基质细胞衍生因子1促进骨髓干细胞增殖：200 μg/L为最佳质量浓度

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.10.005

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (10): 1402-1408.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.10.005

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基质细胞衍生因子1促进骨髓干细胞增殖：200 μg/L为最佳质量浓度

彭伟¹，秦媛²，廖春晖³，陈松龄⁴

中山大学附属第一医院，¹口腔科，⁴口腔颌面外科，广东省广州市 510080；²第四军医大学附属口腔医院急诊与综合临床科，陕西省西安市 710032；³广州市妇女儿童医疗中心口腔科，广东省广州市 510623

收稿日期:2016-01-23 出版日期:2016-03-04 发布日期:2016-03-04
通讯作者: 陈松龄，博士，教授，中山大学附属第一医院口腔颌面外科，广东省广州市 510080
作者简介:彭伟1，秦媛2，廖春晖3，陈松龄4(中山大学附属第一医院，1口腔科，4口腔颌面外科，广东省广州市 510080；2第四军医大学附属口腔医院急诊与综合临床科，陕西省西安市 710032；3广州市妇女儿童医疗中心口腔科，广东省广州市 510623
基金资助:
国家自然科学基金(81371111)；广东省自然科学基金(2014A030313059)

Stromal cell derived factor-1 promotes the proliferation of bone marrow stem cells: the optimal concentration is 200 μg/L

Peng Wei¹, Qin Yuan², Liao Chun-hui³, Chen Song-ling⁴

¹Department of Stomatology, ⁴Department of Oral and Maxillofacial Surgery, the First Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China; ²Department of Emergency and Clinical Medicine, Hospital of Stomatology, Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China; ³Guangzhou Women and Children’s Medical Center, Guangzhou 510623, Guangdong Province, China

Received:2016-01-23 Online:2016-03-04 Published:2016-03-04
Contact: Chen Song-ling, M.D., Professor, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, the First Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
About author:Peng Wei, Master, Physician, Department of Stomatology, the First Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81371111; the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. 2014A030313059

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

骨髓干细胞的免疫学特征：①表达组织相容性复合物Ⅰ而不表达组织相容性复合物Ⅱ，且缺乏共刺激因子的表达，免疫原性较弱。②能直接或间接抑制T细胞的功能，同时对CD4⁺和CD8⁺淋巴细胞也有抑制作用。③具有免疫调节的功能。

基质细胞衍生因子1：是一类对免疫细胞有趋化作用的小分子蛋白，属于CXC趋化因子之一，具有广泛的生物学活性，可以诱导骨髓间充质干细胞向具有牙周膜纤维细胞特性的方向分化。基于以往研究证据，作者推测，基质细胞衍生因子1应用在骨髓干细胞介导的牙周膜再生的组织工程中能够产生积极作用。

背景：基质细胞衍生因子1是一类对免疫细胞有趋化作用的小分子蛋白，具有广泛的生物学活性，对骨髓干细胞和牙周膜细胞都有趋化作用。

目的：观察基质细胞衍生因子1对比格犬骨髓干细胞增殖的影响并探讨最佳质量浓度。

方法：利用100，200，300 μg/L基质细胞衍生因子1对比格犬骨髓干细胞进行干预，MTT比色实验检测骨髓干细胞的增殖情况，筛选出最佳质量浓度，再次采用MTT比色实验检测最佳质量浓度干预后骨髓干细胞的增殖情况。

结果与结论：基质细胞衍生因子1在100，200，300 μg/L时对骨髓干细胞均有促进作用，但200 μg/L与300 μg/L效果更为显著，且这两者差异无显著性意义，因此选择200 μg/L作为最佳质量浓度。相对于空白对照组来说，200 μg/L最佳质量浓度组细胞增殖明显。结果表明基质细胞衍生因子1能促进骨髓干细胞的增殖，且质量浓度为200 μg/L时促增殖作用最显著。 ORCID: 0000-0002-2899-5703 (陈松龄)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 基质细胞衍生因子1, 细胞增殖, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Stromal cell derived factor-1 is a small molecular protein with a wide range of biological activity that can cause immune cell chemotaxis, and it also has a chemotactic effect on bone marrow stem cells and periodontal ligament cells.
OBJECTIVE: To investigate the effect of stromal cell derived factor-1 with different concentrations on the proliferation of bone marrow stem cells and to probe the best concentration.
METHODS: Bone marrow stem cells from beagle dogs were cultured in vitro and stimulated by different concentrations of stromal cell derived factor-1 (100, 200, 300 μg/L). MTT was used to detect the influence of stromal cell derived factor-1 on the proliferation of bone marrow stem cells so as to screen the best concentration of stromal cell derived factor-1. Then, stromal cell derived factor-1 at the best concentrations was used to intervene the bone marrow stem cells, and MTT was used again to detect the proliferation of bone marrow stem cells.
RESULTS AND CONCLUSION: Stromal cell derived factor-1 at concentrations of 100, 200, 300 μg/L could promote the proliferation of bone marrow stem cells, and the effect was more notable at 200 and
300 μg/L but with no significant difference. Therefore, 200 μg/L was considered to be the best concentration of stromal cell derived factor-1 for intervention of bone marrow stem cells. Compared with the blank control group, 200 μg/L stromal cell derived factor-1 could significantly promote the proliferation of bone marrow stem cells. Taken together, stromal cell derived factor-1 can promote the proliferation of bone marrow stem cells, and its best concentration is 200 μg/L.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

彭伟，秦媛，廖春晖，陈松龄. 基质细胞衍生因子1促进骨髓干细胞增殖：200 μg/L为最佳质量浓度[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(10): 1402-1408.

Peng Wei, Qin Yuan, Liao Chun-hui, Chen Song-ling. Stromal cell derived factor-1 promotes the proliferation of bone marrow stem cells: the optimal concentration is 200 μg/L[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(10): 1402-1408.

图/表（结果） 5

2.1 骨髓干细胞形态原代培养24 h后，可见细胞贴壁呈类圆形或多角形，部分细胞呈集落样生长。72 h后，贴壁细胞数量明显增多，多数梭形细胞聚集成团。5 d时细胞相互融合，成片生长(图1A-C)。

经过2次传代后，第2代细胞均为成纤维细胞样细胞，长梭形并带有多个胞浆突起，生长迅速，相互融合成片，局部呈漩涡样。

2.2 细胞表型鉴定流式细胞仪检测结果显示第3代比格犬骨髓干细胞表面抗原表达CD44(+)(54.65%)，CD29(+)(86.15%)，CD45(-)(0.77%)，CD34(-)(2.09%)，见图2。

2.3 成骨诱导分化能力成骨诱导20 d后，大体观察培养板各孔的底部，可以看到成骨诱导组出现针尖样大小的白色颗粒，未诱导组未见白色颗粒。倒置相差显微镜下观察，诱导组的贴壁细胞形成网状结构，生长密集，局部细胞放射状聚集成团，形成多个大小不等的圆形矿化结节。茜素红染色后可见矿化结节呈红色，不透明，部分矿化结节之间相互融合成片(图3A)。

2.4 成脂诱导分化能力成脂诱导10 d后可发现部分细胞变得肥大且胞浆内出现脂滴，为折光度较强的圆形小泡。14 d时大部分细胞变形，内含脂滴。油红O染色可见脂滴红染(图3B)。

2.5 基质细胞衍生因子1对骨髓干细胞的增殖作用

2.5.1 MTT检测不同质量浓度基质细胞衍生因子1对骨髓干细胞的增殖作用从图4可以看到，基质细胞衍生因子1在100，200，300 μg/L时对骨髓干细胞增殖均有促进作用，随着基质细胞衍生因子1质量浓度的增加，细胞增殖作用增强，但到一定质量浓度后，即使再加大基质细胞衍生因子1的质量浓度，细胞增殖也不显著。200 μg/L与300 μg/L质量浓度组差异无显著性意义，因此，选择200 μg/L作为最佳质量浓度。

2.5.2 MTT检测最佳质量浓度时基质细胞衍生因子1对骨髓干细胞增殖作用从图5可以看到，相对于空白对照组来说，加入最佳质量浓度基质细胞衍生因子1后，细胞增殖明显，但是细胞的生长周期类似。

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引言

牙齿再生是口腔科学中的研究热点，其中牙周膜再生作为牙再生中的难点和重点受到广泛关注。目前认为，牙周膜的再生非常困难，如果牙周膜受到破坏，很容易失去抗感染以及自我更新和修复能力。临床上可以看到部分脱位牙病例，由于牙周膜细胞数量和功能的减弱或消失，牙周膜无法再生，虽然根面残余的牙周膜可能暂时幸存，但愈合多半是以固着性粘连完成，牙根会逐渐吸收并被周围骨组织所替代直至丧失。牙周膜再生成功的关键是如何保持或重新获得有活性的牙周膜细胞^[1]，但牙周膜细胞获得相对困难，不易满足临床治疗需要；而骨髓干细胞的获得相对更加便捷，培养方法也简单成熟^[2]。近来Murphy等^[3]发现，骨髓来源的间充质干细胞与牙周膜细胞体外共培养后，可分化为牙周膜纤维细胞，同时获得后者典型的生物学特性，最近国内学者的研究也发现：牙周膜成纤维细胞通过旁分泌机制可以诱导骨髓干细胞向其分化^[4]，这都说明在一定的局部环境中，骨髓中存在着牙周膜细胞、牙槽骨细胞和牙骨质细胞的共同前体细胞，这种多潜能的干细胞即为间充质干细胞，这也为利用骨髓来源的间充质干细胞修复牙周组织提供了新的理论基础。另外，骨髓干细胞有独特的免疫调节作用，能够抑制细胞毒性T淋巴细胞的增殖，即使是已经分化了的间充质干细胞也可抑制T淋巴细胞增殖，同样具有免疫调节作用。

基质细胞衍生因子1(stromal cell derived factor-1，SDF-1)是一类对免疫细胞有趋化作用的小分子蛋白，属于CXC趋化因子之一，具有广泛的生物学活性, 对骨髓干细胞和牙周膜细胞都有趋化作用^[5]。实验采用MTT法，初步研究基质细胞衍生因子1对比格犬骨髓干细胞增殖的影响，探讨基质细胞衍生因子1对比格犬骨髓干细胞增殖影响的最佳浓度，为利用骨髓干细胞促进牙周膜再生提供依据和参考。

材料方法

1.1 设计细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点实验于2012年5月至2013年1月在中山大学光华口腔医学院省重点实验室完成。

1.3 材料 18-24个月龄雄性体健比格犬3只，体质量7.5-9.0 kg，由简阳达硕动物有限公司提供。

1.4 实验方法

1.4.1 比格犬骨髓干细胞的分离培养和鉴定

原代培养及纯化：选取18-24个月龄雄性体健比格犬，全麻下利用骨髓穿刺针抽取比格犬髂骨骨髓，采用梯度密度离心法分离骨髓干细胞，并以差别贴壁法加以纯化；镜下观察细胞合成单层，融合达80%以上时，消化法传代培养。

传代培养：待原代细胞贴壁融合达80%-90%时(一般需7-10 d)，弃培养基，PBS润洗，加入胰酶消化液37 ℃消化3-5 min，倒置相差显微镜观察大部分细胞胞质回缩、细胞间隙增大后，加入完全培养基终止消化，以1︰2的比例传代培养得到第1代细胞，每隔3 d换液1次。倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况，直至贴壁细胞融合，依据前述方法再次传代。以此反复贴壁法纯化比格犬骨髓干细胞。取第2-4代细胞进行后续实验。

鉴定：流式细胞学检测表面抗原标志物CD34、CD29、CD44及CD45的表达。消化收集第2-4代比格犬骨髓干细胞，制成细胞浓度为5×10⁹ L^-¹的单细胞悬液，每管100 μL，PBS洗涤3次，40 g/L多聚甲醛4 ℃固定15 min，弃固定液，PBS洗涤2次，避光分别加入抗犬CD29、CD34、CD44、CD45抗体充分混匀，常温避光孵育30 min，PBS洗涤2次，100 μL PBS重悬细胞，流式细胞仪上机检测，收集及分析数据。

成骨诱导及茜素红染色：消化收集第2-4代比格犬骨髓干细胞，用完全培养基重悬细胞，将细胞浓度调整为6×10⁷ L^-¹，用微量加样枪小心滴加细胞悬液于6孔板上，每孔接种500 μL，补充完全培养基至2 mL，吹打均匀，于37 ℃、体积分数为5% CO₂孵箱培养。接种24 h后，小心弃去培养基，成骨诱导组每孔加入2 mL成骨诱导培养基，对照组仍加完全培养基，继续于37 ℃、体积分数为5% CO₂孵箱培养，每3 d更换1次培养基。诱导20 d后，弃培养基，PBS轻柔润洗2遍，每孔2 mL 40 g/L多聚甲醛固定细胞30 min，弃固定液，PBS轻柔润洗2遍，每孔1 mL茜素红染液，摇床上轻柔匀染5 min，PBS洗两三遍，倒置相差显微镜下观察并采图。

成脂诱导及油红O染色：消化收集第2-4代比格犬骨髓干细胞，用完全培养基重悬细胞，调整细胞浓度为6×10⁷ L^-¹，用微量加样枪小心滴加细胞悬液于6孔板上，每孔接种500 μL，补充完全培养基至 2 mL，吹打均匀，于37 ℃、体积分数为5% CO₂孵箱培养。接种72 h后，小心弃去培养基，成脂诱导组每孔加入2 mL成脂诱导培养基，对照组仍加完全培养基，继续于37 ℃、体积分数为5% CO₂孵箱培养，每3 d更换1次培养基。诱导14 d时，弃去诱导液，PBS轻柔润洗2遍，每孔2 mL 40 g/L多聚甲醛固定细胞30 min，弃固定液，PBS轻柔润洗两三遍，每孔1 mL油红O染色，PBS轻柔漂洗，倒置相差显微镜下观察并采图。

1.4.2 MTT检测基质细胞衍生因子1对骨髓干细胞的增殖作用

MTT检测不同质量浓度基质细胞衍生因子1对骨髓干细胞的增殖作用：消化收集第2-4代比格犬骨髓干细胞，调整细胞浓度为1×10¹⁰ L^-¹，滴加细胞悬液于96孔板上，每孔接种2 μL，补充200 μL培养基，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂孵箱培养，分别加入不同质量浓度的基质细胞衍生因子1 (100，200，300 μg/L)进行干预。于培养的1，3，5，7 d，每天同一时间收集样本(n=10)进行MTT比色实验。每孔更换无血清培养基后加入过滤除菌的5 g/L MTT溶液20 μL，继续37 ℃孵育4 h，终止培养，小心吸弃上清液，加入二甲基亚砜150 μL，室温下将孔板移至微孔振荡器上振荡10 min，使结晶物溶解。选570 nm波长，在全自动酶标仪上测定各孔吸光度值。以时间为横轴，吸光度值为纵轴绘制细胞生长曲线。根据实验结果，基质细胞衍生因子1最佳质量浓度为200 μg/L。

MTT检测最佳质量浓度时基质细胞衍生因子1对骨髓干细胞的增殖作用：实验分组为空白对照组(未加入任何细胞因子)和实验组(加入最佳质量浓度的基质细胞衍生因子1)。具体实验步骤同上。

1.5 主要观察指标 ①比格犬骨髓干细胞形态和表面抗原表达。②比格犬骨髓干细胞的成骨、成脂分化能力。③基质细胞衍生因子1对骨髓干细胞的增殖作用。

讨论

牙齿再生是口腔科学中的研究热点，目前认为，牙周膜的再生非常困难，如果牙周膜受到破坏，很容易失去抗感染以及自我更新和修复能力。近年来，牙周膜干细胞修复牙周缺损已经被证实^[5-6]，但牙周膜干细胞获得相对困难，不易满足临床治疗需要；骨髓干细胞的获得相对更加便捷，培养方法也简单成熟^[4]。骨髓干细胞除具有自我更新和多向分化潜能外，还具有很强的可塑性，在一定的诱导条件下能分化为多种细胞，且取材方便、培养容易、增殖较快。众多体内外实验表明细胞因子可以影响骨髓干细胞移植的微环境^[7-10]，进而影响骨髓干细胞的动员、迁移及分化。最近研究发现将同种异体或异种间充质干细胞通过局部直接注射、蛛网膜下腔移植、动脉移植、静脉移植等途径植入后，在受者体内并未发生免疫排斥，表明骨髓干细胞具有特殊的免疫学特征^[11-12]：①表达组织相容性复合物Ⅰ而不表达组织相容性复合物Ⅱ，且缺乏共刺激因子的表达，因此免疫原性较弱^[13]。②能直接或间接抑制T细胞的功能，同时对CD4⁺和CD8⁺淋巴细胞也有抑制作用^[14]。③具有免疫调节功能^[15]。综合这些原因，骨髓干细胞适合于自体移植，具有对病灶的趋化特性，是良好的转基因治疗靶细胞。基于此，选择骨髓干细胞作为种子细胞。

实验对间充质干细胞的鉴定采用了多数文献提出的标准^[16-17]：①塑料培养板上贴壁。②克隆形成。③表面标志物鉴定。④具有多向分化潜能。表面标志物的检测选择了CD34，CD44，CD29和CD45抗体。以往文献表明间充质干细胞CD34和CD45表达阴性，CD29和CD45表达阳性，这与实验鉴定结果相符。实验送检细胞CD44表达率为52.65%，并非强阳性，分析可能原因如下：①细胞不纯。②用于洗涤的PBS pH值偏小，影响发光。③操作问题等。结合其他鉴定结果表明其干细胞特征，能满足后续实验要求，所以仍采用相同方法获取的细胞进行增殖实验和后续实验。由于缺少更多的标记物鉴定结果，实验获得的细胞被认为是比格犬骨髓干细胞，不加“间充质”更为严谨。

比格犬骨髓干细胞的分离、培养及鉴定方法已十分成熟，目前主要有密度梯度离心法、全血反复贴壁法、流式细胞仪或免疫磁珠分选法，文献报道较多。该实验选择反复贴壁法，原因在于操作简便，减少离心等步骤，降低细胞的污染和损伤风险；与免疫磁珠分选及流式抗体分选这两种方式相比，贴壁法更经济，能够满足实验需要。但是，反复贴壁法的一大缺点是无法获得单克隆来源的干细胞，后者获得的惟一方式是有限稀释克隆法，这样得到的细胞属同一克隆来源，能更好排除干扰因素。有限稀释克隆法获得细胞的效率较低，该实验没有采用此法，因此获得的是多克隆来源的干细胞，通过混合传代来增加细胞的均质性。

骨髓干细胞的分裂增殖受到周围微环境中趋化因子影响。基质细胞衍生因子1是一类对免疫细胞有趋化作用的小分子蛋白，属于CXC趋化因子之一，相对分子质量在8 000-14 000之间，一般分为CXC、CC、C和CX3C这4个家族，具有广泛的生物学活性, 对骨髓干细胞和牙周膜细胞都有趋化作用^[18]。基质细胞衍生因子1受体CXCR4，是一个有7个跨膜结构域的G蛋白耦联受体，在白细胞、CD34⁺造血干细胞及CD34⁺祖细胞表面都有广泛表达^[19]。有研究者将基质细胞衍生因子1α注射到动物颅内神经损伤部位，通过局部提高基质细胞衍生因子1表达，可以趋化干细胞到达颅内，且注射部位可以见到分化的神经细胞，这就提示基质细胞衍生因子1调控干细胞向靶组织的迁移分化，也许是今后研究一个新的思路^[20]。

另外，最近研究表明基质细胞衍生因子1的局部表达增加可以促进骨髓干细胞植入后在损伤位点的迁移^[21]。以往有学者研究证实，损伤部位基质细胞衍生因子1的含量在损伤后5 d开始上升^[22]，这表明在修复初期(出血和炎症反应)，基质细胞衍生因子1的含量通常很低。有研究利用基质细胞衍生因子1的趋化作用，在未植入种子细胞的条件下，在小鼠牙槽窝内植入复合基质细胞衍生因子1的具有牙齿外形的生物材料，检测到有类似牙齿的结构再生^[23]。另外有研究表明，基质细胞衍生因子1可以刺激干细胞增殖，促进细胞Ⅰ型胶原基因表达上调^[24]。那么，在牙周再生模型中，将植入的外源性种子细胞定植在损伤部位，能否通过基质细胞衍生因子1来促进植入干细胞增殖的同时，调控外源性骨髓干细胞的定植和趋化体内干细胞向靶组织的迁移分化并且促进Ⅰ型胶原分泌增加，从而促进牙周膜纤维的重建和再生呢？

实验采用MTT法初步研究基质细胞衍生因子1对比格犬骨髓干细胞增殖的影响。研究结果显示，随着基质细胞衍生因子1质量浓度的增加，对细胞的增殖作用增加，但到一定质量浓度后，即使再加大基质细胞衍生因子1的质量浓度，细胞增殖也不显著。在最佳质量浓度下，基质细胞衍生因子1对比格犬骨髓干细胞增殖的影响非常大。基于以往研究证据，作者推测，基质细胞衍生因子1应用在骨髓干细胞介导的牙周膜再生的组织工程中能够产生积极作用，其对牙周膜再生影响的机制还需要更深入细致的研究。研究结果为利用趋化因子基质细胞衍生因子1促进骨髓干细胞介导牙周膜再生这一过程提供了初步的理论依据和参考。

基质细胞衍生因子1促进骨髓干细胞增殖：200 μg/L为最佳质量浓度

Stromal cell derived factor-1 promotes the proliferation of bone marrow stem cells: the optimal concentration is 200 μg/L

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