IKK-2受体阻滞剂对角膜基质成纤维细胞的作用及机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.29.019

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (29): 4688-4694.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.29.019

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

IKK-2受体阻滞剂对角膜基质成纤维细胞的作用及机制

仲炜，姜宏，赵婧

吉林大学中日联谊医院眼科，吉林省长春市 130031

出版日期:2015-07-09 发布日期:2015-07-09
通讯作者: 姜宏，博士，副主任医师，吉林大学中日联谊医院眼科，吉林省长春市 130031
作者简介:仲炜，男，1981年生，吉林省柳河县人，汉族，2008年吉林大学毕业，硕士，主治医师，主要从事眼表病和角膜病的研究。
基金资助:
吉林省科技发展计划资助项目，课题名称：TPCA-1对脂多糖诱导的角膜基质细胞分泌的抑制作用(20090173)，细胞信号转导机制在角膜溃疡发生的作用(20090744)

Effect and mechanism of IKK-2 receptor blocker on corneal stromal fibroblasts

Zhong Wei, Jiang Hong, Zhao Jing

Department of Ophthalmology, China-Japan Friendship Hospital, Jilin University, Changchun 130031, Jilin Province, China

Online:2015-07-09 Published:2015-07-09
Contact: Jiang Hong, M.D., Associate chief physician, Department of Ophthalmology, China-Japan Friendship Hospital, Jilin University, Changchun 130031, Jilin Province, China
About author:Zhong Wei, Master, Attending physician, Department of Ophthalmology, China-Japan Friendship Hospital, Jilin University, Changchun 130031, Jilin Province, China
Supported by:
the Jilin Province Science and Technology Development Program, No. 20090173, 20090744

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究证实角膜基质成纤维细胞在脂多糖刺激时表达白细胞介素8。成纤维细胞对脂蛋白或其他炎性递质的不同反应，可能构成了不同组织在炎症反应中的不同特征。
目的：观察IKK-2受体阻滞剂(TPCA-1)对脂多糖作用下人角膜基质成纤维细胞分泌炎性细胞因子、趋化因子、细胞间黏附分子的抑制作用及其信号转导途径，与地塞米松进行比较，并联合应用探讨其替代或协同作用。
方法：测量培养的人角膜基质成纤维细胞在基础状态下及脂多糖作用下分泌白细胞介素1、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素8水平以及IKK-2受体阻滞剂(TPCA-1)、地塞米松干预后的变化，检测细胞表面细胞间黏附分子1及细胞内白细胞介素6表达水平，从mRNA水平验证细胞间黏附分子1、白细胞介素6、白细胞介素8表达水平的变化。检测上述情况下细胞核因子κB表达。
结果与结论：脂多糖诱导了人角膜基质成纤维细胞白细胞介素6，白细胞介素8及细胞间黏附分子1的分泌及表达增加，IKK-2受体阻滞剂(TPCA-1)抑制上述作用，TPCA-1的抑制作用是通过阻断了核转录因子κB信号转导途径实现的，地塞米松表现相似的抑制作用，但是通过不同的信号转导途径实现的。结果提示IKK-2受体阻滞剂与地塞米松有协同作用，可能成为治疗感染性角膜疾病中地塞米松的替代药物或补充。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 组织工程, 角膜基质成纤维细胞, IKK-2受体阻滞剂(TPCA-1), 脂多糖, 地塞米松, 信号转导途径

Abstract:

BACKGROUND: Corneal stromal fibroblasts have been shown to express interleukin-8 in the stimulation of lipopolysaccharide. Different reactions of fibroblasts to lipoprotein or other inflammatory mediators may constitute different characteristics of different tissues in the inflammatory response.
OBJECTIVE: To observe the inhibitory effect of IKK-2 receptor blocker TPCA-1 on human corneal stromal fibroblasts to secrete inflammatory cytokines, chemokines and cell adhesion molecules under the stimulation of lipopolysaccharide and its signal transduction pathway, to compare with dexamethasone, and to explore alternative or synergistic effects after their combination.
METHODS: This study measured the secretion of interleukin-1, tumor necrosis factor alpha, interleukin-6, and interleukin-8 from cultured human corneal stromal fibroblasts under the action of basic state and lipopolysaccharide, and their changes after the intervention with IKK-2 receptor blocker TPCA-1 and dexamethasone. We also detected expression level of intercellular adhesion molecule-1 and interleukin-6 in cell surface, and verified the changes in expression levels of intercellular adhesion molecule-1, interleukin-6, and interleukin-8 from mRNA level, as well as examined the expression of nuclear factor kappa B under above conditions.
RESULTS AND CONCLUSION: Lipopolysaccharide induced the secretion of interleukin-6, interleukin-8 and intercellular adhesion molecule-1 from human corneal stromal fibroblasts, and their expressions were increased. IKK-2 receptor blocker TPCA-1 could inhibit above effects. The inhibitory effect of TPCA-1 was done by blocking nuclear transcription factor kappa B signal transduction, and was identical to the inhibitory effect of dexamethasone, but by different signal transduction pathway. These data indicate that IKK-2 receptor blocker and dexamethasone have synergistic effects. IKK-2 receptor blocker may become an alternative to dexamethasone in treatment of infectious corneal diseases.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: lipopolysaccharide, Fibroblasts, Dexamethasone

中图分类号:

R318

仲炜，姜宏，赵婧. IKK-2受体阻滞剂对角膜基质成纤维细胞的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(29): 4688-4694.

Zhong Wei, Jiang Hong, Zhao Jing. Effect and mechanism of IKK-2 receptor blocker on corneal stromal fibroblasts [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(29): 4688-4694.

图/表（结果） 4

2.1 人角膜基质细胞的培养及鉴定细胞接种后第3天，细胞贴壁，呈梭性，核圆，居中，细胞传代后，7 d后细胞基本融合生长。细胞爬片行免疫组织化学染色后，在显微镜下可见细胞胞浆中均呈灰褐色阳性染色，即波形蛋白染色阳性，而角蛋白染色为阴性，证明所培养细胞确实为角膜基质细胞。
2.2 ELISA法检测角膜基质细胞脂多糖作用前后分泌白细胞介素1，白细胞介素6，白细胞介素8水平各组均未检测到白细胞介素1，与阴性对照组比较，人血清组分泌白细胞介素6、白细胞介素8因子水平差异无显著意义(P > 0.05)；脂多糖组分泌白细胞介素6、白细胞介素8水平明显高于阴性对照组(P < 0.01)。见表1。

2.3 ELISA检测不同浓度的IKK-2受体阻滞剂(TPCA-1)、地塞米松对脂多糖作用前后分泌白细胞介素6，白细胞介素8蛋白的影响见表2。

在无脂多糖作用下，不同浓度的TPCA-1作用后白细胞介素8的基础分泌与阴性对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)；白细胞介素6的基础分泌与阴性对照组比较明显降低(P < 0.05)，作用随IKK-2受体阻滞剂(TPCA-1)浓度增加而增大，具有浓度依赖性。脂多糖作用后，各浓度的TPCA-1对白细胞介素6、白细胞介素8的影响与脂多糖组比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，作用随TPCA-1浓度增加而增大，具有浓度依赖性。
在无脂多糖作用下，不同浓度的地塞米松作用后白细胞介素6、白细胞介素8的基础分泌与阴性对照组比较明显降低(P < 0.05)，作用随地塞米松浓度增加而增大。脂多糖作用后，各浓度的地塞米松对白细胞介素6、白细胞介素8的抑制作用与脂多糖组比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，作用随地塞米松浓度增加而增大，具有浓度依赖性。
2.4 ELISA法检测IKK-2受体阻滞剂(TPCA-1)、地塞米松及两种药物联合应用对脂多糖作用前后分泌白细胞介素6，白细胞介素8的影响在没有脂多糖作用的情况下， TPCA-1(1.0 μmol/L)与地塞米松(100 nmol/L) 共同作用于培养的人角膜基质成纤维细胞，细胞分泌白细胞介素6量为(13.3±0.96)×10-3 μg/L，与TPCA-1(1.0 μmol/L)或地塞米松(100 nmol/L)单独作用比较差异有显著性意义(P < 0.05)，以上3组与阴性对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)；白细胞介素8的分泌量为(1.72±0.02) μg/L，与地塞米松组比较差异无显著性意义，与TPCA-1组或阴性对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。
脂多糖作用后，脂多糖+TPCA-1+地塞米松组细胞分泌白细胞介素6量为(0.23±0.02) μg/L，细胞分泌白细胞介素8量为(22.41±1.25) μg/L，与脂多糖+TPCA-1组或脂多糖+地塞米松组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，以上3组与脂多糖组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。
2.5 Western blot法检测IKK-2受体阻滞剂(TPCA-1)、地塞米松及两种药物联合应用对脂多糖作用后细胞白细胞介素6，细胞间黏附分子1蛋白的影响阴性对照组表达白细胞介素6及细胞间黏附分子1蛋白，脂多糖作用后表达水平增高，与阴性对照组比较差异有显著性意义(P < 0.01)。与脂多糖组比较，脂多糖+TPCA-1组与脂多糖+地塞米松组都能够明显抑制角膜基质细胞白细胞介素6及细胞间黏附分子1的表达(P < 0.01)，脂多糖+地塞米松+ TPCA-1组可以进一步降低其表达水平，与脂多糖+地塞米松组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见表3。

2.6 RT-PCR检测IKK-2受体阻滞剂(TPCA-1)、地塞米松及两种药物联合应用对脂多糖作用后细胞白细胞介素6，白细胞介素8，细胞间黏附分子1的影响阴性对照组mRNA水平表达白细胞介素6、白细胞介素8及细胞间黏附分子1，脂多糖作用后表达水平增高，与阴性对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。脂多糖+TPCA-1组与脂多糖+地塞米松组都能够明显抑制角膜基质细胞白细胞介素6、白细胞介素8及细胞间黏附分子1在mRNA水平的表达，与脂多糖组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，脂多糖+地塞米松+ TPCA-1组可以进一步降低其表达水平，与脂多糖+TPCA-1组或脂多糖+地塞米松组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图1。
2.7 免疫组织化学染色检测TPCA-1、地塞米松及两种药物联合应用对脂多糖作用前后细胞核核转录因子кB表达细胞爬片行核转录因子кB免疫组织化学染色，可见正常培养的人角膜基质成纤维细胞核呈深蓝色，脂多糖作用后细胞核黄褐色阳性着染，IKK-2受体阻滞剂(TPCA-1)抑制后给予脂多糖作用细胞核染色为深蓝色阴性，地塞米松抑制给予脂多糖作用细胞核核转录因子κB染色呈黄褐色阳性着染，见图2。

参考文献

[1] 宋秀君.重视角膜基质细胞的作用[J].中华实验眼科杂志, 2012, 29(12):1057-1060．

[2] 陆燕,孟虎,侯培莉,等.来源于全飞秒激光小切口微透镜摘除术的基质层人角膜成纤维细胞的原代培养与鉴定[J].眼科新进展，2013,33(9):801-803.

[3] Brouty-Boye’ D, Pottin-Cle’ menceau C,et al. Chemokines and CD40 expression in human fibroblasts.Eur J Immunol. 2000;30:914-919.

[4] Fukuda K, Fujitsu Y, Seki K,et al.Differential expression of thymus- and activation-regulated chemokine (CCL17) and macrophage-derived chemokine (CCL22) by human fibroblasts from cornea, skin, and lung.J Allergy Clin Immunol. 2003;111:520-526.

[5] Fukuda K,Ishida W1,Tanaka H2,Harada Y1,Fukushima A1.Inhibition by rebamipide of cytokine-induced or lipopolysaccharide-induced chemokine synthesis in human corneal fibroblasts.Br J Ophthalmol.2014;98(12):1751-1755.

[6] Koyama S, Sato E, Nomura H, et al. The potential of various lipopolysaccharides to release monocyte chemotactic activity from lung epithelial cells and fibroblasts. Eur Respir J.1999; 14:545-552.

[7] Wilson SE,Mohan RR,Mohan RR,et al.The corneal wound healing response: cytokine-mediated interaction of the epithelium, stroma, and inflammatory cells. Prog Retinal Eye Res.2001;20:625-637.

[8] Birrell MA, Hardaker E, Wong S, et al.I-B kinase-2 inhibitor blocks inflammation in human airway smooth muscle and a rat model of asthma. Am J Respir Crit Care Med. 2005;172: 962-971.

[9] Gaddipati S, Lu Q, Kasetti RB, et al.IKK2 Inhibition Using TPCA-1-Loaded PLGA Microparticles Attenuates Laser-Induced Choroidal Neovascularization and Macrophage Recruitment.PLoS One. 2015;10(3):e0121185.

[10] Stinson LF,Ireland DJ,Kemp MW,et al.Effects of cytokine-suppressive anti-inflammatory drugs on inflammatory activation in ex vivo human and ovine fetal membranes. Reproduction. 2014;147(3):313-320.

[11] Saika S,Miyamoto T,Yamanaka O,et al.Therapeutic effect of topical administration of SN50,an inhibitor of nuclear factor-B,in treatment of corneal alkali burns in mice. Am J Pathol. 2005;166:1393-1403.

[12] Saika S, Ikeda K, Yamanaka O, et al. Expression of Smad7 in mouse eyes accelerates healing of corneal tissue after exposure to alkali.Am J Pathol. 2005;166:1405-1418.

[13] Li Q, Fukuda K, Lu Y, et al. Enhancement by neutrophils of collagen degradation by corneal fibroblasts. J Leukoc Biol. 2003;74:412-419.

[14] Lu Y, Liu Y, Fukuda K, et al.Inhibition by Triptolide of Chemokine, Proinflammatory Cytokine, and Adhesion Molecule Expression Induced byLipopolysaccharide in Corneal Fibroblasts. Invest Ophthalmol Vis Sci.2006;47 (9): 3796-880.

[15] De Bosscher K,Vanden Berghe W,et al.The interplay between the glucocorticoid receptor and nuclear factor-Boractivator protein-1: molecular mechanisms for gene repression.Endocr Rev.2003;24:488-522.

[16] Almodóvar-García K, Kwon M, Samaras SE,et al. ANKRD1 acts as a transcriptional repressor of MMP13 via the AP-1 site. Mol Cell Biol. 2014;34(8):1500-11.

[17] Shaulian E, Karin M. AP-1 in cell proliferation and survival. Oncogene. 2001,20: 2390-2400.

[18] Gonza′lez MV, Jime‘nez B, Berciano MT, et al. Glucocorticoids antagonize AP-1 by inhibiting the activation/phosphorylation of JNKwithout affecting its subcellular distribution.J Cell Biol.2000;150:1199-1208.

[19] Chakraborti S, Mandal M, Das S,et al. Regulation of matrix metalloproteinases: an overview. Mol Cell Biochem.2003; 253:269-285.

[20] Orita T, Kimura K, Nishida T,et al. Cytokine and chemokine secretion induced by poly(I:C) through NF-κB and phosphoinositide 3-kinase signaling pathways in human corneal fibroblasts. Curr Eye Res. 2013 Jan;38(1):53-9.

[21] Li W, Zheng S, Tang C,et al. JNK-AP-1pathway involved in interleukin- 1-induced calcitonin gene-related peptide secretion in human type II alveolar epithelial cells. Peptides. 2007;28:1252-1259.

[22] Liacini A,Sylvester J,Li WQ,et al.Inhibition of interleukin-1-stimulated MAP kinases, activating protein-1 (AP-1) and nuclear factor kappaB (NF-B) transcription factors down-regulate smatrix metalloproteinase gene expression in articular chondrocytes. Matrix Biol.2002;21:251-262.

[23] 赵伟,周瑾,郭梦翔,等.地塞米松对碱烧伤后大鼠角膜核转录因子-κB活化的影响[J].眼科新进展,2013,33(7):614-617.

[24] Takeda K, Takeuchi O, Tsujimura T, et al. Limb and skin abnormalities in mice lacking IKK. Science.1999;284: 313-316.

引言

角膜溃疡发展迅速，除抗生素治疗之外，需要研发调节角膜基质成纤维细胞功能，抑制角膜胶原降解，抑制细胞因子、趋化因子产生的新型药物，这些药物可阻断上述这些环节，进而阻止溃疡的发生。地塞米松等药物能够抑制角膜基质成纤维细胞的上述作用，能够抑制角膜基质成纤维细胞在炎症反应过程中多种趋化因子、炎性因子的表达及增高，降低基质金属蛋白酶的表达，但利用地塞米松进行治疗有很多不良反应。目前临床上缺乏这类安全有效的药物。
角膜基质成纤维细胞在角膜防御和炎症反应中有重要作用。这些细胞不仅通过对炎性细胞因子发生反应，还可以直接和细菌相互作用诱导炎性细胞局部浸润。成纤维细胞依其所在身体的不同部位和局部刺激物而表现不同的结构和功能特性[1]，在体外培养后其不同表现型能够维持不变[2-3]。
角膜、皮肤、肺等不同组织来源成纤维细胞的细胞因子调节TARC表达是不同的[4-5]，成纤维细胞对脂多糖的应答反应也因组织来源不同而不同。例如，肺成纤维细胞在脂多糖刺激时表达单核细胞趋化蛋白1而不表达白细胞介素8[6]，现已证实角膜基质成纤维细胞在脂多糖刺激时则表达白细胞介素8。成纤维细胞对脂蛋白或其他炎性递质的不同反应，可能构成了不同组织在炎症反应中的不同特征。
细胞因子介导的细胞信号系统，被认为在很多结缔组织和上皮组织构成的器官的发展、内环境稳定和创伤愈合中，在结构和功能上发挥最重要的作用。角膜因为没有像皮肤等器官那样的血管、皮脂腺、毛囊或混杂其他组织，在研究信号系统时成为特殊的模型[7]。
通过研究 IKK-2受体阻滞剂(TPCA-1)在影响脂多糖刺激角膜基质成纤维细胞分泌炎性细胞因子(白细胞介素1，肿瘤坏死因子α，白细胞介素6)和趋化因子(白细胞介素8)以及细胞表面细胞间黏附分子1中的作用；IKK-2受体阻滞剂(TPCA-1)的作用及信号转导途径与地塞米松进行比较。旨在观察IKK-2受体阻滞剂(TPCA-1)对脂多糖诱导的角膜基质细胞分泌炎性细胞因子、趋化因子、细胞间黏附因子抑制作用及其信号转导途径，为临床治疗角膜溃疡提供有益的线索。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

设计：分组对照观察。
时间及地点：实验于2007年4月至2009年5月在吉林大学中日联谊医院中心实验室。
材料：

IKK-2受体阻滞剂(TPCA-1)对脂多糖与地塞米松联合诱导角膜基质成纤维细胞作用实验主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
TPCA-1	Sigma公司
地塞米松	郑州羚锐制药股份有限公司
脂多糖	Amersha公司
小鼠抗人波形蛋白及角蛋白单克隆抗体	武汉博士德生物工程公司
ELISA试剂盒	上海森雄科技实业有限公司
免疫组织化学染色试剂盒	Maixin-Bio公司

实验方法：
人角膜基质细胞的培养及鉴定：组织来源于角膜移植后剩余的角膜材料，供者为健康成年人，供者已签署器官捐献知情同意书，符合伦理要求。采用消化培养法培养人角膜基质细胞，用小鼠抗人波形蛋白及角蛋白单克隆抗体进行细胞鉴定。
ELISA法检测角膜基质细胞脂多糖作用前后培养上清中分泌白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素8水平：①阴性对照组：加入不含有任何血清或药物的同体积MEM培养液。②溶媒对照组：单纯给予含有体积分数0.5%人血清(AB型)的MEM培养液。③脂多糖组：给予含有体积分数0.5%人血清(AB型)及脂多糖100 μg/L的MEM培养液。ELISA检测试剂盒按说明书操作，根据本组结果进行下一步试验。
ELISA检测不同浓度的TPCA-1、地塞米松对脂多糖作用前后分泌白细胞介素6，白细胞介素8蛋白的作用：实验分为阴性对照组、TPCA-1 0.1，0.3，1.0，3.0组、地塞米松0.1，1.0，10，100组、脂多糖组、脂多糖+TPCA-1 0.1，0.3，1.0，3.0组、脂多糖+地塞米松0.1，1.0，10，100组，处理方法如下表。ELISA检测试剂盒按说明书操作。并根据此结果进行下一步试验。

ELISA检测不同浓度的TPCA-1、地塞米松对脂多糖作用前后分泌白细胞介素6，白细胞介素8蛋白的作用实验分组：
组别	预处理	作用溶液
阴性对照组	TPCA-1 0 μmol/L	同体积MEM培养液
TPCA-1 0.1组	TPCA-1 0.1 μmol/L	同体积MEM培养液
TPCA-1 0.3组	TPCA-1 0.3 μmol/L	同体积MEM培养液
TPCA-1 1.0组	TPCA-1 1.0 μmol/L	同体积MEM培养液
TPCA-1 3.0组	TPCA-1 3.0 μmol/L	同体积MEM培养液
地塞米松 0.1组	地塞米松 0.1 nmol/L	同体积MEM培养液
地塞米松1.0组	地塞米松 1.0 nmol/L	同体积MEM培养液
地塞米松10组	地塞米松 10 nmol/L	同体积MEM培养液
地塞米松100组	地塞米松 100 nmol/L	同体积MEM培养液
脂多糖	TPCA-1 0 μmol/L	含有体积分数0.5%人血清(AB型)的脂多糖(100 μg/L)
脂多糖+TPCA-1 0.1组	TPCA-1 0.1 μmol/L	含有体积分数0.5%人血清(AB型)的脂多糖(100 μg/L)
脂多糖+TPCA-1 0.3组	TPCA-1 0.3 μmol/L	含有体积分数0.5%人血清(AB型)的脂多糖(100 μg/L)
脂多糖+TPCA-1 1.0组	TPCA-1 1.0 μmol/L	含有体积分数0.5%人血清(AB型)的脂多糖(100 μg/L)
脂多糖+TPCA-1 3.0组	TPCA-1 3.0 μmol/L	含有体积分数0.5%人血清(AB型)的脂多糖(100 μg/L)
脂多糖+地塞米松0.1组	地塞米松 0.1 nmol/L	含有体积分数0.5%人血清(AB型)的脂多糖(100 μg/L)
脂多糖+地塞米松1.0组	地塞米松 1.0 nmol/L	含有体积分数0.5%人血清(AB型)的脂多糖(100 μg/L)
脂多糖+地塞米松10组	地塞米松 10 nmol/L	含有体积分数0.5%人血清(AB型)的脂多糖(100 μg/L)
脂多糖+地塞米松100组	地塞米松 100 nmol/L	含有体积分数0.5%人血清(AB型)的脂多糖(100 μg/L)

ELISA法检测IKK-2受体阻滞剂(TPCA-1)、地塞米松及两种药物联合应用对脂多糖作用前后分泌白细胞介素6，白细胞介素8蛋白的影响：实验分为阴性对照组、TPCA-1组、地塞米松组、TPCA-1+地塞米松组、脂多糖组、脂多糖+ TPCA-1组、脂多糖+地塞米松组、脂多糖+ TPCA-1+地塞米松组，处理方法如下表。ELISA检测试剂盒按说明书操作。

ELISA法检测IKK-2受体阻滞剂(TPCA-1)、地塞米松及两种药物联合应用对脂多糖作用前后分泌白细胞介素6、白细胞介素8蛋白影响的实验分组：
组别	预处理	作用溶液
阴性对照组	等体积MEM 培养液	同体积MEM 培养液
TPCA-1组	TPCA-1(1.0 μmol/L)	同体积MEM 培养液
地塞米松组	地塞米松(100 nmol/L)	同体积MEM 培养液
TPCA-1+地塞米松组	地塞米松(100 nmol/L)加TPCA-1(1.0 μmol/L)	同体积MEM 培养液
脂多糖组	等体积MEM培养液	含有体积分数0.5%人血清(AB型)的脂多糖(100 μg/L)
脂多糖+TPCA-1组	TPCA-1(1.0 μmol/L)	含有体积分数0.5%人血清(AB型)的脂多糖(100 μg/L)
脂多糖+地塞米松组	地塞米松(100 nmol/L)	含有体积分数0.5%人血清(AB型)的脂多糖(100 μg/L)
脂多糖+ TPCA-1+地塞米松组	地塞米松(100 nmol/L) 加TPCA-1 (1.0 μmol/L)	含有体积分数0.5%人血清(AB型)的脂多糖(100 μg/L)

蛋白质印迹杂交(Western blot)法检测IKK-2受体阻滞剂(TPCA-1)、地塞米松及两种药物联合应用对脂多糖作用后细胞白细胞介素6，细胞间黏附分子1的影响：实验分为阴性对照组、脂多糖组、TPCA-1组、地塞米松组、地塞米松+TPCA-1组，处理方法如下表。以上5组各自作用24 h后，提取细胞中总蛋白，进行蛋白含量的测定，蛋白质印迹杂交，将Westrn印迹杂交X射线片图像扫描入计算机，采用Quanty one软件进行定量分析。

Western blot法检测IKK-2受体阻滞剂(TPCA-1)、地塞米松及两种药物联合应用对脂多糖作用后细胞白细胞介素6，细胞间黏附分子1影响的实验分组：
组别	处理
阴性对照组	给予等体积MEM培养液
脂多糖组	给予含有体积分数0.5%人血清(AB型)的脂多糖(100 μg/L)。
TPCA-1组	给予TPCA-1(1.0 μmol/L)预处理1 h后，给予含有体积分数0.5%人血清(AB型)的脂多糖(100 μg/L)
地塞米松组	给予地塞米松(100 nmol/L)预处理1 h后，给予含有体积分数0.5%人血清(AB型)的脂多糖(100 μg/L)
地塞米松+ TPCA-1组	给予地塞米松(100 nmol/L)加TPCA-1(1.0 μmol/L)预处理1 h后，给予含有体积分数0.5%人血清(AB型)的脂多糖(100 μg/L)

RT-PCR方法检测IKK-2受体阻滞剂(TPCA-1)、地塞米松及两种药物联合应用对脂多糖刺激前后细胞白细胞介素6，白细胞介素8，细胞间黏附分子1的影响：实验分组同Western blot检测。
PCR使用的引物包括：①GAPDH：上游5’-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3’，下游5’- TCC ACC ACC CTGTTG CTG TA-3’，用这对引物可扩增出长度为447 bp的GAPDH cDNA片段。②白细胞介素6：(+)5’-GGA GAC TTG CCT GGT GAA -3’，(-)5’-CTG AGG TGC CCA TGC TAC-3’，用这对引物可扩增出长度为330 bp的白细胞介素6 cDNA片段。③白细胞介素8：(+)5’-ATG ACT TCC AAG CTG GCC GTG GCT-3’，(-)5’-TCT CAG CCC TCT TCA AAA ACT TCT C-3’，用这对引物可扩增出长度为293 bp的细胞间黏附分子1cDNA片段。④细胞间黏附分子1：(+)5’-TGA CCA GCC CAA GTT GTT GG-3’，(-)5’-ATC TCT CCT CAC CAG CAC CG-3’，用这对引物可扩增出长度为380 bp的细胞间黏附分子1cDNA片段。
取5 μL PCR产物进行2%琼脂糖凝胶(含0.5 mg/L溴化乙锭)3 V/cm电泳30-50 min，紫外灯下照相，用凝胶成像处理系统对每一样品PCR产物扩增的特异性片断(白细胞介素6、白细胞介素8、细胞间黏附分子1和GAPDH)进行辉度扫描，以GAPDH密度作为参考定量标准，标本目的基因条带的吸光度参数与内参基因GAPDH条带的吸光度参数之比值作为该标本mRNA的相对定量。
免疫组织化学染色检测IKK-2受体阻滞剂(TPCA-1)、地塞米松及两种药物联合应用对脂多糖作用前后核转录因子кB的分布及表达：实验细胞的准备及分组同Western blot检测。免疫组织化学染色按试剂盒说明书操作。
主要观察指标：①角膜基质细胞脂多糖作用前后分泌白细胞介素1、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素8水平。②不同浓度的IKK-2受体阻滞剂(TPCA-1)、地塞米松对脂多糖作用前后分泌白细胞介素6，白细胞介素8蛋白的影响。③IKK-2受体阻滞剂(TPCA-1)、地塞米松及两种药物联合应用对脂多糖作用前后分泌白细胞介素6，白细胞介素8的影响。④IKK-2受体阻滞剂(TPCA-1)、地塞米松及两种药物联合应用对脂多糖作用后细胞白细胞介素6，细胞间黏附分子1蛋白和基因的影响。⑤IKK-2受体阻滞剂(TPCA-1)、地塞米松及两种药物联合应用对脂多糖作用前后细胞核转录因子кB表达。
统计学分析：所有数据用x±s表示。显著性检验采用SPSS 11.5软件，组间差异用方差分析、t 或秩和检验进行统计学检验。P < 0.05或P < 0.01为差异有显著性意义。

讨论

本研究结果提示IKK-2受体阻滞剂(TPCA-1)通过抑制炎性细胞因子表达可能会抑制炎性细胞的趋化，对免疫细胞和组织固有细胞各自发挥多种作用。IKK-2的小分子抑制物TPCA-1被发现有希望用于治疗炎症性疾病如哮喘[8]、关节炎以及眼部碱烧伤等情况的动物模型[9-11]，并且安全有效。
有研究证实中性粒细胞刺激角膜基质胶原降解[12]，炎性细胞和角膜固有的基质成纤维细胞的相互作用在角膜炎症中发挥重要的作用。TPCA-1比地塞米松对白细胞介素6，白细胞介素8及细胞表面细胞间黏附分子1更显著的抑制作用提示IKK-2受体阻滞剂(TPCA-1)在抑制感染性角膜炎症中可能发挥更重要的作用。它是否有不良反应尚需进一步探讨。
地塞米松可以抑制脂多糖作用下培养的角膜基质细胞白细胞介素6、重组人粒细胞集落刺激因子、单核细胞超化蛋白1、巨噬细胞炎症因子1、白细胞介素8以及细胞表面细胞间黏附分子1的表达升高[13]，通过抑制白细胞介素1诱导角膜基质成纤维细胞产生基质金属蛋白酶进而抑制了白细胞介素1诱导的角膜基质胶原降解。但地塞米松并不能抑制白细胞介素1诱导的角膜基质细胞IB的磷酸化和降解或核转录因子κB的核转位。地塞米松是通过不同的机制来表达这一生物效应的[14]，这种机制被认为是糖皮质激素介导的信号途径抑制作用[15]。
除了核转录因子κB，因子AP-1也促成了白细胞介素1信号发挥和基质金属蛋白酶表达[16]。AP-1由JNK、c-Jun 和c-Fos蛋白组成，是促分裂素活化的一个主要目标[17]。地塞米松抑制了白细胞介素1诱导的JNK(AP-1激活作用的主要成分)和c-Jun的磷酸化，地塞米松通过抑制JNK的磷酸化而对抗AP-1的功能表现在多种细胞。AP-1的结合位点出现于多种基质金属蛋白酶基因的启动子，包括基质金属蛋白酶1，3，和9[18]，地塞米松通过抑制AP-1信号途径降低炎性因子和基质金属蛋白酶表达[19]。地塞米松对JNK-AP-1信号途径激活的抑制作用可能促成其对脂多糖刺激下培养的角膜基质细胞白细胞介素6、白细胞介素8以及细胞表面细胞间黏附分子1的表达发挥抑制作用。
在原始上皮和内皮细胞，地塞米松抑制了核转录因子κB依赖的转录活性，但不改变IB水平或核转录因子κB的核转位。作者证实了相似的机制出现在角膜基质成纤维细胞。IKK-2阻滞剂在抑制脂多糖诱导的角膜基质成纤维细胞炎性因子表达和胶原降解方面应该和地塞米松同样有效，但是两种药物会发挥不同的作用机制[20-23]。IKK-2对核转录因子κB的激活发挥中心作用[24]。
从实验中证实，选择性IKK-2受体抑制剂TPCA-1对抑制脂多糖诱导的角膜基质成纤维细胞表达和分泌白细胞介素6、白细胞介素8以及细胞表面细胞间黏附分子1和地塞米松同样有效，并且与地塞米松有协同作用。
地塞米松等药物能够调节角膜基质成纤维细胞功能，抑制角膜胶原降解，抑制细胞因子、趋化因子产生，能够抑制角膜基质成纤维细胞在炎症反应过程中多种趋化因子、炎性因子的表达及增高，降低基质金属蛋白酶的表达，进而阻止溃疡的发生。但利用地塞米松进行治疗有很多副作用，例如增高眼内压、加重后囊下白内障、感染易感性增加，因此需要新的有效的非类固醇抗炎药物。
实验证实了IKK-2受体阻滞剂(TPCA-1)能在炎症反应中抑制白细胞介素6、白细胞介素8、细胞间黏附分子1等表达，是由于它阻断了IB磷酸化和降解以及继发的核转录因子κB核转位。提示IKK-2受体阻滞剂(TPCA-1)可能成为治疗角膜溃疡除地塞米松外的另一种选择或补充。可能成为治疗角膜溃疡药物发展方面新的选择。
以文章中的实验结果作为前期工作和基础，可以进一步深入探讨角膜炎症和角膜基质胶原降解的信号转导机制。并利用脂多糖建立角膜溃疡动物模型，进而进行体内试验，探讨IKK-2受体阻滞剂(TPCA-1)抑制角膜基质胶原降解及角膜溃疡的机制，从而为临床上治疗角膜溃疡这一严重致盲眼病提供重要的参考依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

IKK-2受体阻滞剂对角膜基质成纤维细胞的作用及机制

Effect and mechanism of IKK-2 receptor blocker on corneal stromal fibroblasts

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 4

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	张同同, 王中华, 文杰, 宋玉鑫, 刘林. 3D打印模型在颈椎肿瘤手术切除与重建中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1335-1339.
[2]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[3]	徐东紫, 张婷, 欧阳昭连. 心脏组织工程领域全球专利竞争态势分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 807-812.
[4]	吴子健, 胡昭端, 谢有琼, 王峰, 李佳, 李柏村, 蔡国伟, 彭锐. 3D打印技术与骨组织工程研究文献计量及研究热点可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 564-569.
[5]	常文辽, 赵杰, 孙晓亮, 王锟, 吴国锋, 周剑, 李树祥, 孙晗. 人工骨膜的材料选择、理论设计及生物仿生功能[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 600-606.
[6]	刘旒, 周箐竹, 龚桌, 刘博言, 杨斌, 赵娴. 胶原/无机材料构建组织工程骨的特点及制造技术[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 607-613.
[7]	刘飞, 崔宇韬, 刘贺. 局部抗生素递送系统治疗骨髓炎的优势与问题[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 614-620.
[8]	李晓壮, 段浩, 王伟舟, 唐志宏, 王旸昊, 何飞. 骨组织工程材料治疗骨缺损疾病在体内实验中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 626-631.
[9]	张振坤, 李喆, 李亚, 王莹莹, 王亚苹, 周馨魁, 马珊珊, 关方霞. 海藻酸盐基水凝胶/敷料在创面愈合中的应用：持续、动态与顺序释放[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 638-643.
[10]	陈佳娜, 邱燕玲, 聂敏海, 刘旭倩. 组织工程支架材料修复口腔颌面部软组织缺损[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 644-650.
[11]	邢浩, 张永红, 王栋. 长骨大段骨缺损修复方法的优势与不足[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 426-430.
[12]	陈思奇, 先德彬, 徐荣胜, 覃中杰, 张磊, 夏德林. 羟基磷灰石-磷酸三钙支架复合骨髓间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞对大鼠颅骨缺损修复早期成血管的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3458-3465.
[13]	刘鋆, 杨龙, 王伟宇, 周玉虎, 吴颖, 卢涛, 舒莉萍, 马敏先, 叶川. 聚3-羟基丁酸酯4-羟基丁酸酯/聚乙二醇/氧化石墨烯组织工程支架的制备和性能评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3466-3472.
[14]	王皓, 陈明学, 李俊康, 罗旭江, 彭礼庆, 李获, 黄波, 田广招, 刘舒云, 眭翔, 黄靖香, 郭全义, 鲁晓波. 脱细胞猪皮基质构建组织工程半月板支架[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3473-3478.
[15]	莫剑玲, 何少茹, 冯博文, 简敏桥, 张晓晖, 刘财盛, 梁一晶, 刘玉梅, 陈亮, 周海榆, 刘艳辉. 构建预血管化细胞膜片及血管形成相关因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3479-3486.