大黄素对骨髓间充质干细胞移植治疗缺血性再灌注肾损伤的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.14.011

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

大黄素：为蒽醌类衍生物，是中药大黄的主要有效成分，其药理作用与大黄有许多相似之处，具有诸多药理学作用：抑制胰酶活性、抗炎、抑菌、免疫调节、保护肝肾、利胆、抗氧化、清除自由基、抑制血小板聚集、改善微循环、降低血液黏度、抗肿瘤等。

肿瘤坏死因子：肾缺血再灌注损伤发生后，机体单核、巨噬系统被过度激活，肿瘤坏死因子mRNA表达明显增高，产生大量肿瘤坏死因子，肿瘤坏死因子是激活的巨噬细胞杀灭病原微生物及肿瘤细胞的主要效应分子，也是重要的炎性递质，在炎症的发生发展中起着多种作用。

背景：已有研究表明大黄素通过抑制炎症因子释放对肠缺血再灌注损伤具有保护作用。

目的：探讨大黄素对骨髓间充质干细胞移植治疗缺血性再灌注肾损伤的作用。

方法：40只SD大鼠随机分为5组(n=8)：假手术组、缺血再灌注组、骨髓间充质干细胞组、大黄素低剂量干预组、大黄素高剂量干预组。除假手术组外，其余4组建立大鼠肾缺血再灌注损伤模型。造模后骨髓间充质干细胞组下腔静脉注射1 mL骨髓间充质干细胞悬液，大黄素低剂量干预组与高剂量干预组术前7 d内每天灌胃大黄素30 mg/kg和60 mg/kg，后续处理与骨髓间充质干细胞组一致。再灌注6 h后，苏木精-伊红染色法检测肾组织病理改变，实时荧光定量PCR检测肿瘤坏死因子α，白细胞介素6和白细胞介素18以及TLR2和TLR4 mRNA表达水平，免疫印迹法检测COX-2，ICAM-1，iNOS蛋白表达水平。

结果与结论：①缺血再灌注后可见大量小管上皮脱落，间质有炎性细胞浸润；骨髓间充质干细胞组可见部分小管上皮细胞脱落，部分间质有炎细胞浸润；药物低剂量干预组与高剂量干预组肾小管管腔几乎完整，少量间质有炎细胞浸润；②与假手术组相比，缺血再灌注组肿瘤坏死因子α，白细胞介素6，白细胞介素18以及TLR2，TLR4 mRNA表达水平显著升高(P < 0.05)，COX-2，ICAM-1，iNOS蛋白表达水平也显著升高(P < 0.05)；骨髓间充质干细胞组上述各因子表达明显低于缺血再灌注组(P < 0.05)；大黄素低剂量干预组与高剂量干预组的降低程度更为显著，且与大黄素剂量相关；③结果表明，大黄素具有促进骨髓间充质干细胞改善大鼠缺血性再灌注肾损伤的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0003-0580-9987(李忠)

关键词: 干细胞, 移植, 大黄素, 骨髓间充质干细胞, 缺血性再灌注肾损伤, 肿瘤坏死因子α, 白细胞介素6, 白细胞介素18, TLR2, TLR4, COX-2, ICAM-1, iNOS

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that emodin protects against intestinal ischemia-reperfusion injury by inhibiting the release of inflammatory factors.

OBJECTIVE: To investigate the effect of emodin on renal ischemia/reperfusion injury after bone marrow mesenchymal stem cell transplantation.

METHODS: Forty Sprague-Dawley rats were randomized into five groups (n=8 per group): sham group, model group (renal ischemia/reperfusion injury group), bone marrow mesenchymal stem cell group (cell transplantation group), low-dose emodin group, high-dose emodin group. Rats in the latter four groups were pretreated with or without different concentrations (30 and 60 mg/kg) of emodin for 7 days, and then were subjected to clamping bilateral renal pedicles for 45 minutes, followed by injection of 1 mL bone marrow mesenchymal stem cell suspension. Six hours after reperfusion, the pathological changes of renal tissues were examined by hematoxylin-eosin staining; the mRNA levels of tumor necrosis factor α, interleukin-6, interleukin-18, TLR2 and TLR4 detected by real-time fluorescence quantitative PCR; and the protein expression of COX-2, ICAM-1 and iNOS determined by western blot.

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the sham group, rats in the model group showed obvious features of severe acute tubular damage and inflammatory cell infiltration. In the cell transplantation group, tubular epitheliael cells were partially lost with some inflammatory cells infiltrated in the renal interstitium. In the emodin groups, the tubular lumen was practically intact with little renal interstitial inflammatory cells. Compared with the sham group, a significant increase in the mRNA levels of tumor necrosis factor α, interleukin-6, interleukin-18, TLR2 and TLR4 as well as in the protein levels of COX-2, ICAM-1 and iNOS was found in the model group (both P < 0.05). However, bone marrow mesenchymal stem cell transplantation attenuated this ischemia/reperfusion-induced increase in the expression of the above-mentioned factors (P < 0.05). Furthermore, the effects of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation were further augmented by pretreatment with emodin in a dose-dependent manner. These findings suggest that emodin can enhance the protective effects of bone marrow mesenchymal stem cells on renal ischemia/reperfusion injury.
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Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Reperfusion Injury, Kidney, Emodin, Tissue Engineering

李忠. 大黄素对骨髓间充质干细胞移植治疗缺血性再灌注肾损伤的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(14): 2052-2058.

Li Zhong. Emodin effects on renal ischemia/reperfusion injury after bone marrow mesenchymal stem cell transplantation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(14): 2052-2058.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析 40只SD大鼠均进入结果分析，无脱落。

2.2 肾组织病理改变苏木精-伊红染色结果显示，假手术组肾小管基底膜结构均匀，肾小管管腔完整，间质无水肿、充血(图1A)；缺血再灌注组可见大量小管上皮细胞脱落和空泡变性，间质有炎性细胞浸润，浑浊肿胀(图1B)；骨髓间充质干细胞组可见肾小管基底膜部分连续，均匀，部分小管上皮细胞脱落，刷状缘消失，部分管腔内可见管型，间质有炎性细胞浸润(图1C)；大黄素低剂量干预组和大黄素高剂量干预组肾小管管腔几乎完整，腔内无管型，间质有少量炎性细胞浸润(图1D，E)。

2.3 炎性细胞因子肿瘤坏死因子α，白细胞介素6和白细胞介素18 mRNA表达水平在缺血再灌注肾损伤中，炎性因子肿瘤坏死因子α，白细胞介素6和白细胞介素18具有非常重要的作用。与假手术组相比，缺血再灌注组大鼠肾组织中肿瘤坏死因子α，白细胞介素6和白细胞介素18 mRNA表达最高；给予骨髓间充质干细胞静脉注射后，发现肿瘤坏死因子α，白细胞介素6和白细胞介素18 mRNA表达明显低于缺血再灌注组组(P < 0.05)；大黄素给药后，肿瘤坏死因子α，白细胞介素6和白细胞介素18 mRNA显著低于骨髓间充质干细胞组，且剂量越大降低程度越明显，见图2。

2.4 免疫印迹法检测COX-2，ICAM-1，iNOS蛋白表达水平发生缺血再灌注损伤后，COX-2，ICAM-1，iNOS蛋白表达水平显著高于假手术组(P < 0.05)；与缺血再灌注损伤组相比，骨髓间充质干细胞组和大黄素低剂量干预组COX-2，ICAM-1，iNOS蛋白表达水平显著下降(P < 0.05)，大黄素高剂量干预组COX-2，ICAM-1，iNOS蛋白表达水平下降得更为显著(P < 0.05)；大黄素高剂量干预组COX-2，ICAM-1，iNOS蛋白表达水平显著低于骨髓间充质干细胞组和大黄素低剂量干预组(P < 0.05)，见图3。

2.5 qPCR检测TLR2和TLR4 mRNA表达水平与假手术组相比，缺血再灌注组中TLR2和TLR4 mRNA表达显著升高(P < 0.05)；骨髓间充质干细胞组和大黄素低剂量干预组中TLR2和TLR4 mRNA表达水平显著低于缺血再灌注组(P < 0.05)，而大黄素高剂量干预组TLR2和TLR4 mRNA表达水平下降得更为显著(P < 0.05)；大黄素高剂量干预组TLR2和TLR4 mRNA表达水平显著低于骨髓间充质干细胞组和大黄素低剂量干预组(P < 0.05)，见图4。

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引言

缺血再灌注损伤主要指缺血一段时间后血液供应回流产生的组织损害，以及进一步程度加重和功能恶化的病理生理过程。在临床上常见于肾移植、失血性休克、肠道缺血和器官移植^[1-4]。由于肾脏组织结构和功能的特殊性，对缺血性再灌注损伤的影响最为敏感，肾脏组织缺血性再灌注损伤是临床研究的热点与难点。一般临床数据表明急性肾损伤患者占总住院人数的7%-10%^[5]。

干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，根据细胞表面标志物与细胞因子的不同表达区分为细胞学和功能学干细胞^[6]。Kim等^[7]研究发现，啮齿动物的肾脏皮质和外髄交界处或内髄质中存在类似干细胞或祖细胞的细胞，它们具有修复受损肾小管上皮细胞的能力。国外学者观察发现肾缺血再灌注后肾小管内皮细胞受损严重，移植肾小管内皮细胞至缺血性再灌注损伤裸鼠后，肾功能损伤得到良好的恢复。在ROSA位点转基因(ROSA26)小鼠的肾缺血再灌注模型中，移植造血干细胞可以分化为肾小管上皮细胞^[8-9]。Togel等^[10]研究发现，移植骨髓间充质干细胞后，缺血再灌注肾损伤明显减轻，进一步发现骨髓间充质干细胞的保护作用主要是通过旁分泌细胞因子，抑制受损组织细胞凋亡、促进受损组织细胞增殖、抗炎症反应以及抑制损伤部位引发炎症的相关细胞增殖和迁移等^[11-12]。

大黄素是蒽醌类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤和清除自由基的作用^[13-14]。有报道指出，大黄素对脑、肝、肠等器官的缺血再灌注损伤具有保护作用^[15-16]。实验探讨大黄素是否能协同促进骨髓间充质干细胞对缺血性再灌注肾损伤的治疗作用，为临床缺血性再灌注肾损伤治疗带来新思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2015年2至12月在南阳理工学院张仲景国医学院药理实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物健康雄性Sprague-Dawley大鼠50只，6-8周龄，SPF级，体质量(230±20) g，由广东中医药大学医学部提供，于室温(22±1) ℃，相对湿度(60± 10)%的条件下饲养，自由进食，饮水，12 h/12 h昼夜循环定时照明。

1.3.2 实验试剂大黄素(Emodin)购自中国药品生物制品鉴定所；二甲基亚砜购自美国Sigma公司；苏木精-伊红染色试剂盒购自南京建成生物工程研究所；COX-2抗体、ICAM-1抗体购自北京博奥森公司；iNOS、GAPDH抗体购自美国Santa Cruz公司；总蛋白试剂盒购自江苏碧云天生物技术研究所；Trizol试剂购自Ambion公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的分离培养随机抽取10只健康大鼠作为供体，以颈椎脱臼法处死后，在无菌条件下分离胫骨和股骨，用体积分数为75%乙醇洗去多余组织，剪去两侧骨端，用注射器抽取DMEM培养液反复冲洗股骨和胫骨骨腔，收集至离心管中，制成细胞悬液，2 000 r/min离心10 min，取沉淀用含体积分数为15%胎牛血清的培养液重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-¹，接种于培养瓶中，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中培养，每2 d或3 d换液1次，待细胞铺满瓶底约90%时进行传代，取第3代生长良好的细胞进行后续实验。

1.4.2 动物建模与分组 40只SD大鼠随机分为5组(n=8)：缺血再灌注组、骨髓间充质干细胞组、大黄素低剂量干预组、大黄素高剂量干预组、假手术组。依据参考文献[17]报道建立缺血再灌注肾损伤大鼠模型。10%水合氯醛腹腔注射(100 mg/kg)麻醉，仰卧位固定，沿腹中线开腹，游离肾蒂并用无损伤动脉夹钳夹双侧肾动脉，45 min后松开动脉夹，关腹。假手术组仅接受腹中线开腹，双侧肾蒂游离，45 min后关腹。造模成功后，骨髓间充质干细胞组下腔静脉注射1 mL骨髓间充质干细胞悬液(细胞浓度1×10⁹ L^-¹)；大黄素低剂量干预组与高剂量干预组分别在术前7 d内每天灌胃大黄素30 mg/kg和60 mg/kg，术后下腔静脉注射1 mL骨髓间充质干细胞悬液；缺血再灌注组术前7 d内每天以等体积的空白溶剂灌胃，术后下腔静脉注射等量生理盐水。

1.4.3 苏木精-伊红染色再灌注6 h后，分离大鼠肾脏，40 g/L多聚甲醛固定，室温放置24 h，梯度乙醇(体积分数为75%，85%，95%，100%)脱水各2 h，石蜡包埋。切片后，固定于载玻片上，烘干，加入二甲苯(Ⅰ)(Ⅱ)浸泡10 min，加入梯度乙醇水化(体积分数为100%，95%，85%，75%)各5 min，加入PBS浸洗5 min，苏木精染色，盐酸乙醇分化，0.2%氨水返蓝，伊红染色，再次用乙醇脱水3 min，二甲苯(Ⅰ)(Ⅱ)(Ⅲ)透明5 min，中性树胶封固，显微镜下观察组织形态。

1.4.4 实时荧光定量PCR(qPCR) 再灌注6 h后，取各组大鼠肾脏组织，按照Trizol说明书提取总RNA，反转录合成cDNA，采用PCR仪进行扩增，所用引物序列见表1。扩增条件：95 ℃ 20 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 45 s，共32个循环，74 ℃延伸3 min。所得结果直接在荧光定量操作系统中进行比较分析，目标基因的相对定量用2^-^??Ct表示。

1.4.5 免疫印迹法检测相关蛋白表达再灌注6 h后，取各组大鼠肾脏组织，用蛋白裂解液提取肾组织总蛋白，检测蛋白浓度。取等量裂解产物，加入4倍上样缓冲液进行12%SDS-PAGE电泳。电转至硝酸纤维素膜上，脱脂牛奶室温封闭2 h，加入一抗4 ℃孵育4 h，TBST漂洗3次，每次5 min；再加入相对应二抗室温孵育2 h，TBST洗涤3次，每次5 min，化学发光法显色凝胶成像系统扫描灰度值进行分析。

1.5 主要观察指标 ①肾组织病理改变。②肿瘤坏死因子α，白细胞介素6和白细胞介素18 mRNA表达水平。③COX-2，ICAM-1，iNOS蛋白表达水平。④TLR2和TLR4的mRNA表达水平

1.6 统计学分析数据采用SPSS 17.0统计软件进行分析，全部实验结果采用x(_)±s表示，应用t 检验对两样本均数间进行比较；组间差异应用单因素方差分析(ANOVA)，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

缺血再灌注损伤是指组织缺血后的再灌注不能缓解组织损伤，反而加重组织结构破坏和代谢障碍，其可能的机制有氧自由基生成、能量代谢障碍、炎性递质含量和活性改变等。苏木精-伊红染色结果提示大黄素能够有效地加强骨髓间充质干细胞对肾小管结构破坏的保护，并进一步降低早期阶段的炎性细胞浸润和炎症反应强度，提示大黄素具有促进骨髓间充质干细胞对缺血再灌注诱导的肾损伤的保护作用，为大黄素用于临床治疗提供了理论依据。

缺血性再灌注诱导的肾损伤，通常出现在肾移植或肾血管的手术过程中，产生的炎症反应会加剧急性肾损伤^[18]。在早期阶段，肾缺血、氧气供应减少会导致肾血管内皮功能受损，产生炎症反应和炎性细胞浸润^[19-20]。多项实验表明，在缺血性脑、肝脏、肠道和肾疾病中，炎性细胞因子表达显著增多^[21-23]。肿瘤坏死因子α具有抑制和杀伤肿瘤细胞的功能，并促进白细胞介素1和白细胞介素6的分泌，进而诱导炎症反应。研究指出，肿瘤坏死因子α参与体液免疫、自身免疫等多种免疫活动，当机体组织受到损伤后，损伤部位的肿瘤坏死因子α表达量显著升高^[24]。肿瘤坏死因子α与白细胞介素6在免疫反应中起重要作用，当其过量时，会造成组织和细胞损伤。有报道指出，在急性肾损伤引起的急性肺损伤中，白细胞介素6的表达量升高^[25]。白细胞介素18是巨噬细胞、树突状细胞等分泌的细胞因子。白细胞介素18作为干扰素γ的诱导因子，在调节免疫方面具有重要的作用。实验发现缺血性再灌注肾损伤大鼠肾组织中肿瘤坏死因子α，白细胞介素6和白细胞介素18 mRNA表达水平显著升高，与报道相符。另外，还发现大黄素能够增强骨髓间充质干细胞降低肿瘤坏死因子α，白细胞介素6和白细胞介素18 mRNA表达的作用，且与剂量相关，提示大黄素可能具有抑制炎性因子肿瘤坏死因子α，白细胞介素6和白细胞介素18表达的作用。

COX-2参与炎性反应，过量的前列腺素和COX-2能够加剧炎症反应并促进肾缺血再灌注损伤。有研究指出，缺血再灌注肾损伤3-5 h后组织内的COX-2表达量达到最高值，抑制COX-2表达能够保护缺血再灌注损伤时的肾结构和功能^[26]。ICAM-1是一种广泛分布于平滑肌细胞、白细胞及上皮细胞等表面的黏附分子，在缺血缺氧、氧化应激等病理条件下表达显著升高。iNOS在稳态下极少表达，只有在组织缺血缺氧及某些细胞因子刺激时才高表达。研究指出，iNOS的表达能够加剧肾缺血再灌注损伤，抑制过量的一氧化氮合成可降低缺血再灌注诱导的肾损伤^[27-28]。实验研究发现，骨髓间充质干细胞可降低缺血再灌注肾损伤时COX-2，ICAM-1，iNOS蛋白表达水平，大黄素随剂量增高而增强骨髓间充质干细胞对COX-2，ICAM-1，iNOS蛋白表达水平的降低作用。

TLRs是Ⅰ型跨膜蛋白受体，通过对不同病原分子的识别与结合，从而引发一系列信号转导，进而导致炎性递质的释放。TLR2与TLR4 mRNA主要在肾小管上皮细胞中表达^[29]。TLR2是引起缺血再灌注肾损伤的重要炎症反应启动因子。缺血后TLR4的表达显著增加，表明TLR4信号途径在缺血再灌注肾损伤中起主导作用^[30-31]。实验发现，缺血再灌注损伤组TLR2与TLR4 mRNA表达显著升高，符合上述报道结果。大黄素能够进一步促进骨髓间充质干细胞对TLR2与TLR4 mRNA表达的降低作用，提示其作用可能与Toll样受体信号通路有关。

综上所述，大黄素具有促进骨髓间充质干细胞改善缺血再灌注诱导的肾脏结构功能损害的作用，并有效地抑制缺血肾组织的炎症反应，其机制可能与Toll样受体信号通路有关。
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