天然牡蛎壳纳米体复合型骨材料修复骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.21.004

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究发现，牡蛎壳等很多海洋生物外壳等形成矿物质盐的过程与人体实际情况较为接近。
目的：观察天然牡蛎壳纳米体复合型骨材料修复骨缺损的效果。
方法：取30只成年大耳白兔，制作双侧桡骨骨缺损模型，随机均分为两组，实验组于骨缺损处植入天然牡蛎壳纳米体复合型骨材料，对照组于骨缺损处植入医用硫酸钙可注射型植骨材料，植入后2，8，12周进行X射线检查，了解植入骨材料周围组织生长结合情况；于第12周末获得双侧桡骨，利用生物力学测试系统检测桡骨抗弯曲强度，并利用彩色图像分析仪定量分析成骨情况。
结果与结论：植入后2周，两组骨材料密度较周边正常骨组织呈偏低，缺损与材料间边界清晰，未发现明显骨修复现象；植入后8周，两组骨材料均被较厚软组织全部包裹，实验组血管成分显著减少；植入后12周，两组骨材料紧密结合相邻组织，包裹骨材料的组织质地较韧，二者之间无界线，实验组桡骨表面形态已恢复至正常水平，在形态和质地结构方面与正常组织无明显区别，对照组仍存在明显投射分界影像。实验组桡骨抗弯曲强度和成骨量均显著大于对照组(P < 0.05)。表明天然牡蛎壳纳米体复合型骨材料修复骨缺损可以获得更好的桡骨抗弯曲强度，并促进新骨形成。

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 牡蛎壳, 纳米, 骨组织工程, 骨缺损, 修复

Abstract:

BACKGROUND: Oyster shells and other shells of marine organisms can transfer into mineral salts, which is closer to the actual situation of human being.
OBJECTIVE: To explore the effect of natural oyster shell nanocomposite material for bone defect repair.
METHODS: Thirty adult big-eared white rabbits were randomly divided into two groups after establishment of bilateral radial bone defect models: experimental group and control group were given implantation of natural oyster shell nanocomposite material and injectable calcium sulfate bone graft, respectively. X-ray examination was done at weeks 2, 8, 12 after implantation to understand the osseointegration of bone grafts. Bilateral radial bone specimens were taken at 12 weeks to detect bending strength using biomechanical testing system and quantitatively analyze the osteogenesis using a color image analyzer.
RESULTS AND CONCLUSION: At 2 weeks after implantation, the bone mineral density of bone grafts was lower in the two groups than the normal value, there was a clear boundary between the defect and graft, and no bone repair was found. At 8 weeks after implantation, the bone grafts were covered with thick soft tissues in the two groups, and the vascular component was reduced dramatically in the experimental group. At 12 weeks after implantation, the bone grafts were closely connected to the adjacent tissues in the two groups, with no boundary; the radius surface in the experimental group recovered to the normal level, and exhibited no difference from the normal tissues in aspects of morphology, texture and structure, but in the control group, there was still a clear projected boundary. The bending strength and osteogenic amount of the radius were significantly higher in the experimental group than the control group (P < 0.05). These findings indicate that the natural oyster shell nanocomposite material for bone defect repair can have a good blending strength of the radius that can promote
new bone formation.

Key words: Ostreidae, Tissue Engineering, Nanoparticles

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 1

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引言

随着时代的发展，各种原因，包括先天畸形、感染、中毒等疾病，以及肿瘤和创伤等导致的人体组织、器官缺损及相应功能的丧失，成为临床医学研究的焦点[1-2]。在对不同原因组织缺损等患者进行治疗时，替代物移植成为一种重要的修复手段。
目前，临床可以使用的替代物有多种类型，包括自体组织、异体组织及异种组织，还有人工合成材料等^[3-4]。不同的替代物均可获得一定的效果，但也存在不同的局限性和不足之处^[5]。因此，受到现实情况的影响，积极寻找更为有效、适合的替代物，日益引起全社会的广泛关注，并引发组织工程学的出现。组织工程学领域提倡利用各种组织工程材料进行疾病治疗^[6]。在骨组织修复中，对所使用的组织工程材料有一定的要求，首先，材料应当具备良好的生物相容性及生物降解性，并具有一定的机械强度，可满足实际修复的需要^[7-8]；其次，材料要具备易消毒性、易塑形，以更好地保证修复效果；另外，材料要具有良好的骨诱导性和骨传导性，并具备支持骨细胞生长和功能分化的表面化学性质与微结构，可与其他活性分子如骨形态发生蛋白、转移生长因子β复合共同诱导骨发生^[9]。
随着时代的发展，纳米技术也开始积极地与骨组织工程技术发生融合。牡蛎壳在成长过程方面与人体骨较为相似，将其与纳米技术结合在一起可获得相应的复合型骨材料，用来进行骨组织修复。牡蛎是海洋生物，其外壳主要成分是文石型碳酸钙，并含有丰富的氨基酸和微量金属元素。牡蛎属于软体动物门的双壳纲，全世界的牡蛎有18属100多种，中国大概有20种，全世界年产量在80万吨以上。牡蛎壳资源广泛，来源丰富，取材不破坏生态环境。牡蛎壳含有丰富的微量元素和大量氨基酸，具有较好的皮质骨替代潜能。牡蛎壳的形成是由粒细胞不断分泌的无机盐堆积而形成的矿物质盐，其纳米颗粒的形成与骨沉积有相似的特点。牡蛎壳和骨组织并非同源，但它们的形成机制却有类似之处。牡蛎壳具有良好的生物相容性、可降解性、骨传导性及良好的成骨性能。牡蛎壳资源丰富，结构致密，强度与皮质骨相当。实验通过大体扫描电镜观察牡蛎壳复合型骨材料横断面，可以观测到5-20层致密的骨板样结构，呈同心圆柱排列，板厚度在200-300 nm之间，板间由相互沟通的管道系统相联系，最宽的管道达600 nm，平均300 nm，这和人体骨骨板、哈佛氏管、浮克曼管的数量、密度、形状、孔径及走向规律相类似，用排液法测得的骨材料孔隙率高达40%-50%，当孔隙超过30%以后，孔隙之间可达到互相连通，新骨组织可以从材料表面长入内部，形成网络状结构；骨材料抗压强度为45-49 MPa；孔隙率控制在30%-50%，既能达到孔之间相通，又能满足临床初期对材料强度的要求，有效发挥材料的支架作用。这种多孔结构形成的材料三维通道增大了材料与受植区组织器官的接触界面，有利于加速界面结合的反应过程，为新骨组织长入材料中提供通道和容纳场所，并为携带骨诱导物质(骨形态发生蛋白、骨髓)提供空间。该材料可根据需要通过预制或注塑的方式成形，具有良好的可操作性，植入后即可为缺损区的软组织提供足够的硬组织保护。本次研究即探讨天然牡蛎壳纳米体复合型骨材料在骨组织修复中的应用效果。

材料方法

设计：随机分组对照动物观察实验。
时间及地点：于2014年3月在德州市人民医院完成。
材料：
植骨材料：医用硫酸钙可注射型植骨材料MⅡGX3(美国 Wright 医疗技术公司)。
实验动物：30只成年大耳白兔，体质量2.5-3.5 kg，雄雌各半，均由北京大学医学部动物实验中心提供，许可证号：SYXK(京)2006明25。喂养环境和健康状况均良好。将30只白兔随机均分为两组，分别设为对照组和观察组。
实验方法：
天然牡蛎壳纳米体复合型骨材料的制备：取本地区无污染海域近江牡蛎，将内容物取出，留外壳，于流水下冲刷清洗3次，自然条件下风干。风干后将牡蛎壳置于40%乙酸溶液中浸泡，2 h后取出，于流水下冲刷3次，然后置于流水下冲洗24 h。蒸馏水清洗3次，自然风干。通过机械方法将牡蛎壳碾压成颗粒状，分别用40目和100目过滤筛过滤，得到约0.15 mm大小的牡蛎壳粉末。采用溶液共混法制备牡蛎壳纳米体复合型骨材料：将消磨后的牡蛎壳碳酸钙粉剂放入乙醇和氯仿中48 h脱脂，再浸泡在双氧水中进行脱蛋白处理，完成好以上的脱抗原处理后，将牡蛎壳碳酸钙粉剂与MⅡG 塑形剂按1∶5混合，固化后期在预制品表面嵌入成孔材料，采用熔解成孔材料的方法在预制品表面形成直径达200-400 μm的孔隙，并用排液法测定孔隙率为40%-50%。根据实验动物的骨缺损，制作人工桡骨替代材料，直径0.5 cm，长度1.0 cm，略带圆饼状，将预制品常规高温高压消毒后备用。对制作好的骨材料进行扫描电镜观察，证实其具备诱导新生骨生长骨材料的基础性能。
分组干预：利用0.1 g/mL水合氯醛以4 mL/kg剂量对实验动物进行耳缘静脉注射麻醉，手术制备双侧桡骨骨缺损模型，桡骨骨缺损大小为1.0 cm。对照组、观察组分别于骨缺损处植入医用硫酸钙可注射型植骨材料、天然牡蛎壳纳米体复合型骨材料。
本次研究相关内容和方法均经本院伦理部门审核并批准，实验设计方案、使用动物品种品系规格、处死动物的方法、项目进行中涉及动物福利和伦理问题等均符合相关要求。
修复结束常规缝合切口，并予以止血、抗感染治疗和喂养。修复结束后对两组动物的术后大体生存情况和切口愈合情况等进行观察和记录，并在术后2，8，12周分别进行X射线检查，了解植入骨材料周围组织生长结合情况；12周末，将实验动物处死，获得双侧桡骨，利用生物力学测试系统对两组的桡骨抗弯曲强度进行检测，利用彩色图像分析仪(由杭州万深检测科技有限公司提供)对组织切片进行定量分析，了解成骨情况。
主要观察指标：动物术后大体生存情况；动物的术后切口愈合情况；动物术后X射线检查结果；动物的术后桡骨抗弯曲强度及成骨情况。
统计学分析：对研究所得数据利用SPSS 18.0软件进行处理，其中两组白兔的术后桡骨抗弯曲强度等均行t 检验。检测P值，如果经检测P < 0.05，则提示经比较两组数据间差异存在显著性意义。

讨论

骨损伤和骨缺损是临床上常见的疾病，多种原因会导致骨缺损等的出现，包括肿瘤切除治疗和感染及创伤等^[10]。临床对各种骨缺损等患者进行治疗的时候，大多采用利用各种骨修复材料进行修复治疗的方式^[11]。
目前治疗骨缺损的主要方法是骨移植，包括自体骨移植和异体骨移植等多种方式。但是，经过大量的研究也发现，不同的修复方法在获得一定修复效果的同时，也都不可避免的存在一定的局限性等。其中，自体骨取自患者本人，在来源方面十分有限^[12]，且在进行移植的过程中需要对患者造成新的创伤，不利于患者恢复。同样，异体骨移植也存在一定的缺陷。虽然在来源方面较之自体骨移植存在十分明显的应用优势，但也容易出现排斥等情况，无法获得满意的临床效果[13]。
现如今，随着时代的发展，临床治疗过程中对各种骨修复材料的需求越来越大，因此，临床迫切需要积极开发各种新型的骨修复活性材料，以更好地满足实际治疗的需求。于是，各种新型的材料开始被积极应用于临床骨修复治疗之中。
各种海洋生物外壳是一个重要的骨修复材料来源，以碳酸钙为主体的生物材料富含Ca2+及CO32-，具有良好的生物相容性，与人体骨成长过程之间具有一定的相似之处。牡蛎是一种常见的海洋生物，外壳中含有大量的碳酸钙和氨基酸及各种微量金属元素^[14]，且牡蛎外壳的降解产物为Ca2+及CO32-，均为人体自身离子，因此具有良好的生物相容性。对牡蛎壳与骨组织进行比较，可以发现二者并非同源，但在形成机制方面，二者却存在一定的相似之处^[15-19]。2004年，《Science》杂志报道，牡蛎壳等很多海洋生物外壳等形成矿物质盐的过程与人体实际情况较为接近^[20]。其他一些国外学者也通过研究证明，经适当处理，牡蛎壳具有良好的生物活性^[21]。较之人体内骨盐的沉积过程，牡蛎壳与珊瑚的形成与之高度相似，这些报道也表明，临床选择骨修复材料时，可以积极考虑各种资源丰富的海洋生物贝壳类材料^[22]。
另外，在利用各种骨生物材料进行临床骨缺损等修复时，需要具备良好的物理强度和生物相容性^[23-27]。Simkiss[28]研究报道，以牡蛎壳为生物材料，将其移植到小鼠体内，进行观察可以发现，实验小鼠并未出现任何不良反应。结果表明，以牡蛎壳为主的生物材料具有良好的生物相容性。以牡蛎壳为生物材料，联合纳米技术，可以获得新型复合型材料。通过一定的方法将几种单一材料复合，可以综合不同材料的优缺点，形成复合型支架材料。国内一些学者也通过研究证实，冯永增等^[29]按照一定比例混合牡蛎壳粉和消旋聚乳酸(PDLLA)，并利用热致相分离法(TIPS)进行处理，可以获得多孔复合人工骨(OPCB)材料。通过对该材料的检测分析可以发现，其多种性能均十分良好，可以很好地满足骨替代材料的要求，包括良好的孔隙率和孔径，以及体外可降解性和较强的生物力学强度等。本次研究过程中，即通过构建动物骨缺损模型的方式，对不同骨修复材料的应用效果进行分析，结果显示，术后两组实验动物均一般情况良好，伤口均良好愈合，未出现感染、化脓、死亡等，表明两种骨修复材料均具有良好的生物相容性。牡蛎壳表面的多孔结构形成材料的三维通道，可以增加材料与受植区组织器官的界面，有效促进界面结合的反应过程，从而为新骨组织长入材料中提供通道和容纳场所，并为携带骨诱导物质提供了所需的空间。经过粉碎等加工处理之后，其仍然具有良好的生物活性。本次研究结果还显示，经术后2周X射线检查显示，两组植入区内骨材料的密度较之周边正常骨组织均呈偏低状态；术后8周，两组植入区内骨材料均被较厚软组织全部包裹，但观察组血管成分呈现出显著减少的情况；术后12周，两组植入区内骨材料紧密结合相邻组织，但对照组仍存在明显投射分界影像，植入区内骨材料的密度高于周边正常骨组织，而观察组桡骨表面形态已经恢复至正常水平，在形态和质地结构方面较之无损组织不存在明显区别。结果表明，利用牡蛎壳纳米体复合型骨材料进行骨缺损修复治疗，在阻止结缔组织长入方面可以获得更好的效果，更好地引导新生骨的形成，于是经影像学检查新生骨与材料可出现叠加，出现密度增高影像。另外，结果还显示，术后12周，经桡骨抗弯曲强度检测和彩色图像分析仪定量分析，可得观察组桡骨抗弯曲强度和成骨量均显著大于对照组(P均 < 0.05)，即表明利用天然牡蛎壳纳米体复合型骨材料进行骨组织修复可以获得更好的桡骨抗弯曲强度，促进新骨的形成。并且，中国拥有丰富的海洋资源，在牡蛎壳等海洋资源方面十分充足，将对各种海洋资源的开发与组织工程学结合起来，可以更好地利用各种资源，并获得更多优质的组织工程材料，更好第为临床骨缺损治疗等服务，具有十分重要的现实意义和广阔的应用前景^[30]。
综上所述，经动物模型实验发现，表明天然牡蛎壳纳米体复合型骨材料修复骨缺损可以获得更好的桡骨抗弯曲强度，并促进新骨形成，本实验结果也为牡蛎壳材料的进一步研究奠定了一定的基础。因此，天然牡蛎壳纳米体复合型骨材料具有一定的研究价值，可以积极尝试对其的进一步研究，以更好地指导临床治疗。