杂志,2009,25(1):36-39.
[31] 盛宝英,魏春杰,杨晓玉,等.bFGF和BDNF对MCAO大鼠海马区神经干细胞原位增殖的影响[J].黑龙江医药科学, 2010,33(3):1-2.
[32] Maric D, Fiorio Pla A, Chang YH, et al. Self-renewing and differentiating properties of cortical neural stem cells are selectively regulated by basic fibroblast growth factor (FGF) signaling via specific FGF receptors. J Neurosci. 2007;27(8):1836-1852.
[33] Zhu H, Yang A, Du J, et al. Basic fibroblast growth factor is a key factor that induces bone marrow mesenchymal stem cells towards cells with Schwann cell phenotype. Neurosci Lett. 2014;559:82-87.
[34] Maric D, Maric I, Chang YH, et al. Prospective cell sorting of embryonic rat neural stem cells and neuronal and glial progenitors reveals selective effects of basic fibroblast growth factor and epidermal growth factor on self-renewal and differentiation. J Neurosci. 2003; 23(1):240-251.
[35] 李伟伟,姚星宇,杨丽敏,等.体外诱导人脐带间充质干细胞向神经干细胞的分化[J].中国组织工程研究,2014,18(1): 75-80.
[36] 任铭新.BDNF和bFGF对全脑缺血再灌注大鼠内源性神经干细胞的影响[D]. 郑州:郑州大学,2010.
[37] Perri R, Fadda L, Caltagirone C, et al. Word list and story recall elicit different patterns of memory deficit in patients with Alzheimer's disease, frontotemporal dementia, subcortical ischemic vascular disease, and Lewy body dementia. J Alzheimers Dis. 2013;37(1): 99-107.
[38] Tanaka N, Nakatsuka M, Ishii H, et al. Clinical utility of the functional independence measure for assessment of patients with Alzheimer's disease and vascular dementia. Psychogeriatrics. 2013;13(4):199-205.
[39] 李晓波.人胚脑神经干细胞的分离培养和鉴定及bFGF、EGF对脑缺血大鼠自体神经干细胞增殖的影响[D].南京:南京医科大学,2004.
[40] 苏静,肖颂华,刘军,等.碱性成纤维细胞生长因子调节Notch信号通路下游蛋白参与神经干细胞抗辐射损伤的实验研究[J].中华行为医学与脑科学杂志,2014, 23(10): 875-877.

引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年10至12月在河南大学淮河医院实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 健康雄性SD大鼠30只，12月龄，体质量约500 g，由北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司提供，许可证号SYXK(京)2015-0008。30只大鼠随机分为3组(n=10)：血管性痴呆组、假手术组以及治疗组。研究相关方案均提交医学伦理部门审核，符合相关伦理学要求。

1.3.2 主要试剂与仪器 氯胺酮(北京库尔(CORE)科技有限公司)；碱性成纤维细胞生长因子(西安融智生物技术有限公司)；枸橼酸盐缓冲液(上海弘顺生物科技有限公司)；PBS(上海铭睿生物科技有限公司)；过氧化氢溶液(北京创美伟业科技有限公司)；孵育箱(上海钰博生物科技有限公司)；nestin抗体(艾美捷科技有限公司)；酶标抗鼠/兔聚合物(天津赛尔生物技术有限公司)；DAB(北京福意电器有限公司)；苏木精(上海巴玖实业有限公司)；光学显微镜(上海永亨光学仪器制造有限公司)；荧光显微镜(苏州景通仪器厂)。

1.4 实验方法

1.4.1 血管性痴呆模型制备 参照文献[7]方法制备血管性痴呆模型，大鼠术前常规禁食、禁水，给予10%氯胺酮腹腔注射麻醉，仰卧位固定，颈前部去毛，碘伏消毒后沿颈正中线切开，分离双侧颈总动脉，双重丝线进行结扎，依次缝合颈部肌肉和皮肤。假手术组仅行颈部切开，但不结扎双侧颈总动脉。术后3组动物均置于相同环境下进行饲养。

1.4.2 碱性成纤维细胞生长因子治疗 造模后7 d，治疗组大鼠每天皮下注射碱性成纤维细胞生长因子，每次1 μg (1 mL)，1次/d，连续注射7 d，之后每周注射2次，每次1 μg(1 mL)，连续注射30 d。血管性痴呆组按照上述方法注射等量的生理盐水。

1.4.3 Morris水迷宫实验 治疗结束后4周，各组动物进行Morris水迷宫实验，参照文献[8]方法进行，用自动录像系统记录小鼠行为。①定位航行实验：将大鼠从入水点面向池壁置入水槽中，记录120 s内大鼠从入水到爬上平台所需的时间，即逃避潜伏期，连续训练7 d。②空间探索实验；第8天撤去平台，将大鼠从第二象限入水点放入水槽，记录120 s内进出目标象限的总次数。

1.4.4 组织学观察 Morris水迷宫实验结束后，麻醉处死各组大鼠，获得海马组织标本，常规固定、洗涤、脱水、透明、浸蜡、包埋，冠状切片，直接置于荧光显微镜下观察海马组织中是否存在呈黄绿色荧光的碱性成纤维细胞生长因子阳性神经元。

1.4.5 免疫组化染色 将上述组织切片进行nestin免疫组化染色，切片脱蜡后置于煮沸的枸橼酸盐缓冲液中，PBS洗涤2次，添加过氧化氢溶液，室温下孵育10 min，PBS冲洗3次，滴加1︰50 nestin抗体，4 ℃孵育过夜，PBS洗涤3次，添加聚合物增强剂，置室温下孵育20 min，PBS洗涤3次，添加酶标抗鼠/兔聚合物，室温下孵育30 min，PBS洗涤3次，滴加DAB显色液，阳性显色为棕色。苏木精轻度复染，常规脱水、透明、封固后置于光学显微镜下观察，每张切片选择3个相邻150倍视野计数免疫染色阳性神经元数目，取平均值。

1.5 主要观察指标 ①Morris水迷宫实验检测大鼠的学习记忆能力。②免疫组织化学染色检测海马nestin阳性细胞数的变化。

1.6 统计学分析 使用SPSS 18.0进行统计分析。计量资料用x(_)±s表示，采用t 检验和单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

血管性痴呆多因高血压动脉硬化或其他血管病引起，以脑细胞变性、缺失，脑细胞数量减少，脑萎缩等为病理改变^[9]。血管性痴呆的治疗主要针对脑血管病，原则是增加脑血流，改善脑供血，预防脑梗死，促进脑代谢，达到改善及缓解症状、阻止恶化的目的。目前临床上治疗血管性痴呆主要以治疗高血压并维持适当水平，改善脑循环及脑代谢、护脑及康复治疗为主，早期病情不严重其疗效及预后较好，但病情较重时尚无有效的治疗方法。神经干细胞概念的提出为中枢神经系统疾病的治疗带来了美好的前景，其具有自我更新和多向分化的能力，将神经干细胞移植入体内，神经干细胞能够生存并且迁移至受损病灶，在不同微环境下可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，恢复脑神经功能，提高大脑认知功能^[10-18]。干细胞能够通过血管渗透到脑实质并增殖分化为神经元样细胞，替代、修复损失的细胞，达到治疗疾病的目标^[19-24]。

生理条件下神经干细胞处于静止、恒定的状态，脑缺血损害后，神经干细胞易被激活、增殖。碱性成纤维细胞生长因子是一种极具临床应用价值的神经营养因子，能保护神经元，促进神经生长。碱性成纤维细胞生长因子作为一种有丝分裂原，在中枢神经系统发育期和成年脑的神经发生区均有表达^[25-28]。大鼠的学习记忆功能损伤与海马神经元的退变和丢失有关^[29]。海马CA1区是学习记忆功能的重要脑区之一。治疗组海马CA1、CA2、CA3区均可观察到带有黄绿色荧光的碱性成纤维细胞生长因子阳性神经元，结果表明，血管性痴呆大鼠皮下注射碱性成纤维细胞生长因子之后，碱性成纤维细胞生长因子可以透过大鼠的血脑屏障发生迁移，并到达海马区。nestin是一种特殊的细胞骨架蛋白，在哺乳动物神经系统先祖细胞中广泛存在，作为神经前体细胞的标记基因得到广泛应用^[30-32]。实验经免疫组化染色观察各组nestin阳性神经元主要集中于海马CA1区。治疗组海马CA1区分布大量nestin阳性神经元，假手术组也分布较多nestin阳性神经元，血管性痴呆组nestin阳性神经元分布较为稀疏。上述结果提示，在应用碱性成纤维细胞生长因子之后，可以有效促进大鼠海马神经干细胞的分裂，提高胆碱能神经元密度^[33-38]。另外，Morris水迷宫实验结果也显示，血管性痴呆组的潜伏期显著长于假手术组和治疗组，进出目标象限次数显著少于假手术组和治疗组。结果表明，碱性成纤维细胞生长因子可刺激神经干细胞增殖，积极改善大鼠学习记忆能力^[39-40]。

实验初步证实，血管性痴呆大鼠皮下注射碱性成纤维细胞生长因子之后，可以发生迁移到达海马区，诱导海马产生nestin阳性细胞，刺激海马神经干细胞增殖，改善大鼠学习记忆能力，为血管性痴呆的治疗提供了一定的实验依据。