在复合成分培养基中骨髓间充质干细胞的诱导成骨

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.10.005

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究显示骨质疏松多伴有成骨细胞的减少，成骨细胞替代疗法成为治疗骨质疏松症的新靶点。

目的：观察人骨髓间充质干细胞在含地塞米松、维生素C及β-甘油磷酸钠培养基中向成骨细胞分化的能力。

方法：采用人淋巴细胞分离液从成人骨髓血中分离纯化间充质干细胞，应用流式细胞仪检测其表面标志物的活性，透射电镜观察骨髓间充质干细胞的超微结构；将骨髓间充质干细胞在含有地塞米松、维生素C与β-甘油磷酸钠的成骨诱导培养基中诱导分化， RT-PCR检测骨髓间充质干细胞成骨诱导后骨形态发生蛋白2 mRNA的表达情况。

结果与结论：培养2周后可见细胞呈成纤维状生长，强表达CD44，CD29，不表达CD34，CD45，具有向成骨细胞诱导分化的潜能，茜素红及碱性磷酸酶染色阳性，骨形态发生蛋白2 mRNA表达阳性，说明人骨髓间充质干细胞在含地塞米松、维生素C及β-甘油磷酸钠培养基中可向成骨细胞诱导分化，具有治疗骨质疏松症的潜能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 人骨髓间充质干细胞, 成骨细胞, 诱导分化

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that the number of osteoblasts is often decreased after osteoporosis, and osteoblast replacement therapy becomes a new target for the treatment of osteoporosis.

OBJECTIVE: To observe the osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells cultured in dexamethasone, vitamin C and beta-glycerophosphate.

METHODS: Mesenchymal stem cells were isolated and purified from adult bone marrow using human lymphocyte separation medium. The expression of cell surface markers was detected by flow cytometry. Cell ultrastructure was observed by transmission electron microscope. Then, the bone marrow mesenchymal stem cells were cultured in osteogenic induction medium containing dexamethasone, vitamin C and β-glycerophosphate, and RT-PCR was used to detect the bone morphogenetic protein-2 mRNA expression after osteogenic induction.

RESULTS AND CONCLUSION: A large number of adherent cells were visible as fibrous growth at 2 weeks after culture and strongly expressed CD44, CD29, but did not express CD34, CD45. These cells could be induced to differentiate into osteoblasts, and express bone morphogenetic protein-2 mRNA. Alizarin red staining and alkaline phosphatase staining were positive for the cells. These findings suggest that human bone marrow mesenchymal stem cells cultured in dexamethasone, vitamin C and beta-glycerophosphate can differentiate into osteoblasts, and has a potential for the treatment of osteoporosis.

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Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Osteoblasts, Cell Differentiation

中图分类号:

R394.2

徐丽丽，孙晓娟，郝秀仙，谢婷婷，杨乃龙. 在复合成分培养基中骨髓间充质干细胞的诱导成骨[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(10): 1501-1501.

Xu Li-li, Sun Xiao-juan, Hao Xiu-xian, Xie Ting-ting, Yang Nai-long . Osteogenic induction of human bone marrow mesenchymal stem cells cultured in complex medium[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(10): 1501-1501.

图/表（结果） 7

2.1 人骨髓间充质干细胞的形态用人淋巴细胞分离液分离纯化得到单个核细胞，第7天首次换液后可见细胞贴壁，第10天贴壁细胞逐渐增多，散见长梭样细胞形成，第18天细胞可接近70%-80%融合，细胞形态呈圆形、梭形、多角形，混杂有其他细胞杂质，传代后的细胞生长速度明显加快，三四天可传代1次。传代后的细胞形态较均一，主要呈长梭形，以平行生长为主，或呈漩涡和火焰状生长，细胞纯度在第3代后明显提高(图1)。

2.2 人骨髓间充质干细胞表面标志物表达流式细胞仪检测显示，骨髓间充质干细胞强表达透明质酸受体CD44和整合素家族成员CD29，阳性率分别为99.4%，99.2%；不表达造血干细胞标志CD34(<1%)和内皮细胞标志CD106 (<1%)，见图2，3。

2.3 人骨髓间充质干细胞超微结构透射电镜显示细胞呈长形或梭形，核异染色质少，核仁明显，胞浆中有扩张的粗面内质网、微管、微丝，可见内质网向外分泌微丝；少数细胞核质比大，胞浆少，胞浆中细胞器少，核仁明显，具有间充质干细胞特征(图4)。

2.4 人骨髓间充质干细胞成骨诱导后茜素红染色结果经成骨诱导后，人骨髓间充质干细胞由典型的长梭形逐渐变成立方形及不规则形，并出现聚集成团的趋势。诱导3周后细胞经茜素红染色，可见被染成红色的钙结节(图5)，对照组无钙结节的形成。

2.5 碱性磷酸酶活性测定结果随诱导时间的延长，碱性磷酸酶活性呈逐渐升高趋势，空白对照组无碱性磷酸酶活性(表1)。

2.6 诱导组和对照组人骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2 mRNA表达情况 RT-PCR检测结果显示，连续诱导 14 d后，空白对照组无骨形态发生蛋白2 mRNA表达，而成骨诱导组骨形态发生蛋白2 mRNA强表达，见图6。

参考文献

[1]Gong Y, Slee RB, Fukai N, et al. LDL receptor-related protein 5(LRP5) affects bone accrual and eye development. Cell. 2001;107(4):513-523.
[2]Tamai K, Semenov M, Kato Y, et al. LDL-receptor-related proteins in Wnt signal transduction. Nature. 2000;407(6803): 530-535.
[3]Ventura C, Cantoni S, Bianchi F, et al. Hyaluronan mixed esters of butyric and retinoic Acid drive cardiac and endothelial fate in term placenta human mesenchymal stem cells and enhance cardiac repair in infarcted rat hearts. J Biol Chem. 2007;282(19):14243-14252.
[4]徐丽丽,匡弢,张佳. 体外诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化：两种方法的比较[J].中国组织工程研究,2013,17(45): 7821-7826.
[5]姚旺祥,裴国献,刘勇,等.兔胎盘源性间充质干祖细胞的分离方法比较[J].生物医学工程与临床,2007,11(2):85-87.
[6]杨乃龙,张红艳,孙晓娟,等.人胎盘间充质干细胞的体外分离纯化及成骨能力的研究[J].中国骨质疏松杂志,2010,16(11): 824-828.
[7]Parolini O, Alviano F, Bagnara GP, et al. Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells. Stem Cells. 2008;26(2): 300-311.
[8]Phinney DG, Kopen G, Isaacson RL, et al. Plastic adherent stromal cells from the bone marrow of commonly used strains of inbred mice: variations in yield, growth, and differentiation. J Cell Biochem. 1999;72(4):570-585.
[9]Aubin JE. Osteoprogenitor cell frequency in rat bone marrow stromal populations: role for heterotypic cell-cell interactions in osteoblast differentiation. J Cell Biochem. 1999;72(3): 396-410.
[10]White A, Lamb PW, Barrett JC. Frequent downregulation of the KAI1(CD82) metastasis suppressor protein in human cancer cell lines. Oncogene. 1998;16(24):3143-3149.
[11]Kumar S, Mahendra G, Nagy TR, et al. Osteogenic differentiation of recombinant adeno-associated virus 2-transduced murine mesenchymal stem cells and development of an immunocompetent mouse model for ex vivo osteoporosis gene therapy. Hum Gene Ther. 2004; 15(12):1197-1206.
[12]Raisz LG. Pathogenesis of osteoporosis: concepts, conflicts, and prospects. J Clin Invest. 2005;115(12):3318-3325.
[13]Gruber R. Cell biology of osteoimmunology.Wien Med Wochenschr. 2010;160(17-18):438-445.
[14]冉博.大鼠骨髓基质细胞在体外诱导成骨成脂分化的实验研究[D]. 呼和浩特:内蒙古医学院, 2009.
[15]Phinney DG. Biochemical heterogeneity of mesenchymal stem cell populations: clues to their therapeutic efficacy. Cell Cycle. 2007;6(23):2884-2889.
[16]魏毅东,徐亚伟,陈艳清,等. 骨髓间质干细胞移植治疗急性心肌梗死的实验研究[J].同济大学学报:医学版,2008,29(4):13-16.
[17]Kern S, Eichler H, Stoeve J, et al. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 2006;24(5):1294-1301.
[18]Kim SW, Han H, Chae GT, et al. Successful stem cell therapy using umbilical cord blood-derived multipotent stem cells for Buerger's disease and ischemic limb disease animal model. Stem Cells. 2006;24(6):1620-1626.
[19]Pittenger MF, Martin BJ. Mesenchymal stem cells and their potential as cardiac therapeutics. Circ Res. 2004;95(1):9-20.
[20]Jiang Y, Jahagirdar BN, Reinhardt RL, et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 2002;418(6893):41-49.
[21]段轶滗,乔鑫,税青林. 脐血间充质干细胞的培养及诱导分化的研究进展[J].西南军医,2009,11(5):939-941.
[22]Broxmeyer HE. Biology of cord blood cells and future prospects for enhanced clinical benefit. Cytotherapy. 2005; 7(3):209-218.
[23]Lee OK, Kuo TK, Chen WM, et al. Isolation of multipotent mesenchymal stem cells from umbilical cord blood. Blood. 2004;103(5):1669-1675.
[24]Spees JL, Gregory CA, Singh H, et al. Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy. Mol Ther. 2004;9(5): 747-756.
[25]Mori M, Sadahira Y, Awai M. Characteristics of bone marrow fibroblastic colonies (CFU-F) formed in collagen gel. Exp Hematol. 1987;15(11):1115-1120.

引言

材料方法

设计：细胞学体外实验观察。

时间及地点：于2013年11月至2014年5月在青岛大学附属医院痛风病实验室完成。

对象：进行髂骨移植或髋部骨折治疗的患者5例，均为女性，年龄18-50岁。

纳入标准： ①年龄18-55岁。②患者知情同意并签署知情同意书，研究方案经青岛大学附属医院伦理委员会批准。

排除标准： ①其他系统性疾病如高血压、糖尿病、冠心病等。②原发性骨质疏松症和继发性骨质疏松症。

实验方法：

骨髓间充质干细胞分离、纯化与扩增培养：无菌条件下抽取患者骨髓2 mL，置于肝素钠抗凝管中。在超净台内将骨髓与2 mL PBS混合重悬后加入等量人淋巴细胞分离液，2 000 r/min离心10 min后尽量吸取白膜层，用体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁸ L^-¹，接种于T25塑料培养瓶中，置于37 ℃，体积分数为5%的CO₂恒温培养箱中培养。7 d后首次全量换液弃去未贴壁细胞，以后每两三天换液1次。细胞达85%融合后，0.25%胰蛋白酶37 ℃消化2 min，1 000 r/min离心 5 min，弃上清，按1∶2比例传代，继续培养，倒置显微镜下观察细胞生长情况，取生长状态良好的第3代细胞进行实验。

人骨髓间充质干细胞表面标志物的检测：取第3代人骨髓间充质干细胞，0.25%胰蛋白酶消化后调整细胞浓度为1.0×10⁹ L^-¹，加1 mL PBS重悬细胞，分装每管0.2 mL，分别加入鼠抗人抗体CD29-PE、CD106-PE各0.04 mL，CD34-FITC，CD44-FITC各0.01 mL，对照组加入FITC、PE各0.04 mL、0.02 mL，4 ℃避光反应30 min，1 500 r/min离心后加入多聚甲醛0.2 mL避光保存，流式细胞仪检测。

人骨髓间充质干细胞的超微结构观察：0.25%胰蛋白酶消化第4代人骨髓间充质干细胞为单细胞悬液，2.5%戊二醛固定，4 ℃过夜，PBS洗涤2次，1%锇酸固定2 h后梯度乙醇脱水，常规Ep0812包埋并聚合，超薄切片，醋酸铀枸橼酸铅染色，在EM-100s透射电镜下观察骨髓间充质干细胞超微结构。

人骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化：取处于对数生长期的第3代人骨髓间充质干细胞，0.25%胰蛋白酶消化后，以8×10⁴/孔直接接种于无菌6孔培养板中(预先经多聚赖氨酸处理)进行成骨细胞诱导，其中3个孔为诱导组，另3个孔为对照组。细胞达到80%融合后，诱导组去掉原培养液，换为成骨细胞诱导培养基(含0.1 μmol/L地塞米松、50 μmol/L维生素C、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、体积分数为10%胎牛血清的DEME/F12)，以后每3 d换液1次，对照组持续加体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养，倒置显微镜观察细胞的形态变化。

碱性磷酸酶活性检测：将处于对数生长期的第3代人骨髓间充质干细胞用0.25%胰蛋白酶消化后，以2×10⁸ L^-¹的细胞浓度接种到24孔板，分别在诱导3，6，9，12，14 d时吸除培养液，PBS清洗2遍，每孔加入0.1% TritonX-100 500 μL，裂解40 min后反复吹打各孔细胞，收集裂解液，按照试剂盒说明书进行操作，在酶标仪520 nm波长处测定各孔吸光度值，并按照试剂盒说明书提供的公式计算碱性磷酸酶活性。

茜素红染色：诱导3周后弃去原培养基，PBS洗涤2次，40 g/L多聚甲醛室温固定30 min，PBS洗涤2次，0.5%茜素红染剂37 ℃孵育30 min，弃染色液，PBS洗涤2次，室温干燥，在显微镜下观察、拍照。

RT-PCR检测人骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2 mRNA表达：人骨髓间充质干细胞连续成骨诱导14 d后，按照OMEGA公司E.Z.N.A.^TMTotal RNA KitⅠ(R6834-01)说明书提取细胞总RNA。使用OMEGA公司M-MLV frist strand cDNA Synthesis Kit(TQ2501-01)进行反转录，合成cDNA。产物进行PCR扩增，反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s(GAPDH 60 ℃退火30 s)，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸7 min。反应体系以管家基因GAPDH为内参基因。

引物序列：骨形态发生蛋白2上游引物：5’-GGT GGA ATG ACT GGA TTG-3’，下游引物：5’-GCA TCG AGA TAG CAC TG-3’，扩增产物片段189 bp；GAPDH上游引物：5’-GGT GGA CCT GAC CTG CCG TCT AGA-3’，下游引物：5’- TTA CTC CTT GGA GGC CAT GTG GG-3’，扩增产物片段283 bp；扩增产物于2%琼脂糖凝胶电泳后，用Image J软件对扩增条带吸光度进行测定，并分析计算骨形态发生蛋白2与管家基因GAPDH的吸光度比值。

主要观察指标： ①人骨髓间充质干细胞形态、表面标记物表达、超微结构、成骨诱导分化能力。②人骨髓间充质干细胞成骨诱导后骨形态发生蛋白2 mRNA的表达情况。

统计学分析：采用SPSS 17.0进行统计学处理，实验数据以x(_)±s表示，各组之间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

对骨髓间充质干细胞鉴定现在尚无统一标准，目前主要依靠细胞形态、克隆增殖能力、细胞表面标记物、多向诱导分化能力进行鉴定^[3-10]。实验中发现骨髓干细胞最初贴壁时呈不规则形，原代培养大约2周后迅速生长逐渐变成长梭形，铺满瓶底后以平行生长为主，或呈漩涡和火焰状生长，传代后细胞增殖能力明显增强，三四天即可传代。通过流式细胞仪检测细胞表面标志，人骨髓间充质干细胞表达CD44、CD29，不表达CD34、CD106，与其他来源的间充质干细胞相同。

碱性磷酸酶是成骨细胞的标志性酶之一，也是成骨细胞活动(造骨)的副产物，而且在体内的钙化中也起关键性作用，可以破坏钙化抑制剂，从而启动钙化。茜素红可以结合钙剂从而鉴定钙结节，也是成骨细胞特性的特异性指标之一，两者结合起来可以肯定贴壁细胞的成骨能力，同时也肯定了骨髓间充质干细胞向中胚层细胞分化的能力。

骨形态发生蛋白属于转化生长因子β超家族成员，其中骨形态发生蛋白2被认为是活性最强的诱导成骨因子之一^[11-15]。骨形态发生蛋白2主要诱导未分化的间充质细胞不可逆地分化为软骨细胞和成骨细胞，通过钙盐沉积，导致新骨形成，启动骨生成，具有高效的异位诱导成骨作用，但对已分化、成熟的成骨细胞和软骨细胞无生物学效应。还有研究表明，缺少骨形态发生蛋白2表达的小鼠出生后2周后将会出现明显的微小骨折，如果这些破坏不修复，机体将在短时间内出现明显骨折^[16]。

现阶段治疗骨质疏松主要以药物方法为主，但是这种治疗方法存在着花费高、药物存在毒副作用、治疗疗程较长、疗效不理想等缺点，所以需要寻求更理想的方法。骨质疏松症的主要机制是：①过度骨吸收导致骨量丢失和骨质破坏。②未形成适合生长发育最佳的骨骼力学基础。③骨形成不足无法更替受损骨。骨形成减少的病理核心是成骨细胞数量和功能下降，因此骨质疏松症可以通过诱导间充质干细胞向成骨细胞分化来增加成骨细胞的数量从而达到治疗效果。人骨髓间充质干细胞具有定向诱导分化的生物学潜能^[17-25]，具有大规模培养的可能，可以为组织工程提供潜在的理想种子细胞，为骨质疏松症及骨质疏松骨折提供了实验依据，为临床应用提供了基础研究支持。

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