角膜移植模型大鼠急性排斥期应用转化生长因子β1对肿瘤坏死因子α的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.05.021

摘要/Abstract

摘要：

背景：同种异体角膜移植是目前治疗角膜盲最有效的方法。然而角膜移植排斥反应的发生率居高不下，研制高效低毒的免疫抑制药物是亟待解决的问题。
目的：建立角膜移植大鼠模型，在植片急性排斥期，检测空白对照组和使用转化生长因子β1滴眼液植片组的肿瘤坏死因子α的表达。
方法：建立同种异体穿透性角膜移植模型大鼠，随机分为空白对照组；1%环孢素A滴眼组(环孢素A组)；转化生长因子β1滴眼组(转化生长因子β1组)，从术后第1天开始用药，1滴/次，3次/d；术后所有受大鼠术眼点0.3%氧氟沙星滴眼液、0.5%托品酰胺滴眼液，3次/d，第12天停药。取角膜植片行苏木精-伊红染色以及免疫组织化学染色(SABC法)检测角膜植片中肿瘤坏死因子α在各组角膜组织的表达及分布情况。
结果与结论：苏木精-伊红染色显示：空白对照组植片显著增厚，大量单核细胞和淋巴细胞浸润，转化生长因子β1滴眼液组角膜植片厚度正常，无明显炎性细胞浸润。免疫组织化学显性：转化生长因子β1滴眼液组的植片肿瘤坏死因子α阳性细胞数量均较空白对照组减少(P < 0.05)。提示转化生长因子β1滴眼液可减少角膜移植模型大鼠急性排斥期植片中肿瘤坏死因子α蛋白的表达，而且可以减少炎症细胞对角膜植片的浸润，这可能就是转化生长因子β1抗排斥的主要机制之一。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

全文链接：

关键词: 实验动物, 移植, 角膜移植, 排斥反应, 转化生长因子β1, 肿瘤坏死因子α

Abstract:

BACKGROUND: Allogeneic penetrating keratoplasty is the most effective method for treating corneal blindness. However, the incidence of rejections is high after keratoplasty, so it is urgent to develop an immunosuppressive drug with high efficacy and low toxicity.
OBJECTIVE: To establish allogeneic penetrating keratoplasty models and monitor the expression of tumor necrosis factor-α in blank control group and after transforming growth factor-β1 eyedrop during acute rejection period of corneal grafts.
METHODS: Allogeneic penetrating keratoplasty models were established and were randomly divided into blank control group, ciclosporin A group (1% ciclosporin A), and transforming growth factor-β1 group (1 μg/ml transforming growth factor-β1 eyedrop). The medications from each group commenced at 1 day after surgery, one eyedrop once, three eyedrops per day. All the operated eyes were given 0.3% ofloxacin ophthalmic solutions and 0.5% tropicaide ophthalmic solution, three times per day, for 12 days. The corneal grafts were harvested for hematoxylin-eosin staining and immunihistochemical staining (SABC method), to detect tumor necrosis factor-α expression in corneal grafts.
RESULTS AND CONCLUSION: Hematoxylin-eosin staining showed that, corneal grafts were significantly thickened, a large number of histoleucocytes and lymphocytes infiltrated in the blank control group; corneal grafts showed normal thickness and no inflammatory cells infiltrated in the transforming growth factor-β1 group. Immunohistochemical staining showed that, there were less cells positive for tumor necrosis factor-α in the transforming growth factor-β1 group compared with the blank control group (P < 0.05). Transforming growth factor-β1 eyedrops can reduce the expression of tumor necrosis factor-α in the corneal grafts during acute rejection period, and reduce the inflammatory cells infiltration in the corneal grafts, which is probably the mechanism of transforming growth factor-β1 to prevent and treat corneal allograft rejection.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

全文链接：

Key words: Corneal Transplantation, Graft Rejection, Transforming Growth Factor beta1, Tumor Necrosis Factor-alpha

中图分类号:

R318

王恒，陆晓和，左炜. 角膜移植模型大鼠急性排斥期应用转化生长因子β1对肿瘤坏死因子α的影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(5): 778-782.

Wang Heng, Lu Xiao-he, Zuo Wei. Effects of transforming growth factor-beta1 on tumor necrosis factor-alpha expression of corneal allografts during acute immunological rejection in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(5): 778-782.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 实验选用受体SD大鼠18只，分为3组，对于建立模型过程中因感染、前房出血、前房消失的角膜植片水肿、浑浊退出实验的动物给予及时补充，造模成功进入结果分析18只。

2.2 各组角膜移植模型大鼠角膜植片裂隙灯显微镜观察结果 角膜移植后12 d，空白对照组大鼠的角膜植片混浊、水肿，新生血管生长，瞳孔不可见(图1A)；环孢素A组大鼠的角膜植片混浊水肿较空白对照组轻，新生血管生长较少，瞳孔隐约可见(图1B)；转化生长因子β1组大鼠的角膜移植后12 d角膜植片透明，无新生血管生长，瞳孔清晰可见(图1C)。

2.3 各组大鼠角膜组织病理学检查结果 正常大鼠角膜上皮细胞层由五六层细胞组成，基质层胶原排列整齐，无水肿、混浊，无淋巴细胞等炎性细胞浸润。角膜移植后12 d，苏木精-伊红染色显示空白对照组角膜组织在急性排斥期角膜植片水肿、增厚、上皮基底细胞有空泡形成、间质结构疏松并伴大量炎细胞浸润，基质层可见新生血管管腔；空白对照组角膜上皮细胞排列不规则，植片增厚明显，基质层中可见大量淋巴细胞浸润及新生血管形成，在植床缝线周围可见异物巨细胞，板层细胞结构排列紊乱。环孢素A组、转化生长因子β1组角膜上皮修复良好，无明显新生血管生长，基质无水肿，板层细胞排列规则，仅有少量炎性浸润。

2.4 各组角膜移植模型大鼠角膜免疫组织化学染色结果 细胞膜、细胞浆呈棕黄色染色者为肿瘤坏死因子α阳性细胞。肿瘤坏死因子α在急性排斥期大鼠角膜植片整个上皮细胞及基质层有强表达，角膜中央亦有表达，在植片伤口周围比中央区更为明显。治疗组较空白对照组表达减弱(图2)。

不同组之间的评分差异有显著性意义(F=21.800，P=0.000)，肿瘤坏死因子α含量由高到低依次为空白对照组、环孢素A组和转化生长因子β1组，环孢素A组、转化生长因子β1组与空白对照组比较，差异均有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

参考文献

[1] Vail A , Gore SM, Bradley BA, et al. Conclusions of the corneal transplant follow up study. Br J Ophthalmol.1997;81: 631-636.
[2] Eurich D,Neumann UP,Boas-Knoop S,et al.Transforming growth factor-β1-gene polymorphism in the development of kidney diseaseafter liver transplantation.Transplantation. 2012;93(5 ):555-560.
[3] Tanabe T,Kanoh S,Moskowitz WB,et al.Cardiac asthma: transforming growth factor-β from the failing heart leads to squamous metaplasia in human airway cells and in the murine lung.Chest.2012;142(5):1274-1283.
[4] de Menezes Neves PD, Machado JR, dos Reis MA, et al. Distinct expression of interleukin 17,tumor necrosis factor α,transforming growth factor β,and forkhead box P3 in acute rejection after kidneytransplantation. Ann Diagn Pathol.2013; 17(1):75-79．
[5] Huss DJ,Winger RC,Peng H,et al.TGF-beta enhances effector Th1 cell activation but promotes self-regulation via IL-10.Immunol.2010;184(10):5628-5636.
[6] Hu B,He Y,Wu Y,et al.Activated allogeneic NK cells as suppressorsof alloreactive responses. Biol Blood Marrow Transplant.2010;16(6) :772-781．
[7] Han KL,Thomas SV,Koontz SM,et al.Adenosine A-A receptoragonist-mediated increase in donor-derived regulatory T cells suppressesdevelopment of graft-versus- host disease.J Immunol.2013;190(1):458-468．
[8] Wu LM,Zhou L,Xu J, et al.Lack of association between genetic polymorphisms in cytokine genes and tumor recurrence in patients with hepatocellular carcinoma undergoing transplantation.Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 2013;12(1):54-59．
[9] Le Texier L,Thebault P,Carvalho-Gaspar M, et al. Immunoregulatory function of IL-27 and TGF-β1 in cardiac allograft transplantation.Transplantation.2012;94(3):226-233.
[10] Williams KA,Coster DJ.Penetrating corneal transplantation in the inbred rat:a new model.Invest Ophthalmol Vis Sci. 1985; 26(1):23-30.
[11] Torres PF, De Vos AF, Van der Gaag R, et al. CytokinemRNA expression during experimental corneal allograft rejection. J Exp Eye Res 2006;63:453-461.
[12] Sano Y, Osawa H, Sotozono C, et al. Cytokine expression during orthotopic corneal allograft rejection in mice.Invest Ophthalmol Vis Sci 2008; 39:1953-1957.
[13] Zhu S, Dekaris I, Duncker G, et al. Early expression of proinflammato rycytokines interleukin and tumor necrosis factor alpha after corneal transplantation. J Interferon Cytokine Res. 2009;19(6):661-669.
[14] 张新华,钟翠平,周播江,等.转化生长因子β1基因修饰树突状细胞延长移植心脏存活时间的研究[J].现代免疫学,2004, 24(6): 464-469
[15] DePaz HA, Oluwole OO, Adeyeri AO, et al. Immature rat myeloid dendritic cells generated in low-dose granulocyte macrophage-colony stimulating factor prolong donor specific rat cardiac allograft survival. Transplantation. 2003; 75(4): 521-552.
[16] 闫峰,蔡莉,惠延年,等.TGFβ2-DC对小鼠同种异体角膜移植排斥反应的抑制作用[J].国际眼科杂志, 2007,7(2):346-349.

引言

同种异体角膜移植是目前治疗角膜盲最有效的方法。角膜移植是器官和组织移植中最常见和成功率最高的手术，但排斥反应仍是目前造成其手术失败的主要原因，穿透性角膜移植的排斥反应发生率仍占10%-30%，尤其在血管化角膜、角膜严重感染、大植片移植、第二次移植等，免疫排斥率高60%^[1]。因此，如何降低和预防角膜移植后排斥反应已成为目前临床亟待解决的问题，研制高效低毒的免疫抑制药物是亟待解决的问题。人和大鼠转化生长因子β1的同源性高达99%。许多细胞表面都有转化生长因子β受体，转化生长因子β1具有多种生物活性。研究表明，转化生长因子β1对免疫反应的多个环节具有下降性调节作用，它具有作为免疫抑制剂用于防治器官移植免疫排斥的潜在性。

转化生长因子β1是一类具有多种生物活性的细胞因子。属于细胞因子转化生长因子β家族的一员，哺乳动物只表达其中3个，即转化生长因子β1、转化生长因子β2和转化生长因子β3，其作用除了影响发育、病理生理等生物学过程，最主要功能是影响免疫反应的过程^[2-3]。在近期的研究中，发现转化生长因子β的作用主要是通过以下过程而发挥作用的：①可以抑制T细胞的增殖，有效抑制效应T细胞的功能，调节CD4⁺T细胞，从而抑制使其分化成Th1和Th2效应细胞^[4-5]。控制CD8⁺ T细胞增殖和效应功能。从而抑制表达多种效应器分子，如干扰素γ和穿孔素等^[6-7]。②转化生长因子β具有影响B细胞发展的作用，它涉及淋巴细胞的增殖和浆细胞分泌所有二级同型抗原的过程，其抑制增殖作用和刺激细胞凋亡能力与它调节B细胞生发中心和增殖节点有不可或缺的关系^[8]。③抑制产生细胞因子如：白细胞介素2、自然杀伤细胞的细胞^[9]。那么在移植过程中，转化生长因子β1是否能够抑制同种异体排斥反应或者增强宿主防御，在急慢性排斥反应中对组织器官发挥免疫抑制作用？实验通过检测角膜移植大鼠在植片急性排斥期使用转化生长因子β1滴眼植片的肿瘤坏死因子α的表达，观察对角膜移植排斥反应的防治作用，并讨论其作用机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
全文链接：

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2009年1至6月在南方医科大学实验室及药剂科等完成。

材料：

实验动物：供体SPF级Wistar大鼠，体质量200-220 g，雌雄兼用；受体SPF级SD大鼠，体质量200-220 g。实验动物由自南方医科大学实验动物中心提供，Wistar大鼠粤检证字SCXK粤2010-0015，SD大鼠粤检证字SCXK粤2011A010。

实验方法：

同种转化生长因子β1滴眼液的制备：按无菌操作法，取高压灭菌的1×PBS液(0.01 mol/L，pH 7.14)5 mL溶解 10 μg干粉状转化生长因子β1，再加入50 μL吐温-20，搅拌至完全溶解，无菌过滤，即得2.0 mg/L转化生长因子β1滴眼液，倍比稀释制备1.0 mg/L转化生长因子β1滴眼液。

同种异体穿透性角膜移植模型的建立及角膜取材：参照Williams等^[10]方法，对供体Wistar大鼠双眼取植片，受体大鼠都选择右眼手术。均于术前30 min以0.5%托品酰胺眼药水滴眼3次充分散瞳，5 g/L盐酸丁卡因表面麻醉；用体积分数10%水合氯醛以3.5 mL/kg的剂量腹腔注射麻醉。手术全程使用眼科手术显微镜。供体用3.5 mm环钻在角膜中央钻切，用眼科显微剪取下角膜植片，内皮面朝上，用黏弹剂保护以备使用。受体用3.0 mm环钻钻取中央角膜以制作植床。将植片置于植床，10-0丝线间断缝合8针，用冲洗针头注入无菌空气形成前房，结膜囊内涂红霉素眼膏。6-0丝线缝合睑缘，术后1 d拆除。保留10-0缝线直至取材。

实验分组：动物随机分为3组，空白对照组、环孢素A组、转化生长因子β1组，每组6只。术后用药：空白对照未做特殊处理；环孢素A组用1%环孢素A滴眼液点眼，1滴/次，3次/d；转化生长因子β1组用转化生长因子β1滴眼液点眼，1滴/次，3次/d。术后所有受体术眼点0.3%氧氟沙星滴眼液、0.5%托品酰胺滴眼液，3次/d，第12天停药。

自术后1 d开始在裂隙灯显微镜下进行临床观察，1次/d，于裂隙灯下观察角膜移植片透明度及新生血管生长情况。参照Larkin等制定的评分标准，包括植片混浊、水肿、新生血管指标，当3项之和(排斥反应指数RI)当RI≥6时，即认为排斥反应发生。由于手术因素而造成感染、前房出血、前房消失的角膜植片水肿、浑浊退出实验，并及时补充实验动物。

实验动物均于术后12 d用过量水合氯醛溶液麻醉，立即拆除全眼球。置于40 g/L多聚甲醛溶液固定，1 d后，在显微镜下取其完整角膜，常规石蜡包埋切片备用。1份标本制作3张切片，其中1张用来制作苏木精-伊红染色，其余的切片行肿瘤坏死因子α免疫组织化学染色。

病理组织学检查和免疫组织化学染色过程：

免疫组织化学染色过程：①切片脱蜡至水，放置于配制的体积分数0.3%H₂O₂在室温下处理10 min，然后用蒸馏水洗，2 min/次，共3次。②用微波炉修复抗原：将切片浸入0.01 mol/L枸橼椽酸盐缓冲液中(pH值6.0)，微波炉加热至沸腾后立即断电，反复两三次，间隔5-10 min，冷却。③抗原修复液进一步暴露抗原:滴加在切片上，室温下作用5-10 min，然后用0.1 mol/L的PBS洗3次，2 min/次。④封闭:加正常山羊血清封闭，室温作用10 min，甩去多余液体，不洗。⑤滴加特异型一抗：兔抗大鼠肿瘤坏死因子α单克隆抗体。每张切片滴加抗体，4 ℃冰箱过夜。⑥滴加生物素化山羊抗兔lgG，室温下作用20 min后用0.1 mol/L的PBS洗3次，2 min/次。⑦滴加SABC复合物，室温20 min； 0.1 mol/L的PBS洗3次，2 min/次。⑧DAB显色，用蒸馏水洗涤镜下控制反应时间。⑨苏木精轻度复染、脱水、透明、封固。

阳性结果判定标准：细胞膜、细胞浆呈棕黄染色者为阳性细胞。以环孢素A组、转化生长因子β1组标本与试剂盒中未染色的已知阳性对照片同时染色作阳性对照，用PBS代替一抗作为空白对照，用光镜观察肿瘤坏死因子α在各组大鼠角膜组织的表达部位及强度(所有部位均取角膜的中央区)。高倍镜下对切片中染色的阳性细胞进行双盲两人计数及评分，计算每200倍视野下阳性细胞数，阳性细胞评分标准为：0(未见阳性细胞)，1(1-10个阳性细胞)，2(11-20个阳性细胞)，3(21-30个阳性细胞)，4(>30个阳性细胞)。

主要观察指标：①各组大鼠角膜组织病理学检查结果。②各组大鼠角膜免疫组织化学染色结果。

统计学分析：采用SPSS 13. 0统计学软件处理，测定结果中的计量资料均以x(_)±s表示。比较不同组别大鼠角膜植片中阳性细胞的评分采用单向方差分析，显著性标准为α=0.05。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

全文链接：

讨论

同种异体角膜移植排斥反应是以细胞毒T淋巴细胞介导的植片组织被破坏为主的病理过程，是相当复杂的T细胞表面分子、细胞因子以及其他相关因素相互作用的结果。目前研究认为与角膜移植免疫作用关系密切的细胞因子主要有肿瘤坏死因子、转化生长因子β1、白细胞介素1、白细胞介素2以及调节活化正常T细胞表达与分泌的趋化因子等。

肿瘤坏死因子α是一种重要的免疫因子，在肝、心、肾等器官移植排斥反应中的作用已经被证实。应用其拮抗剂可不同程度地延长移植物存活时间。肿瘤坏死因子α系统形成的免疫调节网络机制，在角膜移植排斥反应中也发挥着重要作用。Torres等^[11]应用RT-PCR技术研究各类细胞因子mRNA在大鼠实验性角膜移植模型中的表达，发现术后7 d异基因移植鼠供受体缘处肿瘤坏死因子α mRNA表达增加。Sano等^[12]用酶链免疫吸附实验发现同基因及异基因角膜移植鼠，术后角膜白细胞介素1A及肿瘤坏死因子α的含量均明显升高。Zhu等^[13]以同样方法研究了角膜移植术后角膜中肿瘤坏死因子α的含量变化，发现术后2周异基因组两类因子含量均明显升高，但同基因组自术后1周即明显下降，亦推论肿瘤坏死因子α参与介导角膜移植排斥反应的发生。由此可见肿瘤坏死因子α作为一种炎症反应时重要的细胞因子，故作为本实验中检测指标。

近年对转化生长因子β1的研究取得了较大的进展，张新华等^[14]研究发现将转化生长因子β1基因修饰供者树突状细胞后输出Lewis大鼠，能有效的抑制移植排斥反应，延长心脏存活时间。DePaz等^[15]研究发现未成熟树突细胞可延长大鼠成活时间，使急性排斥反应降低，表达转化生长因子β1增加。闫峰等^[16]观察自体转化生长因子β2-树突状细胞对于同种异体角膜移植后免疫排斥反应的调节作用中发现转化生长因子β2-树突状细胞注射后，植片发生移植排斥反应的时间延迟，植片存活时间明显延长。

综上所述，目前认为转化生长因子β1的作用效应包括：①抑制几乎所有T淋巴细胞亚群的增殖和功能。特别是通过抑制白细胞介素2和白细胞介素2受体的mRNA表达阻止白细胞介素2依赖性T细胞的增殖和功能发挥。②抑制B淋巴细胞的增殖和功能，抑制IgG和IgM的产生。③抑制细胞毒性T细胞的增殖和自然杀伤细胞的活性。④抑制巨噬细胞活化。本实验中发现转化生长因子β1对肿瘤坏死因子α有下调作用，转化生长因子β1可明显的抑制肿瘤坏死因子α的表达，从而发挥免疫调节作用。究其机制可能是：①正常情况下，γ干扰素和肿瘤坏死因子α产生协同作用促进免疫

分子的表达和许旺细胞抗原提呈，使体内免疫系统反应性增高，启动自身免疫性炎症反应的发生。而转化生长因子β1可能是由于抑制T细胞的增殖和多种白细胞介素等细胞因子，阻断了共刺激信号的传导，阻断了角膜移植排斥反应中的多种细胞因子网络通路抑制了肿瘤坏死因子α的分泌，从而在角膜移植排斥反应发生的众多环节中发挥重要作用。②正常前房具有转化生长因子β1、肿瘤坏死因子α、白细胞介素4、白细胞介素10等保护因子，这些淋巴细胞对植片不产生损害作用。当前房中保护性细胞因子缺乏或丧失，而白细胞介素1，白细胞介素2，白细胞介素12，γ干扰素等上调时则发生排斥反应，转化生长因子β1滴眼液能有效穿透大鼠角膜，进入房水，提高转化生长因子β1的含量，而转化生长因子β1作为一种保护性因子，在前房中抑制肿瘤坏死因子α、γ干扰素、白细胞介素1，白细胞介素2、白细胞介素12等细胞因子的上调，对排斥反应的预防及治疗起重要的作用。本实验仍有待进一步推敲和完善，转化生长因子β1的作用机制仍有待进一步分析，而转化生长因子β1能否作为一种高效低毒的免疫抑制药物用于预防和降低角膜移植后排斥反应有待更多同行和学者进一步实验和研究。