退变性腰椎侧凸发病中Hsa-let-7f调控白细胞介素10/STAT3信号通路的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.15.014

摘要/Abstract

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文题释义：

非编码小RNA：非编码RNA(Non-coding RNA)是指不编码蛋白质的RNA。其中包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA 和microRNA 等多种已知功能的 RNA，还包括未知功能的RNA。这些RNA的共同特点是都能从基因组上转录而来，但是不翻译成蛋白，在RNA 水平上就能行使各自的生物学功能了。非编码RNA分类：从长度上来划分可以分为3类：小于50 nt，包括microRNA，siRNA，piRNA；50-500 nt-包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，SLRNA，SRPRNA 等等；大于500 nt，包括长的mRNA-like 的非编码RNA，长的不带polyA 尾巴的非编码RNA等等。

背景：microRNAs(miRNAs)在多种疾病中扮演重要的角色，对退变性腰椎侧凸患者椎间盘中miRNAs表达谱的分析，有助于揭示其发病机制，为其治疗提供新的靶点。假设miRNA通过调控白细胞介素10/STAT3(椎间盘退变的一个潜在炎症通路)信号通路促使椎间盘退变。

目的：比较退变性腰椎侧凸患者与正常对照组椎间盘组织中miRNAs表达谱的差异，确定退变性腰椎侧凸特异性相关的miRNAs，并对其进行功能验证。

方法：对获取的退变性腰椎侧凸患者手术髓核组织和腰椎骨折患者正常髓核组织依次进行总RNA提取，其中，各取10例进行miRNA Solexa测序筛查，挑选表达有差异的microRNA。随后，采用qRT-PCR技术对其进行验证。对表达显著差异的miRNA进行探究。进一步对其进行功能验证，确定其与Ⅱ型胶原表达的关系。运用Western与荧光素酶报告系统进一步确定靶基因。

结果与结论：与正常对照相比，30条miRNA表达存在显著差异(16条表达上调和14条表达下调)。随后进行qRT-PCR验证，与正常对照相比，Hsa-let-7f在退变性腰椎侧凸患者椎间盘组织中，表达显著下调。此外，Hsa-let-7f表达水平与椎间盘退变评分密切相关。高表达Hsa-let-7f促进Ⅱ型胶原表达。敲除白细胞介素10后，对Ⅱ型胶原表达表达类似与过表达Hsa-let-7f。生物信息学软件证实，白细胞介素10为Hsa-let-7f理论上的靶基因。荧光素酶报告系统及western blot进一步证实Hsa-let-7f的靶基因为白细胞介素10。此外，Hsa-let-7f影响其下游基因STAT3及基质金属蛋白酶2基因表达。研究表明，下调的Hsa-let-7f通过调控白细胞介素10/STAT3信号通路，导致椎间盘组织中Ⅱ型胶原的丢失，进而引起椎间盘退变及退变性腰椎侧凸；Hsa-let-7f可成为治疗退变性腰椎侧凸的一个新的生物治疗靶点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-2465-2017(王磊)

关键词: 组织构建, 骨组织工程, 退变性腰椎侧凸, Hsa-let-7f, 白细胞介素10, 测序技术, 发病机制

Abstract:

BACKGROUND: MicroRNAs (miRNAs) play an important role in a variety of diseases. Investigation of miRNA expression profile in degenerative lumbar scoliosis is beneficial for understanding its pathogenesis, providing a novel therapeutic target. Therefore, we tested the hypothesis that miRNAs promote intervertebral disc degeneration through the interleukin-10/STAT3 signaling pathway, a potential regulator of intervertebral disc degeneration.
OBJECTIVE: To compare the differentially expressed miRNAs in the intervertebral disc tissues from patients with degenerative lumbar scoliosis and normal controls and to identify specific miRNAs in degenerative lumbar scoliosis followed by functional validation.
METHODS: An initial screening of miRNA expression in nucleus pulposus tissues by miRNA Solexa Sequencing was performed in samples from 10 patients with degenerative lumbar scoliosis and 10 controls, respectively. Subsequently, differentially expressed miRNAs were validated using qRT-PCR. The level of differentially expressed miRNAs in degenerative nucleus pulposus tissues was investigated. Then, functional analysis of the miRNAs in regulating type II collagen expression was carried out. Western blot and luciferase reporter assay were used to further confirm the target gene.
RESULTS AND CONCLUSION: We identified 30 miRNAs that were differentially expressed (16 upregulated and 14 downregulated) in patients with degenerative lumbar scoliosis compared with controls. Following qRT-PCR confirmation, Has-let-7f was significantly down-regulated in degenerative nucleus pulposus tissues as compared with controls. Moreover, its level was correlated with the severity of disc degeneration. Overexpression of Has-let-7f promoted type II collagen expression in nucleus pulposus cells. Knockout of interleukin-10 induced effects on nucleus pulposus cells similar to Has-let-7f. Bioinformatics target prediction identified interleukin-10 as a putative target of Has-let-7f. Furthermore, luciferase reporter assays demonstrated that Has-let-7f altered the expression of STAT3 and matrix metalloproteinase-2. These findings indicate that the downregulation of Has-let-7f induces type II collagen loss by directly targeting inleukin-10, thereby resulting in intervertebral disc degeneration and degenerative lumbar scoliosis. Has-let-7f is likely to be a novel therapeutic target for degenerative lumbar scoliosis.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Scoliosis, MicroRNAs, Interleukin-10, Tissue Engineering

王磊，李天旺，刘建强，刘晓宗，王照国，田艳，张永兴，王伟. 退变性腰椎侧凸发病中Hsa-let-7f调控白细胞介素10/STAT3信号通路的作用[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(15): 2225-2232.

Wang Lei, Li Tian-wang, Liu Jian-qiang, Liu Xiao-zong, Wang Zhao-guo, Tian Yan, Zhang Yong-xing, Wang Wei. Downregulated Hsa-let-7f contributes to the loss of type II collagen by targeting interleukin-10/STAT3 signaling pathway in degenerative lumbar scoliosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(15): 2225-2232.

图/表（结果） 4

2.1 miRNA芯片结果 Solexa测序结果显示，968条miRNAs被检测，123条microRNA表达在病例组与对照组中存在差异，其中59条miRNAs表达上调和64条表达下调。满足以下条件的miRNA被进一步研究^[15]：①拥有20倍值复制率。②变化倍值大于2或小于0.5。③P < 0.05。基于上述标准，30条miRNAs，其中16条表达上调、14条表达下调被选中进一步研究。将差异性表达microRNA进行系统聚类分析，其结果中每一行代表一个基因，每一列代表一个样品，黄色代表高表达，蓝色代表低表达，从而更直观、全面地展示了样品之间的关系及差异情况(图1A)。

2.2 差异性表达的microRNA大样本量验证结果运用qRT-PCR进一步验证候选的30条miRNAs。此步骤分2个阶段，即测试阶段与验证阶段。在测试阶段，运用10例病例组与10例对照组(此前用来Solexa测序筛查)验证芯片结果是否可靠。只有当miRNAs满足下述条件，即变化倍值大于2或小于0.5且P < 0.01被选择进一步研究。基于上述标准，miR-142-5p、miR-661、Hsa-let-7f、miR-149-5p及miR-10a-5p在病例组与对照组中表达存在显著差异。

在验证阶段，运用63例病例与51例对照组来检测miR-142-5p、miR-661、Hsa-let-7f、miR-149-5p及miR-10a-5p表达水平。仅Hsa-let-7f表达水平与测试阶段一致，即Hsa-let-7f表达水平显著降低(图1B)，且其表达水平与椎间盘退变程度密切相关(r=-0.629，P < 0.000 1)(图1C)。

2.3 Hsa-let-7f促进Ⅱ型胶原表达转染实验结果显示，运用空白对照、Hsa-let-7f mimic、mimic control、Hsa-let-7f inhibitor及inhibitor control转染髓核细胞，转染效率均很高(图2A)。qRT-PCR显示Hsa-let-7f mimic能够大幅度促进Ⅱ型胶原表达(图2B)。

2.4 Hsa-let-7f靶基因验证 TargetScan、PITA、miRanda及PicTar生物软件预测分析靶基因结果显示，白细胞介素10为Hsa-let-7f理论上的靶基因，即Hsa-let-7f与白细胞介素10的3’UTR(位置140-146)结合(图3A)。

为了验证Hsa-let-7f与白细胞介素10之间的直接关系，作者运用荧光素酶报告系统，即含有3’UTR野生型(WT)与突变型(MUT)白细胞介素10，验证其结果。结果表明，在WT 3’UTR白细胞介素10中，Hsa-let-7f mimic可降低荧光素酶活性，而在MUT 3’UTR白细胞介素10中，不能降低荧光素酶活性(图3B)。该结果得到基因与蛋白表达结果进一步证实。正如图3C，D显示，Hsa-let-7f mimic可降低白细胞介素10 mRNA、蛋白表达。

此外，白细胞介素10敲除后，对Ⅱ型胶原表达的影响类似与Hsa-let-7f mimic(图4A，B)，进一步证实白细胞介素10为Hsa-let-7f下游的靶基因。

2.5 Hsa-let-7f通过白细胞介素10/STAT3信号通路发挥作用为了探究Hsa-let-7f是否通过白细胞介素10/STAT3信号通路影响Ⅱ型胶原的表达，作者检测白细胞介素10/STAT3的主要靶基因，即基质金属蛋白酶2。过表达Hsa-let-7f可降低p-STAT3、基质金属蛋白酶2。相比之下，高表达白细胞介素10可增加p-STAT3、基质金属蛋白酶2的表达量(图4C-E)。这些结果表明，Hsa-let-7f调控白细胞介素10/STAT3参与退变性腰椎侧凸的发病机制。

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引言

目前，随着国内人口迅速的老龄化及生活方式的转变，退变性腰椎侧凸(degenerative lumbar scoliosis，DLS)逐渐增多，严重影响患者的生活质量，给家庭与社会带来沉重的经济负担^[1-6]。尽管手术治疗能够获得满意的矫形效果，手术所带来的巨大创伤不容忽视。因此，对退变性腰椎侧凸发病机制的探究，采取有效的预防措施具有重大的社会现实意义。

研究显示，椎间盘退变是退变性腰椎侧凸的始动因素，导致退变性腰椎侧凸发展的重要原因是椎间盘-终板不对称退变、塌陷、椎体楔形变、双侧关节突关节的骨性关节炎等。炎症因子与IDD(intervertebral disc degeneration)病理生理过程密切相关。炎症因子网络调控失衡，上调基质金属蛋白酶家族和带有血小板凝血酶敏感蛋白样模体的解整链蛋白金属蛋白酶家族(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTs)，加剧细胞外基质降解，下调细胞外基质合成相关基因的表达，诱导细胞凋亡及神经、血管的长入，介导一系列疼痛相关临床症状^[7-10]。但目前关于炎症因子在IDD病理生理过程中的具体调控机制还不清楚，进一步的研究重点将在于弄清炎症因子在IDD中的调控机制，对IDD的基因治疗及寻找相关炎症因子及其相关信号通路治疗靶点上，为其将来的临床应用提供依据。

越来越多的证据表明椎间盘髓核细胞的凋亡受新近发现的非编码小RNA，即miRNAs的调控^[11-14]。miRNAs广泛参与蛋白表达的调控，在机体的多种生理和病理过程中发挥重要的作用，但是目前对其在椎间盘退变中的表达谱及发挥的作用知之甚少。阐明上述问题将进一步了解椎间盘退变过程中凋亡的增加及免疫失衡机制，明确miRNA在退变性腰椎侧凸患者椎间盘退变中的作用，并有可能为临床上治疗退变性腰椎侧凸提供新的视野。因此，此次研究通过筛选退变性腰椎侧凸患者椎间盘组织中差异性表达的miRNAs，目的是：①探究参与退变性腰椎侧凸发病机制的miRNAs。②探讨差异表达的miRNA调控其炎症信号通路参与退变性腰椎侧凸发病的具体分子机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计 miRNA功能研究。

1.2 时间及地点试验于2009年2月至2013年6月在解放军第252医院脊柱外科完成。

1.3 对象

试验组：取材于本院脊柱外科退变性腰椎侧凸患者术中切除的椎间盘组织，共63例，男26例，女37例，年龄58-79岁。其中L_4/5椎间盘27例，L₅/S₁椎间盘36例。试验组标本中10例用于Solexa测序筛选研究。

对照组：取材于腰椎爆裂性骨折患者行前路减压髓核切除术中切除的正常髓核组织块，共51例，男23例，女28例，年龄18-21岁。其中L_1/2椎间盘9例，L_3/4椎间盘15例，L_4/5椎间盘27例。对照组中10例用于Solexa测序筛选实验。

1.3.1 诊断标准根据临床症状和体征、X射线片、CT、MRI表现诊断为退变性腰椎侧凸。

1.3.2 纳入标准 ①试验组患者均符合退变性腰椎侧凸的诊断标准。②对照组患者腰椎间盘无影像学退变改变，年龄低于23岁。

1.3.3 排除标准 ①患者既往体健，排除肿瘤、感染、类风湿关节炎、强直性脊柱炎和干燥综合征等自身免疫性疾病。②近期进行免疫抑制剂治疗的患者。

1.4 材料

退变性腰椎侧凸椎间盘组织差异性表达mRNA筛选实验用试剂与仪器：
试剂与仪器	来源
青或链霉素、高糖DMEM培养基	Gibco公司，美国
体积分数为10%的胎牛血清、EDTA、Ⅱ型胶原酶、Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶	Sigma公司，美国
HWC-52型恒温水浴箱	上海天平仪器厂
CO₂培养箱	Hera-cell公司，德国
恒温摇床	Heidolph公司，德国
Trizol试剂	Invitrogen公司，美国
microRNA芯片	Exiqon，丹麦
microRNA qPCR引物	GeneCopoeia公司，美国
实时定量PCR检测仪	ABI7900，美国

1.5 方法

1.5.1 髓核细胞的分离与培养将髓核组织用含有青霉素和无青霉素的D-Hanks液各冲洗3遍；用剪刀剪碎髓核组织，37 ℃下用为0.25%的胰蛋白酶和0.2%的Ⅱ型胶原酶联合消化50 min，每5 min轻轻摇动1次，收集消化液，1 000 r/min离心5 min，去除上清液。用DMEM/F12培养液吹匀细胞，再次离心，重复3次。用计数板进行细胞计数，按1×10⁶接种于底面积为25 cm²培养瓶中，加入5 mL含青霉素100 U/mL、体积分数为10%的胎牛血清的DMEM/F12培养液。37 ℃、体积分数为5%的CO₂培养箱中培养。每两三天换液1次，90%融合后用0.25%的胰酶消化并按1∶2比例传代。采用第2代细胞进行研究。

1.5.2 Hsa-let-7f模拟物、抑制物载体构建及双荧光报告素酶系统 Hsa-let-7f mimic、mimic control、Hsa-let-7f inhibitor、inhibitor control及阴性对照购于Dharmacon (Chicago，IL，USA)；Hsa-let-7f模拟物被转染入髓核细胞(Dharmacon，Austin，TX，USA)。根据说明书操作，运用0.4 μg报告载体、0.2 μg pGL-3对照载体及阴性对照共转染髓核细胞。24 h后，采用双荧光报告素酶系统(Promega，WI，USA)检查细胞。荧光素活性被确定，所有的转染实验重复3次。

1.5.3 髓核组织中总RNA分离采用TRIzol和RNeasy mini kit (Qiagen，Valencia，CA，USA)试剂按产品说明书操作完成。随后，RNA溶解在50 μL水中。运用NanoDrop ND-1000分光光度计(NanoDrop Technologies， Wilmington，DE，USA)测量提取的miRNA浓度。

1.5.4 Solexa测序将抽提的总RNA进行Solexa测序。首先是将DNA断裂成100-200bp大小，再将接头连接到DNA片段上，经PCR扩增后形成DNA片段文库。随后在含有接头的芯片(flow cell)上将已加入接头的DNA片段绑到flow cell上，经PCR反应，将不同片段扩增。在下一步反应中，4种荧光标记的染料用边合成边测序的原理，在每个循环过程里，荧光标记的核苷和聚合酶被加入到单分子阵列中。互补的核苷和核苷酸片段的第一个碱基配对，通过酶加入到引物上，多余的核苷被移走。每个单链DNA分子通过互补碱基的配对被延伸，利用生物发光蛋白，比如萤火虫的荧光素酶，可通过碱基加到引物后端时所释放出的焦磷酸盐来提供检测信号。针对每种碱基的特定波长的激光激发结合上的核苷的标记，这个标记会释放出荧光。荧光信号被CCD采集，CCD快速扫描整个阵列检测特定的结合到每个片段上的碱基。通过上述的结合，检测可以重复几十个循环，就有可能决定核苷酸片段中的几十个碱基。

1.5.5 数据校正和差异探针筛选首先需要对测序得到的筛选结果进行原始数据预处理和归一化，以消除实验随机误差对数据分析带来的影响；使用稳定多阵列分析(robust multi-array analysis，RMA)归一化方法得到校正后的信号值。应用Gene Cluster 3.0和TreeView软件(斯坦福大学，美国)对表达基因做系统聚类分析，以全面、直观地展示样品之间的关系及差异情况。计算两个样品间校正后的信号值的比值，即实验组荧光强度/对照组荧光强度；以2为阈值进行差异microRNA的筛选，倍数变化比值> 2为上调microRNA，倍数变化比值< 0.5为下调microRNA。

1.5.6 差异表达的miRNAs的qRT-PCR验证及白细胞介素10、STAT3、pSTAT3、基质金属蛋白酶2及Ⅱ型胶原定量对芯片筛选出来的表达有差异的miRNAs扩大样本量进一步验证其可靠性。qRT-PCR反应体系：1 μL cDNA、0.3 μL Taq酶、0.33 μL TaqMan探针(ABI公司提供，专用于miRNA荧光定量)、1.2 μL 25 mmol/L MgCl₂、0.4 μL 2.5 mmol/L各种dNTP混合物、2 μL 10 x PCR缓冲液以及14.77 μL DEPC水。以U6 snRNA与GAPDH作为内参，数据采用2^-^??^CT法进行分析(CT值定义为每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数)，实验重复3次。

1.5.7 Western blot法检测髓核细胞中GAPDH、白细胞介素10 各组细胞培养72 h后，收集各组细胞并裂解，提取总蛋白，分光光度计测定蛋白浓度后，各组取50 μg蛋白分别进行十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE)凝胶电泳进行分离，Western blot法检测GAPDH、白细胞介素10的表达，凝胶成像分析系统分析杂交带的吸光光度值。

1.6 主要观察指标 ①miRNA芯片结果。②差异性表达的microRNA大样本量验证结果。③Hsa-let-7f促进Ⅱ型胶原表达。④Hsa-let-7f靶基因验证结果。⑤Hsa-let-7f通过白细胞介素10/STAT3信号通路发挥作用结果。

1.7 统计学分析数据分析采用SPSS 17.0(SPSS Inc，Chicago，IL)及GraphPad Prism 5(Graph Pad Software，Inc，La Jolla，California，USA)软件进行，非参数Mann-Whitney检验法或one-way ANOVA进行组间比较。

讨论

MiRNAs是存在于许多生物体内长18-25 nt的一类短序列、非编码、具调控功能的单链小分子 RNA，几乎参与所有生命过程中一系列的重要进程，包括早期发育，细胞增殖、分化与凋亡，物质代谢等。目前已经明确，miRNAs 是通过与其靶mRNA分子的3’端非编码区(3’-UTR)互补结合，在翻译水平上特异性抑制基因表达，在许多疾病的发病中扮演着重要角色^[16-22]。

椎间盘的退变在退变性腰椎侧凸发病机制中起始动因素^[23]。当外源和内源的炎性因子通过细胞膜受体激活细胞内的细胞信号传导通路，改变了细胞核内的基因表达，椎间盘中的重要功能成分，即椎间盘细胞外基质减少，Ⅱ型胶原减少，Ⅰ型胶原增多，蛋白多糖表达显著降低，降解酶类的表达上调，进而引起椎间盘功能丢失及退变性腰椎侧凸的发生与发展^[23]。因此，只有明确介导细胞内基因表达变化的信号传导通道，基因治疗才能有的放矢。本研究首次采用miRNA测序技术对microRNA在退变性腰椎侧凸发病中的可能作用进行研究，在退变性腰椎侧凸患者椎间盘髓核细胞中筛选出30个差异表达miRNAs，其中16个表达上调，14个表达下调，随后，运用qRT-PCR验证芯片结果，显示miR-142-5p、miR-661、Hsa-let-7f、miR-149-5p及miR-10a-5p表达水平显著异常，与芯片结果一致，提示芯片实验结果可靠、可信。进一步扩大样本量验证，仅有Hsa-let-7f表达显著下降。因此，本研究选取Hsa-let-7f进一步研究。

既往众多研究表明，Hsa-let-7f参与细胞的增殖、凋亡及细胞外基质降解等^[18-21]。迄今，Hsa-let-7f在退变性腰椎侧凸发生、发展中的确切机制尚不明确。本研究中，Hsa-let-7f在退变性腰椎侧凸患者椎间盘组织中表达水平显著降低(图1A)，且其与椎间盘退变评分密切相关(r=-0.629，P < 0.0001)(图1B)。当前研究证据表明，Ⅱ型胶原丢失是椎间盘退变的早期表现，因此，探究其表达量对认识退变性腰椎侧凸发病机制将大有帮助。为了进一步探究Hsa-let-7f在退变性腰椎侧凸发病机制中的作用，对其进行功能分析，Hsa-let-7f mimic转染髓核细胞后，Ⅱ型胶原表达显著增加(图2A，B)，这表明椎间盘组织中低表达的Hsa-let-7f促使椎间盘退变，进而促使退变性腰椎侧凸的发生、发展。

值得关注的是，作者运用生物学软件(TargetScan、PITA、miRanda及PicTar)预测Hsa-let-7f的靶基因为白细胞介素10(图3A)，而白细胞介素10在椎间盘退变中扮演着重要的角色，推测Hsa-let-7f调控白细胞介素10在退变性腰椎侧凸的发生、发展中可能起着重要作用。作者研究结果表明，Hsa-let-7f mimic可大幅度降低荧光值，进一步证实白细胞介素10为Hsa-let-7f的靶基因。此外，Hsa-let-7f mimic降低白细胞介素10 mRNA的表达量，此结果得到western blot结果进一步证实(图3B-D)。此外，敲除白细胞介素10后，对Ⅱ型胶原表达的影响类似于Hsa-let-7fmimic(图4A，B)。上述结果表明，白细胞介素10为Hsa-let-7f下游的一个靶基因，有望成为新的治疗靶点。

白细胞介素10在椎间盘退变中发挥着重要的作用，即其过多表达，可促进基质降解酶的高表达，进而引起细胞外基质的降解。此次研究发现，高表达Hsa-let-7f可抑制白细胞介素10及其下游基因(STAT3、pSTAT3及基质金属蛋白酶2)的表达(图4C-E)，表明低表达Hsa- let-7f通过调控白细胞介素10/STAT3信号通路促进椎间盘退变，进而引起退变性腰椎侧凸。

综上所述，作者发现Hsa-let-7f在退变性腰椎侧凸患者的椎间盘组织中呈低表达，且其表达量与椎间盘退变密切相关。此外，Hsa-let-7f通过调控白细胞介素10/STAT3信号通路，参与退变性腰椎侧凸的发生、发展。此次研究的研究结果，可能为临床上寻找退变性腰椎侧凸治疗靶点提供新思路。|
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程