胆囊收缩素促进损伤腓总神经的再生：前瞻、随机、对照临床试验

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.11.016

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

胆囊收缩素：是一类长短不同的分子的总称，其化学本质是肽，广泛分布于消化系统、中枢及外周神经系统、外周血液及一些组织器官中，并以神经递质或神经调质的形式参与多种生理及病理过程。目前胆囊收缩素在神经系统中的作用越来越引起人们的重视，被学术界认为是参与神经保护和修复的一种重要的内源性的神经保护因子。
腓总神经损伤：常因外伤引起，主要表现为足下垂，走路呈跨越步态；踝关节不能背伸及外翻，足趾不能背伸；小腿外侧及足背皮肤感觉减退或缺失；胫前及小腿外侧肌肉萎缩；电生理检查和超声检查可为诊断和治疗方案提供参考依据。

背景：胆囊收缩素作为一种内源性的神经保护因子，在神经系统中的作用越来越引起人们的重视。前期动物实验发现胆囊收缩素能有效促进周围神经损伤再生，在此基础上进一步进行临床试验，观察局部应用胆囊收缩素处理神经吻合口能否促进周围神经再生。

方法/设计：前瞻性随机对照试验。招募腓总神经完全断裂患者100例，随机分为2组，均行神经缝合后局部明胶海绵浸润不同药物包绕吻合处，试验组药物为8 nmol/kg胆囊收缩素，对照组为生理盐水。治疗后6，12，24周随访，检测腓总神经传导速度和肌电图、神经纤维形态，末次随访评估临床疗效，并记录患者随访期间所有的不良事件，评估治疗的有效性和安全性。

讨论：基于临床应用的思路，将胆囊收缩素作为神经生长因子合成诱导剂加以观察性研究，以期为寻找周围神经治疗药物提供一个新思路。

伦理批准：试验方案已经莆田学院附属医院医学伦理委员会批准，批件文号：2014116。受试者对试验方案知情同意，接受治疗前签署“知情同意书”。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ORCID: 0000-0001-9441-3014(陈宣煌)

关键词: 组织构建, 组织工程, 胆囊收缩素, 周围神经损伤, 腓总神经, 神经再生, 随机对照, 临床试验

Abstract:

BACKGROUND: Cholecystokinin as an endogenous neuroprotective factor in the nervous system has garnered increasing attention. Findings from previous animal studies show that cholecystokinin can effectively promote the regeneration of the injured peripheral nerve. On this basis, further clinical trials will be performed to observe whether local application of cholecystokinin at nerve anastomosis can promote peripheral nerve regeneration.
METHODS/DESIGN: As a prospective randomized controlled trial, this study will enroll 100 patients with complete rupture of the peroneal nerve, who will be randomly divided into two groups: after nerve suture and partial gelatin sponge infiltration at nerve anastomosis, the patients will be treated with 8 nmol/kg cholecystokinin (treatment group) or saline (control group). At 6, 12, 24 weeks after treatment, common peroneal nerve conduction velocity and electromyography and nerve fiber morphology will be detected; the clinical efficacy at the last follow-up will be assessed; and all adverse events during the follow-up will be recorded to assess the therapeutic efficacy and safety.
DISCUSSION: In this study, cholecystokinin as an inducing agent for nerve growth factor synthesis will be observed and studied, with a view to providing a new idea for seeking peripheral nerve therapy.
ETHICAL APPROVAL: The study protocol was approved by the Medical Ethics Committee of the Affiliated Hospital of Putian University (approval No. 2014116). Written informed consent will be obtained from patients before treatment.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

陈宣煌，郑锋，张国栋，李荣议，林海滨，郑祖高，蔡涵华. 胆囊收缩素促进损伤腓总神经的再生：前瞻、随机、对照临床试验[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(11): 1623-1629.

Chen Xuan-huang, Zheng Feng, Zhang Guo-dong, Li Rong-yi, Lin Hai-bin, Zheng Zu-gao, Cai Han-hua . Cholecystokinin promotes regeneration of the injured common peroneal nerve: study protocol for a prospective, randomized, controlled clinical trial[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(11): 1623-1629.

图/表（结果） 2

参考文献

[1] 李培建,李兵仓.周围神经损伤的修复及基因治疗[J].创伤外科杂志,.2002,4(l):59-61.

[2] Noble F, Wank SA, Crawley JN,et al.International Union of Pharmacology. XXI. Structure, distribution, and functions of cholecystokinin receptors.Pharmacol Rev. 1999;51(4):745-781.

[3] D'Angelo L, Castaldo L, Cellerino A, et al.Nerve growth factor in the adult brain of a teleostean model for aging research: Nothobranchius furzeri.Ann Anat. 2014; 196(4):183-191.

[4] Sofroniew MV, Howe CL, Mobley WC.Nerve growth factor signaling, neuroprotection, and neural repair.Annu Rev Neurosci. 2001;24:1217-1281.

[5] 路青林,刘庆胜,李志,等.神经节苷脂神经生长因子促进周围神经再生的实验研究[J].生物骨科材料与临床研究, 2007,4(2):40-42．

[6] D'Angelo L, Castaldo L, Cellerino A, et al.Nerve growth factor in the adult brain of a teleostean model for aging research: Nothobranchius furzeri.Ann Anat. 2014; 196(4):183-191.

[7] Sun XJ, Lu QC, Cai Y.Effect of cholecystokinin on experimental neuronal aging.World J Gastroenterol. 2005;11(4):551-556

[8] Katsuura G, Shinohara S, Shintaku H, et al.Protective effect of CCK-8 and ceruletide on glutamate-induced neuronal cell death in rat neuron cultures: possible involvement of CCK-B receptors.Neurosci Lett. 1991; 132(2):159-162.

[9] Eigyo M, Katsuura G, Shintaku H,et al.Systemic administration of a cholecystokinin analogue, ceruletide, protects against ischemia-induced neurodegeneration in gerbils.Eur J Pharmacol. 1992; 214(2-3):149-158.

[10] 梁卫兰,熊晖,母得志,等.八肽胆囊收缩素对神经细胞缺氧的作用[J].中华围产医学杂志,2000,3(2):120-123.

[11] 杨世方,凌亦凌,凌毅群,等.中枢八肽胆囊收缩素对大鼠局部脑缺血/再灌注损伤的影响[J].中国病理生理杂志, 2003, 19(4):472-476.

[12] 李德生,许百男,王世波,等.八肽胆囊收缩素抑制大鼠脊髓损伤后诱导型一氧化氮合酶的表达[J].中国临床康复, 2005,9(9):24-27.

[13] 韦鹏,凌亦凌,牛志云,等.八肽胆囊收缩素对内毒素休克时大脑皮质损伤的影响及其机制初探[J].河北医科大学学报,2004,25(4):225-226.

[14] Tirassa P, Stenfors C, Lundeberg T,et al. Cholecystokinin-8 regulation of NGF concentrations in adult mouse brain through a mechanism involving CCK(A) and CCK(B) receptors.Br J Pharmacol. 1998; 123(6):1230-1236.

[15] Xanthos DN, Kumar N, Theodorsson E,et al.The roles of nerve growth factor and cholecystokinin in the enhancement of morphine analgesia in a rodent model of central nervous system inflammation. Neuropharmacology. 2009; 56(3):684-691.

[16] Manni L, Lundeberg T, Tirassa P,et al. Cholecystokinin-8 enhances nerve growth factor synthesis and promotes recovery of capsaicin-induced sensory deficit.Br J Pharmacol. 2000;129(4):744-750.

[17] 陈宣煌,李荣议,张国栋,等.胆囊收缩素促坐骨神经再生的可能机制[J].中国组织工程研究,2014,18(11):1700-1705.

[18] 陈宣煌,林海滨,吴献伟,等.胆囊收缩素促大鼠坐骨神经再生的初步研究[J/CD].中华临床医师杂志:电子版, 2011, 5(24):7242-7247.

[19] 陈宣煌,郑祖高,占鲤生,等.胆囊收缩素对大鼠坐骨神经损伤后修复的影响[J].南昌大学学报(医学版),2012,52(7): 4-7.

[20] Tirassa P, Manni L, Aloe L, et al.Cholecystokinin-8 and nerve growth factor: two endogenous molecules working for the upkeep and repair of the nervous system.Curr Drug Targets CNS Neurol Disord. 2002; 1(5):495-510.

[21] Tirassa P, Costa N.CCK-8 induces NGF and BDNF synthesis and modulates TrkA and TrkB expression in the rat hippocampus and septum: Effects on kindling development.Neurochem Int. 2007; 50(1):130-138.

引言

1 试验设计 Study design

1.1 试验设计类型前瞻性、随机、对照临床试验。

1.2 试验设计的描述研究为前瞻性、完全随机设计、双盲、单一中心、对比分析的临床试验。

1.3 试验地点中国，福建省莆田市，莆田学院附属医院骨科。

2 学术背景及理论基础 Academic background and theoretical basis

2.1 前言目前周围神经损伤的治疗仍然是临床难题之一，药物治疗是周围神经损伤修复治疗的重要措施，对于没有手术适应证或是手术治疗后的周围神经损伤，药物治疗都是必不可少的。目前临床上常用的药物疗效有限，尚缺乏既能促进损伤神经快速修复与生长，又能保证再生神经纤维功能的有效药物。

随着细胞生物化学和分子生物学的飞速发展，人们试图从神经生长发育的基础研究中，寻找出促进周围神经再生的规律和影响因素，借此指导临床实践。纯修复神经连续性的治疗效果不理想，结合应用促神经修复的药物，其效果明显提高。周围神经离断损伤后能否成功修复，关键取决于是否具有适合神经生长再连接的微环境和神经元的活力^[1]。因此选择既能保护神经元、又能改善周围神经再生微环境的治疗药物非常必要。

2.2 背景研究神经生长因子是目前惟一研究最透彻、最肯定的神经细胞生长调节因子^[2-3]，而在损伤后的局部微环境中来源于许旺细胞和体液中的神经生长因子浓度过低，远不足以维持神经元胞体的存活，且人工合成的神经生长因子半衰期短，在水溶液中活性丢失快，易受温度、酸碱度等多种因素影响^[4-6]。所以，在探讨神经生长因子广阔应用前景的同时，也有许多学者在寻找神经生长因子合成诱导剂方面不断开拓思路。

胆囊收缩素(Cholecystokinin，CCK)是1928年Ivy和Oldberg等根据小肠抽提液可刺激狗胆囊收缩而发现的，是一类长短不同的分子的总称，其化学本质是肽，有八肽胆囊收缩素(CCK-8)和CCK-58等多种分子形式，而八肽胆囊收缩素是表现全部药理作用最充分，具有胆囊收缩素完全功能的最小活性片段。

近年来，胆囊收缩素在神经系统中的作用越来越引起人们的重视。Sun等^[7]研究表明八肽胆囊收缩素可增加神经生长相关蛋白、钙结合蛋白、细胞色素C等神经元保护蛋白含量。Katsuura等^[8]、Eigyo等^[9]发现胆囊收缩可拮抗Glu的神经毒性作用。梁卫兰等^[10]证实八肽胆囊收缩素还可通过提高抑制性神经递质γ-氨基丁酸(GABA)能神经元来保护神经细胞。有作者检测到八肽胆囊收缩素可抑制大脑皮质诱导型一氧化氮合酶活性、NO、丙二醛含量升高及超氧化物歧化酶活性下降^[11-13]。还有研究者证明胆囊收缩素与神经生长因子共同参与周围神经元的存活和再生，不仅能促进神经生长因子蛋白及mRNA合成增加，促进去甲肾上腺能神经恢复，而且还能促进神经肽Y、脑源性神经营养因子的合成^[14-16]。以上研究多集中在中枢神经系统(脑、脊髓)的基础医学领域，试验基于临床应用的思路，将胆囊收缩素作为神经生长因子合成诱导剂加以研究，把其用于腓总神经损伤，以期为寻找周围神经治疗药物提供一个新思路。

2.3 前期实验介绍前期已完成了胆囊收缩素促进动物周围神经损伤再生的实验^[17-19]：首先制备大鼠坐骨神经单侧离断伤模型，造模成功后随机分为2组，实验组腹腔注射八肽胆囊收缩素，对照组腹腔注射等剂量生理盐水，分3个时间点观察。用药1周时免疫组化检测神经生长因子蛋白表达、诱导型一氧化氮合酶水平、细胞凋亡率、血清超氧化物歧化酶和丙二醛浓度；术后4，12周，行大鼠行为学和坐骨神经再生指标的检测，坐骨神经再生指标包括坐骨神经功能指数恢复率、神经电生理、组织学形态、再生有髓神经纤维计数恢复率及腓肠肌湿质量、肌纤维面积恢复率。结果发现胆囊收缩素能有效促进坐骨神经再生，其可能机制包括保护神经元、抗细胞凋亡、抑制炎性反应、抗NO及氧化反应、抗丙二醛减轻自由基损伤及刺激神经生长因子表达和释放。

2.4 研究的理论依据研究显示八肽胆囊收缩素可以使神经细胞突起和微突起数量明显增加，并且可延长突起存留时间，增加神经生长相关蛋白、钙结合蛋白、细胞色素C等神经元保护蛋白含量；可拮抗谷氨酸的神经毒性作用；可显著降低缺氧引起的神经细胞损伤^[7]。胆囊收缩素能通过促进活体内神经生长因子及神经生长因子mRNA的合成，抑制诱导型一氧化氮合酶表达、调控超氧化物歧化酶、脂质过氧化反应最终代谢产物丙二醛的含量，清除自由基等机制保护神经元，改善神经生长的微环境，发挥对损伤神经保护和修复的作用^[11]。因此，胆囊收缩素在神经系统中的作用越来越引起人们的重视，学术界似乎倾向于认可胆囊收缩素是参与神经保护和修复的重要物质，并把其看作一种内源性的神经保护因子^[20-21]。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

3 研究目的 Study purpose

3.1 主要目的在前期动物实验的基础上，进行临床研究，观察局部应用胆囊收缩素处理神经吻合口对腓总神经完全断裂伤患者神经再生的作用。

3.2 次要目的观察腓总神经完全断裂伤患者局部应用胆囊收缩素处理神经吻合口后的疗效及安全性。

4 试验人群的选择 Recruitment

4.1 入选标准纳入研究患者应符合以下标准：

(1)腓总神经损伤患者。

(2)腓总神经损伤为完全断裂伤。

(3)患者年龄20-50岁。

(4)患者及家属对治疗及试验方案知情同意。

4.2 排除标准含以下任意一项即排除：

(1)陈旧性腓总神经损伤。

(2)腓总神经卡压伤。

(3)患者全身状态差不能耐受手术。

(4)药物成瘾(包括毒、麻药和酒精成瘾)。

(5)具有传染性的病毒感染。

(6)代谢性疾病(痛风、风湿病等)。

(7)体质量指数> 30 kg/m²。

(8)妇女怀孕期或哺乳期。

(9)有心理精神疾患，不能配合康复治疗者。

4.3 治疗间歇或停止患者可以因以下任何原因退出/提前停止研究：

(1)发生较严重的不良事件。?

(2)出现严重并发症或排异反应。

此时应进行患者的最后评估，并应在病例报告表的适当页上对提前停止研究给予记录。对于因不良事件而退出试验的患者，研究者须对其进行随访。

5 干预方法 Interventions

5.1 治疗方法

(1)麻醉生效后，在伤口或切口内分离出腓总神经两断端，修整对齐后，根据神经外膜营养血管走行及断面神经束的解剖形态对合神经束，防止其扭曲错位，作外膜缝合，打结松紧适宜。

(2)术后治疗组局部明胶海绵浸润胆囊收缩素 (8 nmol/kg)包绕吻合处，对照组局部明胶海绵浸润生理盐水包绕吻合处，分别逐层关闭伤口或切口。

5.2 康复方法

(1)术后对所有患者的患肢进行石膏固定，维持腓总神经非张力状态4周。

(2)术后72 h开始物理治疗，术后1周鼓励患者主动锻炼伤肢其他功能，增强主动控制收缩相应肌肉的意识.

(3)术后应用神经营养药时间、疗程、剂量均一致，同样给予针灸、理疗、经皮电刺激治疗及功能康复训练。

5.3 不良事件观察有无手术及药物相关不良事件。

6 研究设计 Study protocol

6.1 研究设计概要研究为前瞻性、完全随机设计、对比分析临床试验，为双盲、单一中心试验。

6.2 受试者分组的方法应用计算机由统计学软件产生随机编码，对患者进行随机分组，无论患者还是参与研究的医生都不能选择患者所在组别。

6.3 设盲及破盲随机方案编写好后,使用不透光的信封进行方案隐藏，并上锁保存。研究为双盲试验，患者、医生及评估者均不知道患者的分组。

如果遇到紧急情况，如严重的排斥反应或患者需要紧急抢救时，可破盲，该患者应计入脱落病例，不纳入疗效分析，但如有不良反应则计入不良反应分析。

6.4 治疗计划进行腓总神经两断端对接缝合，局部明胶海绵浸润胆囊收缩素包绕吻合处，以生理盐水为对照。术后进行康复功能锻炼，并随访24周。

6.5 试验步骤

6.5.1 患者招募由医生、研究者及研究助理负责招募

受试者，进行约谈和筛选。

6.5.2 入院治疗行神经缝合后局部明胶海绵浸润不同药物包绕吻合处。

6.5.3 术后第6周第1次随访。

6.5.4 术后第12周第2次随访。

6.5.5 术后第24周第3次随访，研究结束。

6.6 受试者在治疗和评估时的退出如果患者因严重并发症或排异反应在完成研究方案指定的评估前停止研究，则被视为退出。

6.7 试验流程图见图1。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

8 不良事件 Adverse events

8.1 安全性建立不良事件及严重不良事件处理的标准操作规程，确保研究过程中患者出现的任何不良反应都能得到及时处理，保障受试者权益。

8.2 定义

8.2.1 不良事件受试者接受神经缝合术及局部应用胆囊收缩素后出现的不良医学事件，但不一定与治疗有因果关系。

8.2.2 不良事件的程度将不良事件的程度分为一般不良事件、重要不良事件及严重不良事件3类。

8.2.3 与局部应用胆囊收缩素的关系不良事件时与神经吻合口局部应用胆囊收缩素关系的判断标准，分为“肯定有关、可能有关、可能无关、无关和无法判定”5级。

8.2.4 严重不良事件试验过程中发生需住院治疗、延长住院时间、伤残、影响工作能力、危及生命或死亡等事件。

8.3 不良事件收集时间至研究结束，收集所有不良事件并汇总。

8.4 记录与报告医师做好不良事件的记录，包括不良事件的描述，发生时间，终止时间，程度及发作频度，是否需要治疗，如需要，记录给予的治疗。

发生严重不良事件时，除了采取必要的治疗措施以外，应在24 h内如实分别向当地食品药品监督管理局和国家食品药品监督管理局报告，并及时向伦理委员会报告，并在报告上注明日期，严重不良事件处理结束后，应提交受试者情况的后续报道。

8.5 发生非严重和严重不良事件受试者的跟踪观察非严重不良事件发生应密切连续观事件的转归。严重不良事件发生转归或距发生之日相隔30 d，需填报随访报告或总结报告。

9 统计方法 Statistical analysis

9.1 研究假设所有假设检验均为双侧检验，P < 0.05认为差异有显著性意义。对基线数据进行组间可比性评价，在α =5%水平上进行双尾统计学检验。

9.2 病例数根据预实验结果，总病例数选定为100例，每组50例，共2组。

9.3 试验分析数据统计工作使用统计软件SPSS 21.0完成。计量资料以x(_)±s描述；计数资料以百分率(%)表示。计数资料组间比较采用卡方检验，计量数据组间比较采用t 检验，非参数变量的组间比较采用秩和检验。

9.4 统计分析计划由不参与试验的专业统计人员完成实验数据的统计分析。在所有数据录入、审核完毕后，统计人员应及时完成统计分析工作，并出具书面统计分析报告。

10 行政部分 Administrative management

10.1 包装和标签试验应用的胆囊收缩素由美国sigma公司提供，生理盐水由莆田学院附属医院提供，两种药物的包装和外观一致，标签的名称为临床研究用药，分A药，B药，并注明规格包装、用法用量、有效期及提供单位。

10.2 受试药物的保存及分发由专人进行受试药物的保存及分发，医生和患者不能了解患者所用药物。

10.3 数据质量保证 ①研究者认真填写病例报告表(CRF表)，保证准确无误。②监察员定期确认所有的数据记录、报告正确完整，与原始记录一致，及时送至数据管理员处。③数据管理员对CRF表作进一步检查，发生疑问时，填写疑问表(query form)返回监察员，通知研究者作出回答。④由2个数据录入员分别将数据双份输入计算机数据库中。⑤利用软件将两份独立的数据文件进行对比，并对照CRF表进行修改核对。

11 总条款和协议 Terms and conditions

11.1 科研审查委员会由福建省莆田学院批复，同意开展胆囊收缩素局部应用促进外周神经恢复研究。

11.2 本研究的伦理指导由莆田学院附属医院医学伦理委员会进行审核。

11.3 受试者资料和同意本临床试验经莆田学院附属医院伦理委员会批准，批件文号2014116。所有患者及其家属均对治疗方法、临床试验的方法及风险完全知情，同意参与本临床试验，并签署“知情同意书”。研究符合《赫尔辛基宣言》。

11.4 受试者资料的保密受试者参加试验及个人试验资料为个人隐私，受试者的全名不会出现在所有记录及文件中，患者姓名用拼音缩写表示。

11.5 研究数据的保密临床试验数据包括书面数据和电子版数据两种形式，电子版数据必须由专门计算机储存，设定开机密码，由资料管理员专人操作和管理；书面数据存放于固定地点并加锁，钥匙由资料管理员和研究室负责人保管。

11.6 资料存档所有原始资料由文档管理员专人完整保存，同时复制一份电子版资料，以方便使用。

11.7 文章发表研究结束后，由主要研究者编写研究总结报告，研究报告中将包括研究目的描述、研究中所使用的方法以及结果和结论，并投稿。

11.8 研究结束最后一次随访后，汇总不良事件及严重不良事件的处理及报告、数据管理与数据统计的报告，发表研究结果，开临床试验结束会议，结束临床试验。

12 试验数据记录 The test data record

12.1 彩超观察术后不同时间高频彩色多普勒超声仪检查腓总神经，见神经断端缝合后早期，可见神经连续性完整，但两端不同程度水肿，并呈淡红色充血状。随着时间的延长，水肿逐渐减轻，明胶海绵吸收，试验组神经断端周围血管网逐渐清晰，神经周径趋于正常，外膜光滑，与周边组织间界限清楚，回声均匀；对照组神经神经血管网仍较模糊，外膜增厚，走形稍弯曲，与周边组织粘连明显，部分回声不均匀。

12.2 神经运动传导速度见表3。

12.3 肌电图恢复情况术后12周检测肌电图恢复情况，试验组50例中优18例，良18例，可14例，有效率100%，优良率72%；对照组50例中优12例，良14例，可14例，差10例，有效率80%，优良率52%。试验组有效率和优良率均高于对照组(P < 0.05)。

12.4 临床疗效情况术后24周评估临床疗效，试验组50例中痊愈36例，显效10例，进步4例，治愈率72%，总有效率100%；对照组50例中痊愈25例，显效13例，进步10例，无效2例，治愈率50%，总有效率96%。试验组治愈率和总有效率均高于对照组(P < 0.05)。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程