富氢水抑制离心运动后骨骼肌线粒体氧化应激和炎症反应

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.29.018

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (29): 4682-4687.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.29.018

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

富氢水抑制离心运动后骨骼肌线粒体氧化应激和炎症反应

王磊¹，刘子泉²，侯伊玲³，葛耀君³

上海工程技术大学体育部，上海市 201620；武警后勤学院附属医院，2救援医学研究所，3胸外科，天津市 300162

出版日期:2015-07-09 发布日期:2015-07-09
通讯作者: 耀君，硕士，副教授，上海工程技术大学体育部，上海市 201620
作者简介:王磊，男，1979年生，江西省赣州市人，汉族， 2011年上海体育学院毕业，硕士，讲师，主要从事运动人体科学研究。
基金资助:
全军重点实验室开放基金(JY1406)

Hydrogen-rich water inhibits mitochondrial oxidative stress and inflammation in the skeletal muscle after eccentric exercise

Wang Lei¹, Liu Zi-quan², Hou Yi-ling³, Ge Yao-jun¹

1Department of Physical Education, Shanghai University of Engineering Science, Shanghai 201620, China;
2Institute of Disaster and Emergency Rescue Medicine, Affiliated Hospital, Logistics University of Chinese People’s Armed Police Force, Tianjin 300162, China;
3Department of Thoracic Surgery, Affiliated Hospital, Logistics University of Chinese People’s Armed Police Force, Tianjin 300162, China

Online:2015-07-09 Published:2015-07-09
Contact: Ge Yao-jun, Master, Associate professor, Department of Physical Education, Shanghai University of Engineering Science, Shanghai 201620, China
About author:Wang Lei, Master, Lecturer, Department of Physical Education, Shanghai University of Engineering Science, Shanghai 201620, China
Supported by:
the Key Laboratory Open Fund of PLA, No. JY1406

摘要/Abstract

摘要：

背景：富氢水能否用于离心运动肌损伤的防护及其相关机制尚不清楚。
目的：观察富氢水对离心运动大鼠骨骼肌线粒体氧化应激及炎症反应的影响，并探讨富氢水作用的相关信号通路。
方法：将40只SD大鼠随机分为对照组、离心运动组、离心运动+生理盐水组和离心运动+富氢水组。后3组大鼠连续5 d进行下坡跑，跑台速度为16-18 m/min，坡度-16°，90 min/d，共5 d。离心运动+富氢水组大鼠在每次运动后即刻腹腔注射饱和富氢水(10 mL/kg)；离心运动+生理盐水组大鼠注射生理盐水。
结果与结论：离心运动同时给予富氢水显著上调Sirtuin-3(Sirt3)表达，提高线粒体膜电位和锰超氧化物歧化酶活性，抑制线粒体活性氧生成和线粒体DNA氧化损伤，降低炎性因子NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3和白细胞介素1β表达。表明富氢水除可直接清除活性氧外，还可通过上调SIRT3表达，提高线粒体能量代谢和抗氧化能力，从而抑制离心运动诱导的线粒体氧化应激和继发的炎症反应，实现骨骼肌保护效应。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 组织工程, 离心运动, 富氢水, 氧化应激, 炎症反应, 线粒体, 活性氧, 抗氧化酶, 骨骼肌

Abstract:

BACKGROUND: It is unclear whether hydrogen-rich water can be used to protect skeletal muscle injury induced by eccentric exercise, as well as the relative mechanism.
OBJECTIVE: To observe the effect of hydrogen-rich water on the mitochondrial oxidative stress and inflammation in rat skeletal muscle after eccentric exercise, and to investigate the relative signaling pathway of hydrogen-rich water.
METHODS: Forty Sprague Dawley rats were randomly divided into four groups: control group, eccentric exercise group, eccentric exercise+saline group, and eccentric exercise+hydrogen-rich water group. Rats in three eccentric exercise groups were exercised on a motor-driven rodent treadmill at a speed of 16-18 m/min and a slope of -16° for 90 minutes per day. Rats in the eccentric exercise+hydrogen-rich water group were subjected to intraperitoneal injection of hydrogen-rich water (10 mL/kg) immediately after exercise; and rats in the eccentric exercise+saline group were administrated with normal saline after exercise. All the interventions lasted for 5 days.
RESULTS AND CONCLUSION: Hydrogen-rich water intervention after eccentric exercise could markedly enhance the mitochondrial Sirtuin-3 expression, improve the mitochondrial membrane potential and activity of manganese superoxide dismutase, down-regulate the mitochondrial reactive oxygen species generation and
mitochondrial DNA oxidative damage, thus inhibiting inflammatory cytokines expression, such as NLRP3 and interleukin-1β. The results indicated that hydrogen-rich saline could directly scavenge reactive oxygen species. In addition, hydrogen-rich water could improve mitochondrial energy metabolism and antioxidant capacity through up-regulation of Sirtuin-3, which in turn inhibits eccentric exercise-induced mitochondrial oxidative stress and secondary inflammation in the skeletal muscle.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Hydrogen, Hyperkinesis, Inflammation, Mitochondria

中图分类号:

R318

王磊，刘子泉，侯伊玲，葛耀君. 富氢水抑制离心运动后骨骼肌线粒体氧化应激和炎症反应[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(29): 4682-4687.

Wang Lei, Liu Zi-quan, Hou Yi-ling, Ge Yao-jun. Hydrogen-rich water inhibits mitochondrial oxidative stress and inflammation in the skeletal muscle after eccentric exercise [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(29): 4682-4687.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析实验纳入大鼠40只，无不能耐受离心运动和富氢水腹腔注射现象，最终有40只大鼠进入结果分析。实验流程见图1。

2.2 骨骼肌线粒体顺乌头酸酶活性及线粒体DNA中8-氧鸟嘌呤脱氧核苷含量与对照组相比，离心运动组和离心运动+生理盐水组大鼠骨骼肌线粒体顺乌头酸酶活性显著降低(P < 0.05)，线粒体DNA中8-氧鸟嘌呤脱氧核苷含量显著升高(P < 0.05)；与离心运动组相比，离心运动+富氢水组比较线粒体顺乌头酸酶活性显著升高(P < 0.01)，线粒体DNA中8-氧鸟嘌呤脱氧核苷含量显著降低(P < 0.05)，见表1。

2.3 富氢水对离心运动大鼠骨骼肌线粒体膜电位及锰超氧化物歧化酶活性与对照组相比，离心运动组和离心运动+生理盐水组线粒体膜电位显著降低(P < 0.05)，离心运
动+富氢水组锰超氧化物歧化酶活性显著升高(P < 0.05)；与离心运动组相比，离心运动+富氢水组线粒体膜电位和锰超氧化物歧化酶活性均显著升高(P < 0.05)，见表2。
2.4 骨骼肌NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3及白细胞介素1β的表达水平与对照组相比，离心运动组、离心运动+生理盐水组和离心运动+富氢水组大鼠骨骼肌NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3及白细胞介素1β表达水平显著升高(P < 0.05，P < 0.01)；与离心运动组相比，离心运动+富氢水组大鼠骨骼肌NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3及白细胞介素1β表达水平显著降低(P < 0.05，P < 0.01)，见图2。
2.5 骨骼肌SIRT3的表达水平与对照组相比，离心运动组和离心运动+生理盐水组骨骼肌SIRT3蛋白表达显著降低(P < 0.05)；与离心运动组相比，离心运动+富氢水组骨骼肌SIRT3蛋白表达显著升高(P < 0.01)，见图3。

参考文献

[1] 刘向东,李阳.一次力竭性离心运动损伤模型大鼠骨骼肌波形蛋白的表达[J].中国组织工程研究,2014,18(18):2880-2885.

[2] Rattray B, Thompson M, Ruell P, et al. Specific training improves skeletal muscle mitochondrial calcium homeostasis after eccentric exercise. Eur J Appl Physiol. 2013;113(2):427-436.

[3] Kullman EL, Campbell WW, Krishnan RK, et al. Age attenuates leucine oxidation after eccentric exercise. Int J Sports Med. 2013;34(8):695-699.

[4] McCarty MF. Potential ghrelin-mediated benefits and risks of hydrogen water. Med Hypotheses. 2015;84(4):350-355.

[5] Ostojic SM, Stojanovic MD. Hydrogen-rich water affected blood alkalinity in physically active men. Res Sports Med. 2014;22(1):49-60.

[6] Wang T, Zhao L, Liu M, et al. Oral intake of hydrogen-rich water ameliorated chlorpyrifos-induced neurotoxicity in rats. Toxicol Appl Pharmacol. 2014;280(1):169-176.

[7] Su N, Wu Q, Liu Y, et al. Hydrogen-rich water reestablishes ROS homeostasis but exerts differential effects on anthocyanin synthesis in two varieties of radish sprouts under UV-A irradiation. J Agric Food Chem. 2014;62(27):6454-6462.

[8] Zhang JY, Song SD1, Pang Q, et al. Hydrogen-rich water protects against acetaminophen-induced hepatotoxicity in mice. World J Gastroenterol. 2015;21(14):4195-4209.

[9] 孙延卿,陈雄生,曹东,等.氢盐水可抑制脊髓缺血再灌注损伤兔模型运动神经元的凋亡[J].中国组织工程研究,2014,18(18): 2861-2866.

[10] Chen M, Cui W, Zhu K, et al. Hydrogen-rich water alleviates aluminum-induced inhibition of root elongation in alfalfa via decreasing nitric oxide production. J Hazard Mater. 2014; 267:40-47.

[11] Tomofuji T, Kawabata Y, Kasuyama K, et al. Effects of hydrogen-rich water on aging periodontal tissues in rats. Sci Rep. 2014;4:5534.

[12] Jing L, Wang Y, Zhao XM, et al. Cardioprotective Effect of Hydrogen-rich Saline on Isoproterenol-induced Myocardial Infarction in Rats. Heart Lung Circ. 2015;24(6):602-610.

[13] Zhang JY, Wu QF, Wan Y, et al. Protective role of hydrogen-rich water on aspirin-induced gastric mucosal damage in rats. World J Gastroenterol. 2014;20(6):1614-1622.

[14] Aoki K, Nakao A, Adachi T, et al. Pilot study: Effects of drinking hydrogen-rich water on muscle fatigue caused by acute exercise in elite athletes. Med Gas Res. 2012;2:12.

[15] Gac M, Bigda J, Vahlenkamp TW. Increased mitochondrial superoxide dismutase expression and lowered production of reactive oxygen species during rotavirus infection. Virology. 2010;404(2):293-303.

[16] Borodkina A, Shatrova A, Abushik P, et al. Interaction between ROS dependent DNA damage, mitochondria and p38 MAPK underlies senescence of human adult stem cells. Aging (Albany NY). 2014;6(6):481-495.

[17] 侯伊玲,薄海,刘子泉,等.缺血预处理抑制大鼠胰腺移植缺血再灌注胰腺细胞凋亡:活性氧与线粒体DNA修复酶的作用[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(18):3279-3285.

[18] Nikolaidis MG, Kyparos A, Spanou C, et al. Aging is not a barrier to muscle and redox adaptations: applying the repeated eccentric exercise model. Exp Gerontol. 2013; 48(8):734-743.

[19] Nagi SS, Mahns DA. C-tactile fibers contribute to cutaneous allodynia after eccentric exercise. J Pain. 2013;14(5):538-548.

[20] Isner-Horobeti ME, Dufour SP, Vautravers P, et al. Eccentric exercise training: modalities, applications and perspectives. Sports Med. 2013;43(6):483-512.

[21] Chen TC, Chen HL, Lin MJ, et al. Effect of two maximal isometric contractions on eccentric exercise-induced muscle damage of the elbow flexors. Eur J Appl Physiol. 2013; 113(6):1545-1554.

[22] Magalhães J, Fraga M, Lumini-Oliveira J, et al. Eccentric exercise transiently affects mice skeletal muscle mitochondrial function. Appl Physiol Nutr Metab. 2013;38(4):401-409.

[23] Rattray B, Caillaud C, Ruell PA, et al. Heat exposure does not alter eccentric exercise-induced increases in mitochondrial calcium and respiratory dysfunction. Eur J Appl Physiol. 2011;111(11):2813-2821.

[24] Liu Q, Simpson DC, Gronert S. Carbonylation of mitochondrial aconitase with 4-hydroxy-2-(E)-nonenal: localization and relative reactivity of addition sites. Biochim Biophys Acta. 2013;1834(6):1144-1154.

[25] Tsui KH, Chung LC, Wang SW, et al. Hypoxia upregulates the gene expression of mitochondrial aconitase in prostate carcinoma cells. J Mol Endocrinol. 2013;51(1):131-141.

[26] Gaziev AI, Abdullaev S, Podlutsky A. Mitochondrial function and mitochondrial DNA maintenance with advancing age. Biogerontology. 2014;15(5):417-438.

[27] Uebermuth C. Mitochondrial DNA plays an important role. Dtsch Arztebl Int. 2014;111(20):366.

[28] Muftuoglu M, Mori MP, de Souza-Pinto NC. Formation and repair of oxidative damage in the mitochondrial DNA. Mitochondrion. 2014:164-181.

[29] Karbownik-Lewińska M, St?pniak J, Lewiński A. High level of oxidized nucleosides in thyroid mitochondrial DNA; damaging effects of Fenton reaction substrates. Thyroid Res. 2012;5(1):24.

[30] Dwivedi S, Saquib Q, Al-Khedhairy AA, et al. Butachlor induced dissipation of mitochondrial membrane potential, oxidative DNA damage and necrosis in human peripheral blood mononuclear cells. Toxicology. 2012;302(1):77-87.

[31] Alfonso-Loeches S, Ureña-Peralta JR, Morillo-Bargues MJ, et al. Role of mitochondria ROS generation in ethanol-induced NLRP3 inflammasome activation and cell death in astroglial cells. Front Cell Neurosci. 2014;8:216.

[32] Oka T, Hikoso S, Yamaguchi O, et al. Mitochondrial DNA that escapes from autophagy causes inflammation and heart failure. Nature. 2012;485(7397):251-255.

[33] Lawlor KE, Vince JE. Ambiguities in NLRP3 inflammasome regulation: is there a role for mitochondria? Biochim Biophys Acta. 2014;1840(4):1433-1440.

[34] Wu J, Yan Z, Schwartz DE, et al. Activation of NLRP3 inflammasome in alveolar macrophages contributes to mechanical stretch-induced lung inflammation and injury. J Immunol. 2013;190(7):3590-3599.

[35] Mao K, Chen S, Chen M, et al. Nitric oxide suppresses NLRP3 inflammasome activation and protects against LPS-induced septic shock. Cell Res. 2013;23(2):201-212.

[36] Connelly SJ, Wiedner ES, Appel AM. Predicting the reactivity of hydride donors in water: thermodynamic constants for hydrogen. Dalton Trans. 2015;44(13):5933-5938.

[37] Noda K, Tanaka Y, Shigemura N, et al. Hydrogen-supplemented drinking water protects cardiac allografts from inflammation-associated deterioration. Transpl Int. 2012;25(12):1213-1222.

[38] Cui Y, Zhang H, Ji M, et al. Hydrogen-rich saline attenuates neuronal ischemia--reperfusion injury by protecting mitochondrial function in rats. J Surg Res. 2014;192(2):564-572.

[39] Zhou L, Wang X, Xue W, et al. Beneficial effects of hydrogen-rich saline against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits. Brain Res. 2013;1517:150-160.

[40] Hou Z, Luo W, Sun X, et al. Hydrogen-rich saline protects against oxidative damage and cognitive deficits after mild traumatic brain injury. Brain Res Bull. 2012;88(6):560-565.

[41] 肖频,庞奕辉,彭朋,等.α-硫辛酸抑制慢性低氧大鼠骨骼肌线粒体的氧化应激[J].中国组织工程研究,2013,17(28):5216-5222.

[42] Lin L, Chen K, Abdel Khalek W, et al. Regulation of skeletal muscle oxidative capacity and muscle mass by SIRT3. PLoS One. 2014;9(1):e85636.

[43] Ahn BH, Kim HS, Song S, et al. A role for the mitochondrial deacetylase Sirt3 in regulating energy homeostasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105(38):14447-14452.

[44] Sack MN. The role of SIRT3 in mitochondrial homeostasis and cardiac adaptation to hypertrophy and aging. J Mol Cell Cardiol. 2012;52(3):520-525.

[45] 张国华.运动诱导骨骼肌线粒体生成中沉默信息调节因子1的作用[J].中国组织工程研究,2013,17(33):6041-6048.

[46] Kong X, Wang R, Xue Y, et al. Sirtuin 3, a new target of PGC-1alpha, plays an important role in the suppression of ROS and mitochondrial biogenesis. PLoS One. 2010;5(7):e11707.

[47] Qiu X, Brown K, Hirschey MD, et al. Calorie restriction reduces oxidative stress by SIRT3-mediated SOD2 activation. Cell Metab. 2010;12(6):662-667.

[48] Cheng Y, Ren X, Gowda AS, et al. Interaction of Sirt3 with OGG1 contributes to repair of mitochondrial DNA and protects from apoptotic cell death under oxidative stress. Cell Death Dis. 2013;4:e731.

[49] Kim SJ, Cheresh P, Williams D, et al. Mitochondria-targeted Ogg1 and aconitase-2 prevent oxidant-induced mitochondrial DNA damage in alveolar epithelial cells. J Biol Chem. 2014; 289(9):6165-6176.

[50] Ren JD, Ma J, Hou J, et al. Hydrogen-rich saline inhibits NLRP3 inflammasome activation and attenuates experimental acute pancreatitis in mice. Mediators Inflamm. 2014;2014: 930894.

引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：实验于2014年8至12月在武警后勤学院附属医院完成。
材料：

试剂和仪器	来源
NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3抗体、白细胞介素1β抗体、Sirtuin-3(SIRT3)抗体、β-微管蛋白抗体	Abcam公司
线粒体膜电位检测试剂盒	碧云天生物技术研究所
锰超氧化物歧化酶活性检测试剂盒	南京建成生物研究所
线粒体DNA纯化试剂盒、顺乌头酸酶活性检测试剂盒	Biovision公司
8-氧鸟嘌呤脱氧核苷标准品	Sigma公司
PC-4000型高效液相色谱仪	Laballiance公司
DU800型可见-紫外分光光度计	Beckman公司
小动物跑台	成都泰盟公司

实验动物：健康雄性SPF级SD大鼠40只，体质量(195.73±14.21) g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK(京)2012-0001。大鼠分笼饲养，自由饮食饮水，室温(21±2) ℃，相对湿度40%-60%，12 h光照/12 h熄灯模拟日昼交替。实验符合实验动物伦理学要求。
方法：
实验分组：动物适应性喂养3 d后，随机分为4组：对照组、离心运动组、离心运动+生理盐水组和离心运动+富氢水组，各10只。
离心运动模型的建立：参照文献[2]，离心运动组、离心运动+生理盐水组和离心运动+富氢水组大鼠在小动物跑台进行下坡跑，速度为16-18 m/min，坡度-16°，90 min/d，共5 d。
富氢水干预：离心运动+生理盐水组大鼠每次运动后即刻腹腔注射生理盐水(10 mL/kg)。离心运动+富氢水组大鼠每次运动后即刻腹腔注射饱和富氢水(10 mL/kg)，富氢水由第二军医大学潜水医学教研室提供。0.4 MPa压力下将氢气在生理盐水中溶解6 h以达到饱和态，密封于铝袋中4 ℃常压保存，γ射线灭菌消毒，氢气浓度保持于0.6 mmol/L左右。
组织标本制备：各组大鼠均于末次运动后24 h断头处死，分离双侧股四头肌，部分组织于-80 ℃冻存，用于Western-blot检测。其余组织用差速离心法纯化线粒体。肌组织洗净剪碎，加50 mL提取介质(5 mmol/L MgCl2，20 mmol/L Hepes，1 mmol/L EDTA，0.12 mol/L KCl，pH 7.4)，匀浆后600×g离心10 min，取上清液17 000×g离心10 min。弃上清，用20 mL提取介质悬浮沉淀，7 000×g离心10 min。用1 mL提取介质悬浮沉淀。全部操作在冰浴中进行。考马斯亮蓝法测定样品蛋白含量[15]。
JC-1荧光探针检测骨骼肌线粒体膜电位：利用JC-1荧光探针检测线粒体膜电位[16]。在0.9 mL JC-1工作液中加入0.5 mg线粒体，再加入5 mmol/L苹果酸和10 mmol/L谷氨酸启动线粒体呼吸，荧光分光光度计分别检测红色荧光(激发波长525 nm，发射波长590 nm)和绿色荧光(激发波长 490 nm，发射波长530 nm)，二者比值表示为线粒体膜电位。
比色法检测骨骼肌线粒体顺乌头酸酶活性：严格按照试剂盒说明书操作。在2.0 mL裂解液中加入0.5 mg线粒体以提取顺乌头酸酶，再加入1.0 mL反应缓冲液，240 nm下检测反应体系吸光度值，计算酶活性(U/mg)。
比色法检测骨骼肌线粒体锰超氧化物歧化酶活性：严格按照试剂盒说明书操作。在反应管中分别加入2.0 mL碳酸盐缓冲液，0.2 mL Triton X-100，0.1 mL硝基氮蓝四唑，0.6 mL盐酸羟胺液，1.0 mg线粒体，37 ℃水浴反应15 min，加入2.0 mL甲酸终止反应，590 nm下检测反应体系吸光度值，计算酶活性(U/mg)。高效液相色谱法检测骨骼肌线粒体DNA中8-氧鸟嘌呤脱氧核苷含量：严格按照线粒体DNA纯化试剂盒说明书提取骨骼肌线粒体DNA。参照作者所在课题组前期的方法[17]，使用高效液相色谱仪检测线粒体DNA中8-氧鸟嘌呤脱氧核苷含量。色谱柱使用粒径为4 μm的C18反相柱(250 mm×4.6 mm)，流动相使用30 mmol/L氢氧化钠，6%甲醇，10 mmol/L醋酸， 12.5 mmol/L柠檬酸，25 mmol/L醋酸钠，流速设为0.8 mL/min，波长260 nm下检测。8-氧鸟嘌呤脱氧核苷标准品制备标品液，同等条件下制备标准曲线，以计算样品中8-氧鸟嘌呤脱氧核苷含量。
Western blot法检测骨骼肌NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3、白细胞介素1β和SIRT3蛋白表达：骨骼肌匀浆测定NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3、白细胞介素1β和SIRT3表达量，以β-微管蛋白为内参。样品根据浓度差异加入2×SDS上样缓冲液，混匀后100 ℃加热5 min，冰浴冷却。于垂直电泳仪10 µg蛋白样品上样并经15% SDS-PAGE分离，转膜致PVDF膜。1∶3 000兔抗大鼠一抗孵育并置于摇床过夜。PBS洗涤3次，再用1∶1 000辣根过氧化物酶标记抗兔二抗孵育并置于摇床1 h。PBS充分洗涤后，ECL试剂盒发光显影，X射线胶片压片曝光，扫描定量各条带灰度值。以对照组条带灰度值为100%，目的蛋白与对照组条带灰度值的比值，即为其相对表达量(%)。
主要观察指标：大鼠股四头肌线粒体顺乌头酸酶活性、锰超氧化物歧化酶活性、膜电位，线粒体DNA中8-氧鸟嘌呤脱氧核苷含量，NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3、白细胞介素1β及SIRT3蛋白表达量。
统计学分析：实验所得各组数据均采用x±s表示，由第一作者使用SPSS 13.0统计软件进行单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

线粒体氧化应激是长时间离心运动造成肌肉损伤的重要机制[18-21]。研究表明，与向心运动相比。离心运动动员线粒体程度相对较低，但长时间离心运动亦通过提高线粒体氧化磷酸化水平以保障运动进程的能量供应，伴随的是线粒体内膜电子漏增加，活性氧产量增多[22-23]。本实验中，5 d离心运动后骨骼肌线粒体顺乌头酸酶活性显著降低。顺乌头酸酶紧邻线粒体呼吸链超氧阴离子产生位点，超氧阴离子是线粒体活性氧的最初类型，通过氧化顺乌头酸酶活性基团铁硫簇抑制其活性，因而顺乌头酸酶活性与活性氧产量成反比，是反映线粒体活性氧产生速率的灵敏指标[24-25]。
线粒体是细胞核外惟一拥有DNA的细胞器，线粒体DNA独立编码线粒体呼吸链复合体中的13个亚基。与细胞核DNA相比，线粒体DNA复制频率较高，缺乏组蛋白保护，且紧邻呼吸链活性氧产生位点，因而对氧化还原稳态改变极为敏感[26-27]。在诸多类型的碱基氧化修饰中，8-氧鸟嘌呤脱氧核苷是最常见的一种碱基氧化产物，可作为组织氧化损伤定量的标志物[28]。本实验中，5 d离心运动后线粒体DNA中8-氧鸟嘌呤脱氧核苷含量明显增加，这与活性氧变化趋势一致。8-氧鸟嘌呤脱氧核苷过量可在线粒体DNA复制中诱导dAMP错配，从而引起C/G→A/T颠换突变[29]；也可在转录进程中导致RNA聚合酶滑脱，形成移码突变，进而影响线粒体复合体的表达和活性[30]。作者所在团队前期研究发现缺血再灌注导致胰腺腺泡线粒体DNA中8-氧鸟嘌呤脱氧核苷含量增加，同时细胞色素c氧化酶活性降低[17]。因而本实验中离心运动抑制线粒体膜电位可能与线粒体DNA氧化损伤增加相关。
研究表明，线粒体活性氧过量产生可激活NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3炎性小体[31]。此外，Oka等[32]证明，氧化损伤的线粒体DNA可从线粒体中释放，直接结合并活化NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3炎性小体。NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3性小体是启动机体炎症反应的关键元件之一，由NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3蛋白、凋亡相关斑点样蛋白及caspase-1组成。NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3蛋白被激活后募集凋亡相关斑点样蛋白连接器和caspase-1前体，继而通过自身切割形成成熟的caspase-1，后者将促炎因子白细胞介素1β前体切割为成熟的白细胞介素1β，进而启动炎症反应[33-35]。本实验中，5 d离心运动后骨骼肌NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3和白细胞介素1β蛋白表达均显著升高。以上提示，离心运动诱导的骨骼肌NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3-白细胞介素1β炎症反应可能是线粒体氧化损伤的继发事件。
Connelly等[36]证明，大鼠腹腔注射富氢水后，血液中氢分子浓度可升高至µmol/L水平，丙二醛水平明显降低，是一种有效的氢分子抗氧化干预模式。本实验首次证明，离心运动后给予富氢水干预可降低线粒体活性氧生成速率，抑制继发的线粒体DNA氧化损伤及炎症反应。此外还发现富氢水提高了骨骼肌线粒体膜电位及抗氧化酶锰超氧化物歧化酶的活性。研究者在大鼠心脏移植模型中发现，富氢水可抑制心肌炎症反应[37]。此外，富氢水可提高缺血再灌注脑组织线粒体膜电位，促进线粒体生物合成[38]。Zhou等[39]在家兔脊髓缺血再灌注模型中证明，富氢水抑制氧化损伤，并上调超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性。这些报道与本实验结果一致。氢分子可直接结合并清除羟自由基等活性氧，这可解释本实验中富氢水上调线粒体顺乌头酸酶活性的结果。但富氢水对线粒体能量代谢和抗氧化能力的调控机制尚不清楚。
本实验中，富氢水完全逆转了离心运动对骨骼肌线粒体SIRT3表达的抑制效应。Hou等[40]在外伤性脑损伤大鼠模型中发现，富氢水可上调SIRT3同源蛋白SIRT2的表达。SIRT3是线粒体主要的去乙酰化酶，其活性与烟碱胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)水平正相关[41]。SIRT3通过催化相关线粒体蛋白的酪氨酸基团去乙酰化反应，正性调控线粒体功能[42]。研究者利用免疫共沉淀技术证明SIRT3可与线粒体氧化磷酸化复合体Ⅰ直接结合，催化NDUFA9等亚基脱乙酰基，上调复合体Ⅰ活性[43]。此外，SIRT3还可提高线粒体氧化磷酸化体系中的NADH脱氢酶和ATP合成酶，以及三羧酸循环中柠檬酸脱氢酶等关键酶的活性[44-45]。以上提示富氢水可能通过SIRT3途径提高线粒体能量代谢水平。
研究者利用RNA干扰技术抑制C2C12成肌细胞SIRT3表达，发现锰超氧化物歧化酶表达及活性均降低[46]。Qiu等[47]证明SIRT3通过催化去乙酰化反应增加锰超氧化物歧化酶活性。此外，这个实验还发现在SIRT3缺陷鼠中过表达锰超氧化物歧化酶无法提高线粒体活性氧清除能力，这证明SIRT3是锰超氧化物歧化酶发挥抗氧化活性的必要条件。最近Cheng等[48]证明，SIRT3可与线粒体8-氧鸟嘌呤脱氧核苷糖基化酶直接结合，抑制线粒体8-氧鸟嘌呤脱氧核苷糖基化酶蛋白降解并增加其表达量和活性。8-氧鸟嘌呤脱氧核苷糖基化酶是线粒体DNA氧化损伤的关键修复酶，特异性识别8-氧鸟嘌呤脱氧核苷并启动碱基切除修复进程[49]。以上提示离心运动同时给予富氢水干预，可能通过上调SIRT3提高线粒体抗氧化酶活性及线粒体DNA氧化损伤修复能力，进而抑制骨骼肌氧化损伤及继发的炎症反应。Ren等[50]也报道，富氢水可抑制急性胰腺炎大鼠腺泡细胞NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3炎症小体活化。值得注意的是，本实验中，离心运动后给予富氢水将活性氧抑制于安静水平，但NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3和白细胞介素1β蛋白表达虽降低但仍高于安静水平。提示离心运动诱导的炎症反应并非完全继发于氧化应激，具体机制有待进一步研究。
总之，富氢水除可直接清除活性氧外，还可通过上调SIRT3表达，提高线粒体能量代谢和抗氧化能力，从而抑制离心运动诱导的线粒体氧化应激和继发的炎症反应，实现骨骼肌保护效应。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

富氢水抑制离心运动后骨骼肌线粒体氧化应激和炎症反应

Hydrogen-rich water inhibits mitochondrial oxidative stress and inflammation in the skeletal muscle after eccentric exercise

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 3

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	张同同, 王中华, 文杰, 宋玉鑫, 刘林. 3D打印模型在颈椎肿瘤手术切除与重建中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1335-1339.
[2]	柴乐, 吕建兰, 胡劲涛, 胡华辉, 许庆军, 余进伟, 全仁夫. 诱导急性脊髓损伤模型大鼠炎症反应信号通路的变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1218-1223.
[3]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[4]	裴丽丽, 孙贵才, 王弟. 丹酚酸B抑制骨髓间充质干细胞氧化损伤及促进分化为心肌样细胞[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1032-1036.
[5]	李偲, 赵婷, 谭戈, 郑雨林, 张若男, 吴艳, 唐俊明. 血小板源生长因子BB可促进骨骼肌成肌细胞增殖、分化与迁移[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1050-1055.
[6]	徐东紫, 张婷, 欧阳昭连. 心脏组织工程领域全球专利竞争态势分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 807-812.
[7]	吴子健, 胡昭端, 谢有琼, 王峰, 李佳, 李柏村, 蔡国伟, 彭锐. 3D打印技术与骨组织工程研究文献计量及研究热点可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 564-569.
[8]	常文辽, 赵杰, 孙晓亮, 王锟, 吴国锋, 周剑, 李树祥, 孙晗. 人工骨膜的材料选择、理论设计及生物仿生功能[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 600-606.
[9]	刘旒, 周箐竹, 龚桌, 刘博言, 杨斌, 赵娴. 胶原/无机材料构建组织工程骨的特点及制造技术[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 607-613.
[10]	刘飞, 崔宇韬, 刘贺. 局部抗生素递送系统治疗骨髓炎的优势与问题[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 614-620.
[11]	李晓壮, 段浩, 王伟舟, 唐志宏, 王旸昊, 何飞. 骨组织工程材料治疗骨缺损疾病在体内实验中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 626-631.
[12]	张振坤, 李喆, 李亚, 王莹莹, 王亚苹, 周馨魁, 马珊珊, 关方霞. 海藻酸盐基水凝胶/敷料在创面愈合中的应用：持续、动态与顺序释放[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 638-643.
[13]	陈佳娜, 邱燕玲, 聂敏海, 刘旭倩. 组织工程支架材料修复口腔颌面部软组织缺损[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 644-650.
[14]	邢浩, 张永红, 王栋. 长骨大段骨缺损修复方法的优势与不足[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 426-430.
[15]	阮光萍, 姚翔, 刘高米洋, 蔡学敏, 李自安, 庞荣清, 王金祥, 潘兴华. 脐带间充质干细胞移植治疗树鼩创伤性全身炎症反应综合征[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3994-4000.