不同浓度Dlll4调节绒毛外滋养细胞的生物学功能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.24.017

摘要/Abstract

摘要：

背景：早孕时期绒毛外滋养细胞功能的正常发挥对妊娠有着至关重要的影响，绒毛外滋养细胞功能异常时将导致子痫前期、胎儿生长受限及胎盘植入等多种妊娠期疾病。
目的：探讨Notch信号家族配体Dll4对绒毛外滋养细胞的生物学功能的影响。
方法：以不同质量浓度外源性Dll4(0，0.125，0.25，0.5，1.0 mg/L)处理人绒毛外滋养细胞系HTR-8/SVneo，以CCK-8试验检测细胞活性，Transwell实验检测细胞迁移、侵袭能力的改变。
结果与结论：Dll4可明显促进绒毛外滋养细胞迁移与侵袭能力，而对细胞活性不产生显著影响；Dlll4对绒毛外滋养细胞侵袭功能的影响具有浓度依赖性。结果提示Dll4可通过调节绒毛外滋养细胞生物学功能，在妊娠过程很中发挥重要作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 组织工程, 绒毛外滋养细胞, Dll4, 迁移, 侵袭

Abstract:

BACKGROUND: Extravillous trophoblasts exert a crucial effect on early pregnancy. When extravillous trophoblasts function abnormally, many pregnancy diseases can develop, such as preeclampsia, fetal growth restriction and placental implantation.
OBJECTIVE: To investigate the effect of Dll4, a ligand of Notch signaling family, on biological functions of extravillous trophoblasts.
METHODS: Human extravillous trophoblast cell lines, HTR-8/SVneo, were cultured with human recombined protein Dll4 of different concentrations (0, 0.125, 0.25, 0.5, 1.0 mg/L). Cell viability was tested by cell counting kit-8 assay. Transwell assay was applied to examine the changes in cell migration and invasion ability.
RESULTS AND CONCLUSION: Dll4 could significantly improve migration and invasion abilities of extravillous trophoblasts, but had no effect on cell viability. In addition, Dll4 regulated the invasion ability of extravillous trophoblast in a dose-dependent manner. Above all, Dll4 can play an important role in normal pregnancy by regulating the biological functions of extravillous trophoblasts.

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Key words: 组织构建, 组织工程, 绒毛外滋养细胞, Dll4, 迁移, 侵袭

中图分类号:

R318

罗青清. 不同浓度Dlll4调节绒毛外滋养细胞的生物学功能[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(24): 3860-3864.

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图/表（结果） 1

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引言

胚胎着床后，滋养干细胞分化的细胞滋养细胞继续发育分化，形成绒毛外滋养细胞。绒毛外滋养细胞具有增生与侵袭两种表型，增生表型的绒毛外滋养位于绒毛基膜附近，为绒毛外分化途径的干细胞，具有增殖和分裂特性，具有表皮细胞生长因子(epidermal growth factor，EGF)受体并接受多种集落刺激因子调节而发生增殖；位于侵袭底板的绒毛外滋养细胞持续分化，逐渐失去表皮细胞生长因子受体而失去干细胞增殖特性，转为表达c-erB-2阳性表达，提示细胞转为侵袭表型^[1]。
侵袭表型的绒毛外滋养细胞进入母体子宫蜕膜及浅肌层，在对母体的侵袭过程中进一步分化为间质表型绒毛外滋养或血管内皮表型绒毛外滋养细胞^[2]。间质表型的绒毛外滋养细胞不侵袭血管，而血管内皮表型的绒毛外滋养细胞侵袭子宫螺旋动脉血管腔及血管壁。子宫螺旋动脉是母体与胎盘想通的终末动脉，妊娠期间被重铸改造的子宫螺旋动脉直接将血液引入胎盘内，保证妊娠期间正常的母胎气体交换与胎儿营养物质供应。子宫螺旋动脉重铸的主要依赖于绒毛外滋养细胞生物学功能的发挥[3]。绒毛外滋养细胞定向浸润和侵袭母体组织，逐步取代子宫螺旋动脉内皮细胞，重铸子宫螺旋动脉，使其成为高容低阻血管，与绒毛内新生血管相互沟通，形成胎盘血管网络并继续发育 ^[4]。在此过程中绒毛外滋养细胞表现出与肿瘤细胞类似的侵袭特性，但与肿瘤细胞恶性生物学行为不同的是，其增殖、迁移、侵袭等生物学功能具有严格的时间与空间限制^[5]。据报道，绒毛外滋养细胞在妊娠6周时开始侵入母体子宫蜕膜层，妊娠10周时子宫螺旋动脉血管内皮及肌层中可以检测到绒毛外滋养细胞的存在。妊娠16-18周时子宫螺旋动脉组织周围绒毛外滋养细胞的数量达到顶峰，原有内皮及肌层消失，动脉血管明显扩张。妊娠20周时，子宫螺旋动脉重铸完成，绒毛外滋养细胞数量及生物学功能逐渐减退^[6]。绒毛外滋养细胞生物学功能的正常发挥，对于子宫螺旋动脉重铸的完成，子宫胎盘循环血管扩容的建立有着至关重要的意义^[7]。绒毛外滋养细胞侵袭功能下降，将导致子宫螺旋动脉重铸不良，胎盘血氧供应下降，进而导致流产、胎儿生长受限、子痫前期等病理学改变[8]；而绒毛外滋养细胞浸润过深将导致滋养细胞肿瘤、胎盘植入等疾病^[9]。因此对绒毛外滋养细胞生物学功能的研究，可以更深刻的了解子宫螺旋动脉重铸这一生理过程，对相关妊娠期疾病的防治及早期干预、母胎良好妊娠结局的促进有着重要的意义。
Notch家族是进化高度保守的细胞内细胞传导信号通路系统^[10-11]。Notch信号通路参与了增殖、分化与凋亡等多种关键的生物学功能调节，对细胞的命运及组织器官的发育有着即为重要的意义。目前，在哺乳动物中共发现4个Notch受体(Notch1-4)。Notch家族配体一般为跨膜蛋白，其胞外区包含若干个表皮生长因子样重复序列(EGF-like repeats)和N端保守的DSL保守结构域，Notch配体胞外区EGF样重复序列的数量及DSL结构域在同Notch受体结合及受体活化的过程中具有重要作用[^12]。Notch配体和受体结合后，配体发生胞吞作用，促进受体异二聚体分离，介导受体活化^[13]。Notch配体又叫DSL蛋白，这是由于果蝇中Notch配体为Delta、Serrate，在线虫中为Lag-2。在哺乳动物中，与Delta高度同源的称为Delta或Delta like(Dll)，与Serrate高度同源的称为Jagged，已知在哺乳动物中共发现5种Notch配体，分别为Dll1，Dll3，Dll4，Jagged1和Jagged2^[14]。
Dll4作为Notch信号通路家族重要的配体成员，通过对血管内皮细胞和肿瘤细胞生物学功能的调节，在血管网络与肿瘤生长发育方面发挥重要的调控作用^[15]。绒毛外滋养细胞具有独特的“肿瘤细胞样”和“血管内皮细胞样”生物学功能^[16-17]。研究表明，Dll4在子痫前期和自然流产孕妇胎盘中的表达显著低于正常孕妇^[18-19]，其机制尚不清楚。猜测Dll4可能通过调控妊娠早期绒毛外滋养细胞的生物学功能，参与子宫螺旋动脉重铸过程，其异常可能与胎盘血管性疾病的病理过程有关。
本研究拟通过给予不同质量浓度外源性人重组Dll4蛋白，观察不同质量浓度Dll4对绒毛外滋养细胞生物学功能的影响，探讨Dll4在子宫螺旋动脉重铸生理过程及胎盘血管性疾病发病中的作用。

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材料方法

设计：单一样本观察。
时间及地点：实验于2013年6至12月在武汉协和医院中心实验室完成。
材料：
细胞：人绒毛外滋养细胞系HTR-8/SVneo获赠于加拿大皇后大学Graham教授。HTR-8/SVneo细胞系来源于人早孕正常胎盘，具有绒毛外滋养细胞免疫学及生物学表型[20]。

Dlll4对绒毛外滋养细胞生物学功能影响实验主要试剂与材料：
试剂与材料	来源
RPMI1640培养基	Hyclone公司
胎牛血清(FBS)	Gibco公司
人重组Dll4蛋白	PeproTech公司
CCK-8试剂盒	日本同仁公司
Matrigel^TM	BD公司
24孔Transwell培养板(滤膜直径6.5 mm；滤膜孔径8.0 μm)	Costar公司

实验方法：
HTR-8/SVneo细胞培养：用含体积分数10%胎牛血清的RPIM1640培养液置37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱培养，取对数期细胞用于实验。
细胞活性检测：采用CCK-8方法检测。收集对数期细胞，将细胞浓度调整为1×10⁸ L^-1，按每孔100 μL接种于96孔板，将培养板在37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱预培养 6 h，此时接种细胞都已贴壁。培养孔随机分为5组，每组设置5个复孔，向各孔中加入不同浓度sDLL4溶液，使得各组终质量浓度分别为0，0.125，0.25，0.5，1.0 mg/L。将培养板置于37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱培养24 h。各孔加入CCK-8试剂10 μL。在37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱继续培养4 h，用酶标仪测定各组在450 nm处的吸光度，并计算平均值，各组与空白试剂孔吸光度比值百分数即为细胞活性。实验重复3次。
细胞迁移与侵袭实验：预冷的Transwell培养板上室加入Matrigel混合液(Mtrigel∶1640=1∶1)，在37 ℃培养箱中放置2 h，使Matrigel聚合成胶。上室加入细胞浓度为1×10⁸L^-1的HTR-8/SVneo细胞悬液100 μL，分别加入sDll4至终质量浓度为0，0.125，0.25，0.5，1.0 mg/L，每一质量浓度设置3个复孔。下室加入500 μL含体积分数10%胎牛血清的1640培养基，37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中孵育。24 h后测定迁移至滤膜下表面的细胞数目。
测定方法如下：取出上室，用棉签将上室内液体吸去，再用湿棉签轻轻擦去上室Matrigel凝胶和滤膜上表面的细胞，40 g/L多聚甲醛固定，0.2%结晶紫染色，倒置显微镜(×200)下观察，每孔随机选择5个视野进行细胞计数。细胞迁移功能实验时，上室无需预包被Matrigel胶，其余操作与侵袭实验基本相同。实验重复3次。
侵袭/迁移指数=实验组迁移细胞数/对照组迁移细胞数。
主要观察指标：①HTR-8/SVneo细胞活性。②细胞迁移能力。③细胞侵袭能力。
统计学分析：采用SPSS软件进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

Dll4是由685个氨基酸残基组成的跨膜蛋白，一级结构分析表明为典型的Notch配体家族成员，其胞外区具有8个表皮细胞生长因子样重复序列和DSL结构域，其跨膜结构典型，胞内结构缺乏催化膜体^[21]。作为Notch信号通路家族重要家族成员，Dll4可以通过细胞-细胞直接接触，特异性识别并结合细胞胞膜上Notch受体Notch1与Notch4，激活相应信号通路，经过3次裂解， Notch受体胞内区形成活性片段NICD。活化的NICD从细胞近膜处脱落，直接转运至细胞核，与转录抑制因子CSL结合，激活下游靶基因，通过级联反应，产生多样的生物学效应，在转录水平完成对细胞功能的调控^[15]。Dll4是调控血管新生与血管发育的重要蛋白，与早期胚胎血管发育密切相关^[22]。Dll4在卵巢癌^[23]、肺癌^[24]、乳腺癌^[25]、胃癌和结肠癌^[26-27]等多种人肿瘤组织中的表达异常升高，并且其表达量的多少与肿瘤的临床分期及预后密切相关，提示其可以调控肿瘤细胞的生物学功能影响肿瘤组织的生长及发育。
近来研究表明，阻断Dll4后能明显抑制肿瘤的侵袭性，降低肿瘤新生血管，达到限制肿瘤生长的目的^[28]。胎盘是富含血管的组织，其生长发育过程与肿瘤组织具有一定的相似性^[29]。有研究表明，Dll4在人胎盘组织中亦具有广泛的表达^[30]。临床研究发现，子痫前期患者胎盘中Dll4表达水平显著低于正常妊娠者^[18]，而妊娠早期自然流产患者的流产组织中也存在Dll4的异常表达^[19]。这些研究结果提示，Dll4可能参与了妊娠相关生理过程的调控，其表达异常参与了妊娠期相关疾病的病理过程，但具体作用机制尚不明确。
绒毛外滋养细胞在胎盘的发生与发育过程中具有独特的“肿瘤细胞样”和“血管内皮细胞样”生物学功能^[16-17]，基于Dll4对血管内皮细胞及肿瘤细胞的关键调控作用，推测Dll4可以通过调节绒毛外滋养细胞的功能，参与妊娠过程。因此，本研究通过研究绒毛外滋养细胞系HTR-8/SVneo在不同浓度外源性Dll4刺激下细胞活性、迁移及侵袭功能改变，对Dll4与绒毛外滋养细胞生物学功能进行了初步探讨。
本实验结果表明，不同浓度的外源性Dll4对绒毛外滋养细胞系HTR-8/SVneo细胞的细胞活性并无显著影响，但可明显增加HTR-8/SVneo细胞在体外的迁移及侵袭能力，其效应具有浓度依赖性。向母体蜕膜及浅肌层迁移与侵袭，是早孕期绒毛外滋养细胞的重要生物学特性。绒毛外滋养细胞浸润不足与早期流产、子痫前期、胎儿生长受限等多种妊娠期疾病的病理机制相关^[31-32]。绒毛外滋养细胞浸润母体组织是一个主动的过程，具有时间性和空间性的特点。目前，绒毛外滋养细胞的浸润机制尚未完全清楚，目前学术界一致认可的是绒毛外滋养细胞对于母体浸润和血管改造受到了基质金属蛋白酶及其抑制物的调节。
基质金属蛋白酶是锌离子依赖性内肽酶，能降解细胞外基质中的多种成分，是侵袭过程中最为重要的细胞外基质蛋白降解酶。根据结构和对底物的选择性，基质金属蛋白酶可以分为如下5类^[33]：①明胶酶，包括基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9，又称为Ⅳ型胶原酶，主要降解明胶和变性的胶原，但不能降解间质胶原。②胶原酶，包括基质金属蛋白酶1，8，13，18，与明胶酶作用相互补充，其作用底物主要为间质胶原，但不能降解明胶和Ⅳ型胶原。③基质溶素(基质金属蛋白酶3，10，11)，此类作用底物主要为细胞外基质中的蛋白多糖和糖蛋白。④膜型金属蛋白酶(基质金属蛋白酶14，15，16，17，24，25)为跨膜蛋白或膜锚定蛋白，是基质金属蛋白酶的受体和激活剂。⑤其他基质金属蛋白酶，其功能和分类尚不清楚。尽管绒毛外滋养细胞在对母体的侵袭过程中表达各种基质金属蛋白酶，基质金属蛋白酶对绒毛外滋养细胞生物学功能的影响贡献大小并不是等同的。由于基底膜的主要成分为IV型胶原，目前认为基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9对妊娠早期绒毛外滋养细胞的侵袭作用影响更大^[34]。Huang等^[35]的研究表明，Dll4通过刺激肾癌细胞株786-O、769-P及caki-1中基质金属蛋白酶基质金属蛋白酶9的分泌，增强细胞侵袭能力。Funahashi等^[36]的研究也表明，Dll4介导的血管生成作用，是通过影响基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9的活性实现的，阻断Notch信号通路后，相关基质金属蛋白酶的分泌量下降。而Li等[37]的研究则人发现上调Dll4的表达能通过影响基质金属蛋白酶2的分泌，增强胃癌细胞的迁移能力与侵袭能力，从而参与胃癌的病理学过程；值得注意的是，在此过程中，他们并未发现基质金属蛋白酶9的升高。本研究中，外源性Dll4对绒毛外滋养细胞迁移及侵袭功能的影响亦可能通过类似的作用机制实现，而其具体的调节机制尚有待于进一步研究证实。
绒毛外滋养细胞的侵袭功能与多种信号通路的激活有关。近期研究已证实，Dll4可参与Akt/PI3K/mTOR等多条信号通路的活化^[38-39]。PI3K具有丝氨酸/苏氨酸激酶及磷脂酰肌醇激酶活性，是酪氨酸激酶和G蛋白受体重要的下有信号分子，活化的PI3K可以进一步激活Akt，即磷酸化Akt，通过进一步磷酸化下游靶蛋白存进细胞迁移、侵袭等生物学功能^[40]。Dll4对绒毛外滋养细胞侵袭能力的促进作用是否同这些信号途径的活化相关，是进一步研究的方向。
本研究结果表明，Dll4可明显促进绒毛外滋养细胞迁移与侵袭能力，而对细胞活性不产生显著影响。Dlll4对绒毛外滋养细胞侵袭功能的影响具有浓度依赖性。尽管其对绒毛外滋养细胞的具体调节机制有待更深一步探索， Dll4有望为子痫前期、胎儿生长受限等胎盘功能异常疾病的早期治疗提供新的可能。

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