金属离子Cu2+、Fe3+对水凝胶RADA16-NBD培养条件下成骨细胞生长与分化的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.16.009

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (16): 2347-2353.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.16.009

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金属离子Cu²⁺、Fe³⁺对水凝胶RADA16-NBD培养条件下成骨细胞生长与分化的影响

石金明^1，2，赵刚²，阮蔷²

1佳木斯大学研究生学院，黑龙江省佳木斯市 154002；2佳木斯大学第二附属医院正畸科，黑龙江省佳木斯市 154002

收稿日期:2016-02-14 出版日期:2016-04-15 发布日期:2016-04-15
通讯作者: 赵刚，副教授，副主任医师，硕士生导师，佳木斯大学附属第二医院口腔医院正畸科，黑龙江省佳木斯市 154002
作者简介:石金明，男，1987年生，黑龙江省佳木斯市人，汉族，在读硕士，主要从事临床口腔医学研究。
基金资助:
佳木斯大学研究生科技创新项目(LZZ2014_027)；黑龙江省自然科学基金项目(H201487)

Effect of Cu²⁺ and Fe³⁺ on osteoblast growth and differentiation in hydrogel RADA16-NBD

Shi Jin-ming^{1, 2}, Zhao Gang², Ruan Qiang²

1Graduate School of Jiamusi University, Jiamusi 154002, Heilongjiang Province, China; 2Department of Orthodontics, Second Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154002, Heilongjiang Province, China

Received:2016-02-14 Online:2016-04-15 Published:2016-04-15
Contact: Zhao Gang, Associate professor, Associate chief physician, Master’s supervisor, Department of Orthodontics, Second Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154002, Heilongjiang Province, China
About author:Shi Jin-ming, Studying for master’s degree, Graduate School of Jiamusi University, Jiamusi 154002, Heilongjiang Province, China
Supported by:
the Technological Innovation Project for Graduate in Jiamusi University, No. LZZ2014_027; the Natural Science Foundation of Heilongjiang Province, No. H201487

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

水凝胶RADA16-NBD： RADA16-I是一种新型的自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料，分子水平组装成β折叠结构，在亲水面往复形成互补离子键，组装为纳米纤维，在其表面已有细胞及MC3T3-E1细胞附着生长的研究。这种纳米纤维支架结构与细胞外基质相近，能够为组织细胞提供良好的三维培养条件。此外，RADA16可在其C端末端复合上短的生物活性多肽片段(一般不超过15个氨基酸片段)，构建新型功能化自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料。水凝胶RADA16-NBD，即为氨基酸构成的多肽生物支架，它将多肽短链NBD结合于单纯多肽RADA16，用α-MEM细胞培养基触发，可自组装形成利于细胞体外生长的水凝胶三维环境。

成骨细胞增殖：由多种生长因子调控，包括胰岛素样生长因子、表皮生长因子、转化生长因子β、Wnt、血小板源性生长因子及骨形态发生蛋白等。成熟的成骨细胞可以表达碱性磷酸酶、Osterix、Coll、骨粘连蛋白、骨钙蛋白和骨桥蛋白等，其中碱性磷酸酶是成骨细胞的早期成熟标志，晚期矿化标志是骨钙素与钙磷等结合形成的结晶。

背景：在自组装功能性RADA16-NBD水凝胶中进行成骨细胞MC3T3-E1体外培养已较成熟，且骨骼的正常代谢与多种金属离子(如铁、铜、锌、锰等)有关已被证实。

目的：观察Cu²⁺和Fe³⁺对自组装功能性RADA16-NBD水凝胶培养下成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化等相关方面的影响。

方法：将成骨细胞与自组装功能性RADA16-NBD水凝胶进行三维培养，分3组干预，分别加入Cu²⁺、Fe³⁺、不含血清培养基(对照组)，培养24，48，72 h，CCK-8法检测细胞增殖；培养1，3，5 d，检测细胞碱性磷酸酶活性；培养21 d时，观察细胞钙化结节情况；Transwill小室培养24 h，观察细胞迁移能力。

结果与结论：①细胞增殖：Cu²⁺组、Fe³⁺组培养24，48 h的细胞增殖高于对照组(P < 0.05，P < 0.01)；培养72 h时，3组细胞增殖无差异；②细胞碱性磷酸酶活性：Cu²⁺组、Fe³⁺组培养1，3，5 d的细胞碱性磷酸酶活性高于对照组(P < 0.05)，Cu²⁺组培养3，15 d的细胞碱性磷酸酶活性高于Fe³⁺组(P < 0.05)；③细胞迁移：Cu²⁺组迁移细胞数量多于Fe³⁺组(P < 0.05)；④结果表明：Cu²⁺和Fe³⁺均可促进MC3T3-E1成骨细胞的增殖、分化及迁移，但Cu²⁺对成骨细胞的影响要优于Fe³。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
ORCID: 0000-0002-3647-510X(赵刚)

关键词: 生物材料, 材料相容性, 自组装, RADA16-NBD水凝胶, 金属离子, 成骨细胞, 三维培养, Transwill小室, 黑龙江省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: It is a mature technology to culture MC3T3-E1 cells in the self-assembling peptide hydrogel, RADA16-NBD. Moreover, it is confirmed that a variety of metal ions, such as Fe, Cu, Zn, Mn, are involved in normal bone metabolism.

OBJECTIVE: To observe the effect of Cu²⁺and Fe³⁺ on the proliferation and differentiation of MC3T3-E1 cells cultured in the self-assembling peptide hydrogel, RADA16-NBD.

METHODS: Osteoblasts cultured with RADA16-NBD were divided into three groups and respectively cultured in culture medium containing Cu²⁺, Fe³⁺ or serum-free medium (control group), respectively. After 24, 48 and 72 hours, cell proliferation was detected by cell counting kit-8. After 1, 3, 5 days, alkaline phosphatase activity was detected. At 21 days, formation of calcified nodules was observed. Cell migration ability of cells was observed at 24 hours of Transwill chamber culture.

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the proliferative ability of cells cultured in the Cu²⁺, Fe³⁺ groups was significantly higher (P < 0.05, P < 0.01). At 72 hours of culture, there was no difference in the cell proliferation among the three groups. At 1, 3, 5 days of culture, the alkaline phosphatase activity in the Cu²⁺, Fe³⁺ groups was significantly higher than that in the control group (P < 0.05); while at 3 and 5 days of culture, the alkaline phosphatase activity in the Cu²⁺ group was significantly higher than that in the Fe³⁺ group (P < 0.05). In addition, the number of migrated cells was higher in the Cu²⁺ group than the Fe³⁺ group (P < 0.05). These findings indicate that both Cu²⁺ and Fe³⁺, especially the former one, can promote MC3T3-E1 cell proliferation, differentiation and migration.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Hydrogel, Osteoblasts, Cell Proliferation, Tissue Engineering

石金明，赵刚，阮蔷. 金属离子Cu²⁺、Fe³⁺对水凝胶RADA16-NBD培养条件下成骨细胞生长与分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(16): 2347-2353.

Shi Jin-ming, Zhao Gang, Ruan Qiang. Effect of Cu²⁺ and Fe³⁺ on osteoblast growth and differentiation in hydrogel RADA16-NBD[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(16): 2347-2353.

图/表（结果） 3

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引言

骨代谢包括成骨细胞骨生成和破骨细胞骨吸收两种相对的活动过程，二者的协调活动对维持正常骨量的最终平衡至关重要，如果此平衡被打破，会带来一系列的骨代谢性疾病^[1]。在骨的代谢平衡、损伤修复、生长发育和骨的数量维持中，成骨细胞扮演着重要的角色^[2]。牙周病主要是由牙菌斑及局部和全身促进因素导致。牙周炎伴发的牙槽骨吸收会导致牙齿松动甚至脱落，这与骨代谢平衡被打破有直接关系。对于牙周病的治疗及预后，成骨细胞起着至关重要的作用^[3-4]，此外成骨细胞在正畸治疗及牙种植等方面也扮演着重要角色。

经证实，细胞的很多生理代谢活动与胞内金属离子Ca²⁺有关，Ca²⁺浓度提高是一种生理信号，它介导细胞的很多生理反应^[5]。骨骼的正常代谢除与Ca²⁺有关外，还与多种金属离子有关。然而这些金属离子可能与细胞的增殖、分化、凋亡及功能表达有关^[6-7]。成骨细胞在骨形成中的主要过程为细胞增殖、成熟、矿化和凋亡4个阶段，多种因子参与在此过程中。在成骨细胞骨形成的调控中，一些金属离子起了一定作用，其中被研究较多的是锌离子。Seo等^[8]研究证实，锌离子可刺激MC3T3-E1细胞的增殖、骨胶原合成及钙盐沉积，增强骨形成标志蛋白碱性磷酸酶的表达。

研究表明，在三维环境中培养的细胞，其基因表达模式和其他生物学活动更接近生命有机体^[9-10]。自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料具有良好的生物活性和生物相容性，已被广泛应用于再生医学、组织工程、细胞三维培养和药物的缓释等领域。RADA16-I([COCH₃]- RADARADARADARADA-[CONH₂])是一种新型的自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料^[11]，分子水平组装成β折叠结构，在亲水面往复形成互补离子键，组装为纳米纤维^[12]，在其表面已有细胞及MC3T3-E1细胞附着生长的研究^[13-14]。这种纳米纤维支架结构与细胞外基质相近，能够为组织细胞提供良好的三维培养条件。此外，RADA16可在其C端末端复合上短的生物活性多肽片段(一般不超过15个氨基酸片段)，构建新型功能化自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料。水凝胶RADA16-NBD，即为氨基酸构成的多肽生物支架，它将多肽短链NBD结合于单纯多肽RADA16，用α-MEM细胞培养基触发，可自组装形成利于细胞体外生长的水凝胶三维环境^[15]。

实验将小鼠成骨细胞MC3T3-E1细胞用RADA16- NBD水凝胶进行真正的三维培养，以模拟最接近机体内环境，选取添加Cu²⁺和Fe³⁺，研究其对成骨细胞MC3T3-E1生长和分化相关的影响，并进行效果鉴定及比较。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学对比观察实验。

1.2 时间及地点于2014年11月至2015年7月在佳木斯大学118实验楼7楼生命科学实验中心完成。

1.3 材料小鼠成骨细胞MC3T3-E1，由中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心提供；RADA16- NBD，上海吉尔生物科技有限公司介成并纯化，纯度≥95%)。

金属离子促进成骨细胞生长与分化实验用主要试剂仪器：
试剂与仪器	来源
氯化铜和三氯化铁，纯度为100%	上海挨彼化学试剂有限公司
胎牛血清、α-MEM培养基	Gibco公司
青霉素链霉素溶液-双抗、0.25%胰蛋白酶消化液	HyClone海可隆公司
PBS	碧云天生物技术研究所
Cell Counting Kit-8 试剂盒	Dojindo Laboratories,Japan
碱性磷酸酶检测试剂盒	南京建成生物工程研究所
茜素红	金穗生物
电子天平	OHAUS，美国
Olympus显微镜	Olympus显微镜
酶标仪	TAKARA，日本
高温高压灭菌锅MLS-3750	日本SANYO公司
CO₂培养箱	美国ThermoForma公司
S W-LZ-ZFO型超净工作台	中国苏州

1.4 实验方法

金属离子的准备：将CuCl₂和FeCl₃•6H₂O用无菌生理盐水(0.9%NaCl)配制成1×10^-2 mol/L储备液，无菌封存，临用前用生理盐水稀释到所需浓度。

细胞的准备：对成骨细胞MC3T3-E1进行换液传代。将MC3T3-E1细胞铺匀在25 cm²装有5 mL培养液的培养瓶中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂饱和湿度的培养箱中常规培养。每二三天换液 1次，注意观察细胞的生长情况，待细胞融合至80%左右时传代。

MC3T3-E1细胞的三维培养：将10 g/L的RADA16- NBD母液(溶于无菌100 g/L蔗糖溶液中)在超声水浴锅中超声约20 min，以减少肽本身的黏稠性，1 000 r/min离心5 min，去除气泡。用胰酶消化MC3T3-E1细胞，加培养液终止消化，吹打重悬至离心管中，1 000 r/min离心5 min，去上清培养基，用无菌PBS洗涤1次，以去除胰酶及培养基的影响，计数。1 000 r/min离心5 min，加入无菌100 g/L蔗糖溶液制得到细胞浓度为1×10⁹ L^-1的细胞蔗糖重悬液。迅速将细胞悬液与等体积的10 g/L RADA16-NBD母液混合，吹打，操作轻柔避免产生气泡，细胞终浓度为5×10⁸ L^-1。在24孔板每孔加入100 µL混合液，然后快速加入400 µL培养基(含磷酸甘油、维生素C、地塞米松的成骨诱导剂)。置于37 ℃细胞培养箱中孵育，隔天换液。

1.5 主要观察指标

细胞增殖：待细胞达80%汇合后，按细胞三维培养方法以1×10⁵/孔接种于3块96孔细胞培养板，分3组，每孔胞液共180 µL，各自设6个平行复孔，37 ℃细胞培养箱中培养过夜。次日换液后，Cu²⁺组、Fe³⁺组分别加入金属离子Cu²⁺和Fe³⁺工作液20 µL/孔，离子终浓度为 1×10^-4 mol/L，对照组添加等量不含血清培养基。培育24，48，72 h时，分别取出96孔板，加入10 µL CCK-8检测试剂(注意不要在孔中生成气泡)，避光放入37 ℃、饱和湿度、体积分数5%CO₂细胞孵育箱中，培养1 h后取出。用酶标仪测定在450 nm处的吸光度(A)值。

细胞碱性磷酸酶活性：取3块96孔培养板，实验分组及金属浓度同细胞增殖实验，分别定向培养至1，3，5 d，取出检测碱性磷酸酶活性(按照碱性磷酸酶试剂盒说明书进行操作)，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度(A)值，即代表细胞碱性磷酸酶活性。

矿化结节染色：按细胞三维培养方法，将MC3T3-E1细胞以1×10⁷ L^-1的细胞浓度接种在24孔板中，分3组，每组设5个平行复孔，37 ℃、体积分数5%CO₂饱和湿度的细胞孵育箱中培养过夜。次日更换含矿化诱导剂(含 2 nmol/L磷酸甘油钠、50 mg/L维生素C及10 nmol/L地塞米松)的培养基，Cu²⁺组、Fe³⁺组分别加入金属离子Cu²⁺和Fe³⁺工作液，离子终浓度为 1×10^-4 mol/L，对照组加入等量不含血清培养基，每3 d换1次液，观察矿化结节形成情况。作用3周时，先吸走全部培养基，接着用无菌PBS冲洗2次，然后用4 ℃体积分数95%乙醇溶液固定10 min，用去离子水漂洗2次，接着用茜素红溶液，37 ℃下作用30 min，随后弃去染液，PBS洗去浮色，在倒置相差显微镜下观察和摄片。

细胞迁移：将10⁴个MC3T3-E1细胞按三维培养方法，接种于含100 µL培养液(不含血清)的Transwill小室内，分3组，每组6个复孔，Cu²⁺组、Fe³⁺组分别加入终浓度为1×10^-4 mol/L的Cu²⁺和Fe³⁺，对照组加等量无血清培养液；对应24孔板孔位放入600 µL含血清培养液。细胞培养 24 h后，选用结晶紫染色40 min，清水洗净小棉签擦拭小室内侧，置显微镜下观察和摄片。实验重复3次。

1.6 统计学分析采用SPSS Statistics version 21统计软件包，统计分析软件进行单因素方差分析和组间 t检验，P ≤0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨骼是一种刚性而充满活力的器官，其质量约占人体质量的1/5，具有运动、支持、保护、贮存、造血、内分泌等多种重要的生物学功能^[16-17]。骨的吸收是由来源于造血干细胞的破骨细胞完成的^[18-19]，而骨质分泌矿化重建被吸收的骨，依靠来源于间充质干细胞的成骨细胞^[20]，骨代谢的平衡得以依赖于这两类细胞之间的协同作用^[21-22]。

骨代谢失衡会引发多种相关的疾病^[23]，比如骨硬化症、骨质疏松症、关节炎、牙周病等^[24]。口腔正畸的牙齿移动及口腔种植的骨结合等也都与成骨细胞息息相关，并且成骨细胞在生理骨重建和病理骨折中具有重要作用，由此可见成骨细胞有着十分重要的角色^[25]。成骨细胞增殖是由多种生长因子调控的，包括胰岛素样生长因子、表皮生长因子、转化生长因子β、Wnt、血小板源性生长因子及骨形态发生蛋白等^[26]。成熟的成骨细胞可以表达碱性磷酸酶、Osterix、Coll、骨粘连蛋白、骨钙蛋白和骨桥蛋白等^[27]，其中碱性磷酸酶是成骨细胞的早期成熟标志，晚期矿化标志是骨钙素与钙磷等结合形成的结晶^[28]。

已证实细胞许多重要生理代谢活动都与细胞内钙离子浓度有关，且骨骼的正常代谢除与钙离子有关外，还与多种金属离子(如铁、铜、锌、锰等)有关。一系列金属离子参与了骨形成的调控。Yamaguchi等^[29]研究了硫酸锌对MC3T3-E1细胞成骨相关基因表达的影响，结果显示硫酸锌显著上调Runx2、OPG和CaM mRNA表达水平，而对OCN、COL-Ia、IGF-I、TGF- p1、ZIP 1和G3PDH的mRNA表达没有影响。

作者此次实验选用小鼠颅顶前骨细胞细胞株MC3T3-E1 ^[30-31]，是因为其具有体外培养成骨细胞的各种生物学特性，包括碱性磷酸酶活性、Ⅰ型胶原合成和基质矿化等^[32]，是一种良好的体外培养成骨细胞株，现己成为研究成骨细胞有价值的体外细胞模型。选择在自组装功能性RADA16-NBD水凝胶中培养，是因为自组装功能性水凝胶RADA16-NBD，不但维持了单纯RADA16多肽水凝胶原本具有的“立体稳定”三维培养效果，又提高了氧气和物质运输至其内种植的MC3T3-E1细胞^[33]，模拟了最真实体内细胞的生存环境，更增加了实验的可靠性、准确性、真实性。

Cell Counting Kit-8细胞增殖及细胞毒性检测盒(简称CCK-8)，是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性检测的快速高灵敏度试剂盒^[34]。此次实验CCK-8结果表明，Cu²⁺和Fe³⁺能促进成骨细胞MC3T3- E1的增殖，而Cu²⁺能显著促进成骨细胞增殖，并且随着时间的推移，Cu²⁺与Fe³⁺的有效性降低，说明两种金属离子对细胞增殖的促进作用有一定的时效性。总体来说，Cu²⁺在一定时间内对成骨细胞增殖有明显的促进作用，而Fe³⁺对其的作用不及Cu²⁺。

碱性磷酸酶是成骨细胞所分泌的一种同源二聚体糖蛋白，在骨和牙齿等矿化组织形成中起着重要作用，其表达的强度是识别和评价成骨细胞分化程度的早期特异性标志^[35]，通过测定碱性磷酸酶活性，可以反映其骨分化能力^[36-37]。深入点说，碱性磷酸酶可催化分解有机磷酸释放无机磷^[38]，使局部无机磷酸的浓度增高，促进矿化，所以碱性磷酸酶活性升高可为细胞间质含量改变做好准备，并且是启动矿化的必备条件^[39-40]。

实验中碱性磷酸酶检测及茜素红染色结果表明，Cu²⁺对成骨细胞碱性磷酸酶活性有较显著促进作用，且效果明显强于Fe³⁺，随时间的延长作用逐渐增强，表现出时间依赖效应。Cu²⁺组茜素红染色灶状结节明显多与金属离子Fe³⁺组。以上情况表明，相较于Fe³⁺，Cu²⁺可较好地提高MC3E3-E1细胞的骨分化能力，能促进成骨细胞合成和分泌碱性磷酸酶，具有较明显的促进成骨细胞分化作用。

Transwill小室底模为膜孔径为5 µm具有半透性的聚碳酯膜，位于上室的细胞可以穿过聚碳酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量多少对比，可以反映所用试剂对细胞迁移能力影响的大小。实验结果显示，加入Cu²⁺的分组穿过聚碳酯膜进入下室的细胞数目远大于加入Fe³⁺的分组，说明Cu²⁺对细胞的迁移能力趋化作用要明显强于Fe³⁺。

实验充分证明，Cu²⁺、Fe³⁺都有促进成骨细胞增殖、分化及迁移的作用，且Cu²⁺效果优于金Fe³⁺。实验检测的是Cu²⁺、Fe³⁺对成骨细胞的直接作用，其作用机制仍需进一步探讨，作者认为金属离子在不久的将来会在牙科、骨科领域得到广泛应用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

金属离子Cu²⁺、Fe³⁺对水凝胶RADA16-NBD培养条件下成骨细胞生长与分化的影响

Effect of Cu²⁺ and Fe³⁺ on osteoblast growth and differentiation in hydrogel RADA16-NBD

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