胚胎来源肝干细胞肝内移植后在小鼠体内的分布及分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.19.017

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
治疗性肝再生：该技术可以通过移植少量的肝细胞，并对受体病肝细胞进行完全替换，从而获得原位肝移植，达到器官替代的效果。在正常情况下，受体自身肝细胞会出现优先增殖的情况，因此，移植肝细胞无法正常增殖。为此，可以采用倒千里光碱对受体肝细胞予以预先的抑制，为移植肝细胞提供所需的增殖空间，达到理想的替代效果。
肝干细胞：肝干细胞存在于肝脏组织中，具有很强的分化潜能，可在一定条件下分化为成熟的肝细胞等，是肝损伤修复相关的重要细胞类型。早在1958年Wilson等学者便通过研究发现，在肝脏中存在一定数量的干细胞，这些干细胞属于早期未分化细胞，均具有多分化潜能，可以在一定的情况下发生分化。

摘要
背景：多种原因会导致肝损伤的出现，临床治疗中，可以尝试使用“治疗性肝再生”技术，通过肝干细胞移植方式实现肝再生，达到治疗疾病的目的。
目的：探讨胚胎来源肝干细胞肝内移植治疗后在小鼠体内的分布、分化情况。
方法：纳入20只BALB/c小鼠，均制备肝损伤模型，随机分为2组，每组10只。对照组为70%肝部分切除肝损伤模型+胚胎来源肝干细胞1×10⁵肝内移植，观察组为治疗性肝再生模型+胚胎来源肝干细胞1×10⁵肝内移植。细胞移植后1，2周，观察受体小鼠肝实质内情况；细胞移植2周后，对两组进行共焦荧光免疫组化检测，另外分别采集两组动物的尾静脉血检测血清白蛋白水平。
结果与结论：①细胞移植后1周对两组受体小鼠肝实质内情况进行观察，均可观察到存在绿色荧光散落分布的情况，且分布密度无明显差异；②移植后2周，经观察对照组肝实质内可见类似肝索样结构，但绿色荧光分布区域扩大情况有限；观察组肝实质内可见类似肝索样结构，绿色荧光分布区域出现显著扩大的情况；③细胞移植后2周，共焦荧光免疫组化检测结果显示，在两组受体小鼠肝组织内均可观察到标记细胞白蛋白阳性表达的情况，但观察组的阳性表达细胞数量显著多于对照组；④移植后2周，两组小鼠的血清白蛋白水平基本一致，观察组略高于对照组，但经比较差异无显著性意义(P > 0.05)；⑤实验结果表明，对治疗性肝再生模型小鼠实施肝内胚胎来源肝干细胞移植治疗后，细胞可以有效的整合入宿主肝板，在肝内发生分化，并部分表达肝细胞功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-8370-3697(江四锋)

关键词: 干细胞, 移植, 肝干细胞, 干细胞移植, 肝损伤, 细胞分化, 肝再生, 肝内移植, 共焦荧光免疫, 尾静脉血, 血清白蛋白

Abstract:

BACKGROUND: As many factors can lead to liver injury, we attempt to use the “therapeutic liver regeneration” technology in clinical treatment of liver diseases by promoting liver regeneration.
OBJECTIVE: To investigate distribution and differentiation of embryonic liver stem cells in mice after intrahepatic transplantation via a transplantation approach.
METHODS: Liver injury models were prepared in 20 BALB/c mice, and then randomly equivalently assigned into two groups: 70% partial hepatectomy with intrahepatic transplantation with 1×10⁵ embryonic liver stem cells in control group; therapeutic liver regeneration model plus intrahepatic transplantation with 1x10⁵ embryonic liver stem cells in observation group. At 1 and 2 weeks after cell transplantation, the liver parenchyma of mice was observed. And at 2 weeks, both of the two groups underwent confocal immunofluorescence assay. Besides, blood samples of mouse tail vein were collected to detect levels of serum albumin.
RESULTS AND CONCLUSION: At 1 week after cell transplantation, in the liver parenchyma, green fluorescence was sparsely distributed in the two groups, and the distribution density had no significant difference between the two groups; at 2 weeks after cell transplantation, hepatic cord-like structures appeared in the liver parenchyma of two groups, and the green fluorescence distribution in the control group was limited, but significantly expanded in the observation group. At 2 weeks after cell transplantation, positive albumin expression in the liver parenchyma was significantly higher in the observation group than in the control group, and there was no significant difference in levels of serum albumin between two groups (P > 0.05). To conclude, after transplantation of embryonic liver stem cells in the therapeutic liver regeneration model mice hepatocytes can be effectively integrated into the host hepatic plate, differentiate in the liver, and partially trigger the function of hepatocytes.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Stem Cell Transplantation, Cell Differentiation, Liver Regeneration, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

江四锋. 胚胎来源肝干细胞肝内移植后在小鼠体内的分布及分化[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(19): 2850-2856.

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图/表（结果） 1

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学水平，随机对照动物实验。

1.2 材料 纳入BALB/c小鼠20只，雌雄各半，体质量25-35 g，健康状况良好，均饲养于动物中心SPF环境。

此次研究相关方案均提交本院医学伦理部门审核，并经批准，符合相关伦理学要求。

1.3 实验方法

1.3.1 胚胎来源肝干细胞的分离培养 孕15 d SD母鼠麻醉后处死，获得胚胎，取出胚胎肝脏。PBS充分洗涤后添加胶原酶消化，利用DMEM/F12培养液进行常规培养。免疫细胞化学法检测细胞的CD34、白蛋白和CK19的表达情况。

1.3.2 治疗性肝再生动物模型制备 按照50 mg/kg对实验小鼠进行倒千里光碱腹腔内注射，之后间隔2周进行第2次注射，分2次注射完毕。4周后予以70%肝部分切除，制备肝损伤模型^[7]。对照组仅制备70%肝部分切除肝损伤模型，不进行倒千里光碱预先干预。

1.3.3 实验分组^[8] 20只小鼠按随机数字表法分为2组：①对照组：70%肝部分切除肝损伤模型+胚胎来源肝干细胞1×10⁵肝内移植。②观察组：治疗性肝再生模型+胚胎来源肝干细胞1×10⁵肝内移植。

1.3.4 细胞标记 利用CFDA SE对两组的移植细胞进行标记。首先利用胰蛋白酶对细胞进行消化，离心后弃去上清液。于含荧光示踪剂CFDA SE的PBS中进行细胞重悬，并置于37 ℃环境下进行孵育。孵育15 min后离心，弃去上清液。于PBS中进行细胞重悬，并置于37 ℃环境下进行孵育。孵育30 min后利用PBS进行稀释。

1.3.5 细胞移植 对动物进行乙醚麻醉，达到麻醉效果之后进行，门静脉血流进行阻断，阻断15 min后经门静脉对荧光标记的细胞1×10⁵进行肝内移植。移植完毕进行压迫止血，常规关腹，完成手术。术后对动物进行常规抗感染等治疗，并进行喂养。

1.3.6 荧光显微镜观察 移植后1，2周，2组分别处死5只动物，获得肝组织标本。置于荧光显微镜对移植细胞体内分布情况等进行观察。

1.3.7 双荧光染色 移植后2周，获得肝组织，冰冻后切片，甲醛固定。解冻后进行水化，添加PBS(含Triton X-100)，进行白蛋白荧光免疫组化检测。

1.3.8 肝功能检测 移植后2周，分别采集2组动物的尾静脉血送检，检测2组动物的血清白蛋白水平。

1.4 主要观察指标 ①两组移植后细胞在受体小鼠肝内的分布情况。②共焦荧光免疫组化法检测2组标记细胞白蛋白阳性表达情况。③2组动物的血清白蛋白水平。

1.5 统计学分析 对研究过程中获得的数据进行收集，使用的统计学软件为SPSS 18.0。计算P值，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

受到疾病等因素的影响，极易导致不同程度肝损伤的出现。对于一些已经造成的肝脏损伤，药物治疗已经产生不了针对性的效果，这就需要进行器官移植^[9]。在人体所有主要器官当中，肝脏的再生能力最强，所以包括肝炎、肝硬化在内的许多肝病都能通过来自健康捐献者的一块肝而获得治愈。传统的肝脏移植技术虽然能够给患者一个新的肝脏，但是也有一定的局限性，比如说手术费用高、肝源难寻、容易发生免疫排斥反应等。同时，肝脏移植是一个创伤面非常大的手术，患者的手术风险大，术后恢复时间长，而且还要长期用免疫抑制药，这也是一笔不小的费用。另外，肝脏移植还存在常伴随排斥反应等不足之处^[10]。且在实际的治疗过程中，存在肝脏器官移植极为稀缺的问题。随着干细胞技术的不断发展，干细胞移植治疗利用细胞再生及人工肝的原理，可有效延缓肝脏坏死患者的寿命并极大改善其健康状况，成为研究的热点^[11-13]。肝病患者的病因主要是由于肝脏细胞的死亡缺失，导致了肝脏功能不同程度的丧失。

干细胞是一种具有自我更新及多向分化潜能的细胞群，也是维持人体细胞更新及组织器官损伤修复和再生的根本^[14]。干细胞是人体内的原始细胞，具有高度的可塑性和多向分化潜能，在一定的环境下能够分化形成其他类型的细胞，比如肝细胞、神经细胞、肌细胞和软骨细胞等。干细胞进入患者体内后，一方面可以分泌一定的细胞因子，这些细胞因子能够修复病变部位的受损细胞，还能够激活患者的内源性干细胞，促进其扩增分化，形成新的肝脏细胞。另一方面，干细胞能够在肝脏病变部位分化成患者所需要的肝细胞，从而补充由于病变而缺损的细胞，这就从根本上解决了肝脏由于细胞缺损而失去的功能，让肝脏重新恢复活力。因此，临床通过干细胞移植方式，可以有效促进损伤肝脏修复、改善症状、提高存活率。干细胞技术对于治疗急性肝衰竭、终末期肝病以及遗传代谢性肝病都具有积极意义^[15-18]。干细胞移植治疗中，通过干细胞的自身修复、新生能力，使人体肝脏的再生功能明显提升^[19]。

肝干细胞存在于肝脏组织中，具有很强的分化潜能，可在一定条件下分化为成熟的肝细胞等，是肝损伤修复相关的重要细胞类型^[20-23]。早在1958年，Wilson等^[24]学者便通过研究发现，在肝脏中，存在一定数量的干细胞。这些干细胞属于早期未分化细胞，均具有多分化潜能，可以在一定的情况下发生分化。赵利峰等^[25]通过研究发现，肝干细胞的生长和分化与大鼠肝再生之间存在一定的关系，在肝再生中，肝脏干细胞会出现生长以及分化活动增强的情况，且出现这一现象的原因，与一些基因的表达状态以及方式有关。在干细胞移植治疗过程中，可以使用“治疗性肝再生”技术。该技术可以通过移植少量的肝细胞，并对受体病肝细胞进行完全替换，从而获得原位肝移植，达到器官替代的效果^[26-29]。肝脏再生医学的一个核心问题是如何获得功能性肝细胞，临床研究总要注意通过有效的方式来获得人类功能肝细胞来源。在正常情况下，受体自身肝细胞会出现优先增殖的情况，因此，移植肝细胞无法正常增殖^[30-33]。为此，可以采用倒千里光碱对受体肝细胞予以预先的抑制，为移植肝细胞提供所需的增殖空间，达到理想的替代效果^[34]。

在此次研究中，建立“治疗性肝再生”模型，并对肝细胞样细胞进行模型小鼠肝内移植治疗。在实验中，选择利用CFDA SE对细胞进行标记。CFDA SE 羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(5- or 6-(N- Succinimidyloxycarbonyl)-3",6"-O,O"-diacetylfluorescein) 是一种可对活细胞进行荧光标记的新型染料，可以标记活体细胞。CFDA SE的标记原理为，CFSE能够轻易穿透细胞膜，在活细胞内与胞内蛋白共价结合，水解后释放出绿色荧光。在细胞分裂增殖过程中，它的荧光强度会随着细胞的分裂而逐级递减，标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半，根据这一特性，它可被用于检测细胞增殖，细胞周期的估算及细胞分裂等方面。CFDA SE具有一定的特性，在胞外无荧光，在进入细胞内之后，可以受到胞浆酯酶的影响丢失乙酰基，并发出绿色荧光，达到标记细胞的目的。而且，CFSE标记的细胞用于体内观察可以长达数周之久，它常被用来做活体细胞检测实验和用荧光电镜观察细胞长期活动的实验。荧光探针CFSE进入细胞后定位于细胞膜、细胞质和细胞核，在细胞核的荧光染色最强，并证实CFSE不影响细胞的增殖能力。此方法操作简单，且不用放射性同位素，不存在安全隐患。可以更快速，更准确和更安全的得到想要的实验数据。因此，CFDA SE是一种十分理想的细胞示踪剂。

此研究结果显示，细胞移植后1周对2组受体小鼠肝实质内情况进行观察，均可观察到存在绿色荧光散落分布的情况，且分布密度无明显差异。移植后2周，经观察对照组肝实质内可见类似肝索样结构，但绿色荧光分布区域扩大情况有限，观察组肝实质内可见类似肝索样结构，且绿色荧光分布区域出现显著扩大的情况。即表明，在移植入肝内之后，细胞发生了迁移和分化。在肝细胞中，存在一定数量的白蛋白^[35]。正常情况下，白蛋白低与肝功能异常有关还与肝脏合成蛋白质功能下降有关。肝脏是合成蛋白的主要场所，而白蛋白的合成几乎全由肝脏合成，各种肝脏、蛋白补偿机能受损，则造成制造的不足。白蛋白是一种特殊的功能蛋白，由肝细胞特异性表达，是成熟肝细胞的功能蛋白，白蛋白的表达数量与移植干细胞的功能状态以及分化程度之间存在十分密切的联系^[36-38]。当肝功能受损时，白蛋白产生减少。反之，如果出现肝细胞大量增殖的情况，则会出现白蛋白明显增加的现象。

此次实验中，对细胞进行绿色荧光蛋白CFDA SE标记之后，通过对受体肝组织进行标记白蛋白免疫组化检测，可较为直观的对供体干细胞分化情况予以了解。经白蛋白荧光免疫组化检测之后，正常的肝组织呈红色荧光，CFDE SE标记细胞为绿色，表达白蛋白则同时呈现出红色和绿色^[39-40]。本研究于细胞移植后2周后，对2组进行共焦荧光免疫组化检测，在两组受体小鼠肝组织内均可观察到标记细胞白蛋白阳性表达的情况，但观察组的阳性表达细胞数量显著多于对照组。移植后2周，分别采集2组动物的尾静脉血送检。经检测，2组动物的血清白蛋白水平基本一致，观察组略高于对照组，但经比较差异无显著性意义。表明对治疗性肝再生模型小鼠实施肝内胚胎来源肝干细胞移植治疗后，细胞可以有效的整合入宿主肝板，在肝内发生分化，并部分表达肝细胞功能。

综上所述，肝内胚胎来源肝干细胞移植治疗治疗性肝再生模型小鼠，细胞可整合入宿主肝板，并在肝内发生分化。总之，肝干细胞在各种肝脏疾病的临床治疗之中具有良好的应用前景，相关细节问题值得予以进一步分析。