构建食管癌移植瘤模型及不同剂量六神丸干预后的微血管密度变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.05.019

摘要/Abstract

摘要：

背景：六神丸是传统中药复方，具有清热解毒，散结消肿止痛之功效。现代药理证明六神丸具有抗炎、镇痛、强心、抗病毒、抗肿瘤等作用，临床上常用于各类感染性疾病、恶性肿瘤的治疗。
目的：探讨六神丸对食管癌移植瘤的抑瘤作用及对微血管密度、血管内皮生长因子表达的影响。
方法：通过复制人食管癌裸鼠移植瘤模型，将48只裸鼠随机分为六神丸高剂量组、六神丸中剂量组、六神丸低剂量组、顺铂组、模型组、空白组，按照给药方案用药。用药20 d后处死动物，称量瘤体质量，计算抑瘤率；免疫组化检测瘤组织微血管密度、血管内皮生长因子的表达。
结果与结论：六神丸高、中、低剂量组、顺铂组的移植瘤质量明显低于模型组，差异有显著性意义(P < 0.05)。六神丸高、中、低剂量各组移植瘤内微血管密度、血管内皮生长因子的表达明显低于模型组，但没有顺铂组明显。结果表明六神丸对食管癌移植瘤生长有明显抑制作用，通过下调肿瘤组织血管内皮生长因子表达活性、降低微血管密度，可能是六神丸抑瘤作用机制之一。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 消化系统损伤模型, 六神丸, 食管癌, 抑瘤作用, 血管内皮生长因子, 微血管密度

Abstract:

BACKGROUND: Liushen Pill is a traditional Chinese herbal formula, has the effects of heat-clearing and detoxicating, eliminating stagnation, detumescence and alleviating pain. Modern pharmacology verifies that Liushen Pill has anti-inflammatory, analgesic, cardiac, anti-viral, anti-tumor effects, and has been extensively used in the treatment of various infectious diseases and malignant cancer.
OBJECTIVE: To investigate the inhibitory effects of Liushen Pill on esophageal cancer xenografts, and effects on microvessel density and vascular endothelial growth factor expression.
METHODS: After reproducing nude mouse models of human esophageal cancer, 48 nude mice were randomly divided into high-dose Liushen Pill group, moderate-dose Liushen Pill group, low-dose Liushen Pill group, cisplatin group, model group and blank group. According to medication regimen, drugs were given. The growth of transplanted tumor of nude mice was dynamically observed in each group. The nude mice were sacrificed after 20 days of treatment. Neoplasm weight was taken and the tumor-suppressing rate was calculated. Immunohistochemistry was used to detect microvessel density and the expression of vascular endothelial growth factor.
RESULTS AND CONCLUSION: The weight of transplanted tumor was significantly lower in the high-dose Liushen Pill group, moderate-dose Liushen Pill group, low-dose Liushen Pill group, and cisplatin group than in the model group (P < 0.05). Microvessel density and the expression of vascular endothelial growth factor were obviously lower in the each Liushen Pill group than in the model group, but not as apparent as that in the cisplatin group. Results suggested that Liushen Pill can inhibit the growth of the esophageal cancer xenografts. Liushen Pill can down-regulate the expression of vascular endothelial growth factor and reduce microvessel density, which is one of the tumor-inhibiting mechanism of Liushen Pill.

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Key words: Esophageal Neoplasms, Vascular Endothelial Growth Factors, Drugs, Chinese Herbal

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析 参加实验BALB/c裸小鼠48只，均进入结果分析，中途无脱落。

2.2 人食管癌裸鼠移植瘤模型的复制 裸鼠皮下接种5 d后陆续出现可触及的小结节。实验结束后，取该组织的苏木精-伊红染色切片，光镜下观察可见大量人食管癌细胞，其大小不一、形态不一、结构不规则、细胞核增大、细胞核与细胞质比例失常，证实模型复制成功。

2.3 裸鼠一般状态行为观察 食管癌移植瘤模型建立后，空白组小鼠精神状态良好，反应灵敏，食量、尿便正常，体质量正常增长。各造模组裸鼠接种5 d后陆续出现可触摸的皮下实体瘤，瘤体日渐增大，大小不一，质较硬，移动度差，裸鼠食量及饮水量日渐减少，形体日渐消瘦，其中顺铂组裸鼠在给药时间段食量及饮水量明显下降，后段时间慢慢恢复，体质量逐渐减轻；六神丸各组在给药期间食量、饮水量及体质量变化无明显差异。造模20 d后，采用颈椎脱臼法处死裸鼠，剪开皮肤，暴露接种部位，发现瘤体。

2.4 六神丸对各组食管癌移植瘤生长的影响 根据各组食管癌移植瘤的生长情况绘制曲线(图1)，与模型组相比，给药各组对人食管癌移植瘤生长均出现不同程度的抑制。其中六神丸高剂量组和顺铂组移植瘤生长最为缓慢，抑制作用优于其他各组。由图可知，六神丸具有抑制肿瘤生长的作用，与药物剂量有一定的关系。

2.5 六神丸对移植瘤质量、抑瘤率的影响 六神丸高、中、低剂量组、顺铂组的移植瘤抑制率分别为42.13%，30.41%，24.24%，58.62%。六神丸高、中剂量组、顺铂组的移植瘤质量明显低于模型组，差异有非常显著性意义(P < 0.01)，六神丸低剂量组的移植瘤质量也低于模型组，差异有显著性意义(P < 0.05)；六神丸中、低剂量组、模型组的移植瘤质量与顺铂组比较，差异有非常显著性意义(P < 0.01)，六神丸高剂量组的移植瘤质量与顺铂组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

2.6 各组瘤组织病理形态学观察 剥取皮下瘤体组织，可见模型组瘤体组织体积较大，包膜欠完整，其切面灰白呈鱼肉状，镜下可见细胞分裂差，异形性明显(图2A)；六神丸各组肿瘤体积稍小，包膜完整，镜下可见肿瘤细胞异形性较明显，坏死面较大(图2B-D)；顺铂组肿瘤体积小，包膜完整，镜下肿瘤细胞异形性不明显，坏死面大(图2E)。

2.7 六神丸对食管癌移植瘤微血管密度表达的影响 各组肿瘤病理标本经CD34染色，观察发现瘤组织间质血管均有染色，以内皮细胞被染成棕黄色为阳性表达，各组微血管的大小、数量、形态均有较大差异(图3)。在模型组瘤组织内可见大量新生毛细血管，给药各组阳性表达细胞颗粒均减少。镜下统计结果显示：模型组小鼠肿瘤微血管密度即平均积分吸光度、平均阳性血管面密度均较高，为358.15±137.46和8.17±1.25，六神丸高剂量组、顺铂组微血管密度值均显著低于模型组(P < 0.01)，给药各组平均阳性血管面密度与模型组比较，差异有非常显著性意义(P < 0.01)，见表2。结果显示：六神丸高剂量组、顺铂组均能显著降低肿瘤组织微血管数量，抑制血管生成作用明显。

2.8 六神丸对食管癌移植瘤血管内皮生长因子表达影响 各组肿瘤病理标本经血管内皮生长因子免疫组化染色，镜下可见模型组瘤组织及其间质大量呈片状或团块状分布的棕黄色颗粒，给药各组阳性表达细胞明显减少(图4)。结果统计显示：六神丸高、中剂量组、顺铂组平均灰度值、平均面密度阳性率均显著低于模型组，差异有非常显著性意义(P < 0.01)，六神丸低剂量组平均灰度值、平均面密度阳性率也低于模型组，差异有显著性意义(P < 0.05)，给药各组均显著高于顺铂组(P < 0.01)，见表3。结果表明：六神丸高、中、低剂量组、顺铂组均能显著抑制瘤体组织细胞血管内皮生长因子表达。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2014年1至7月在湖南中医药大学中医诊断病理生理实验室完成。

材料：

实验动物：健康雄性BALB/c 6-8周龄裸小鼠，SPF级，体质量18-22 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘)2009-0004。

瘤株：人食管癌细胞Eca-109，购于湖南长沙远泰生物技术公司。

实验药物：①六神丸：雷允上药业有限公司苏州雷允上制药厂出品，产品批号：IA18005，规格：10粒/支×6支/盒(每1 000粒重3.125 g)。②顺铂：齐鲁制药有限公司出品，产品批号：0070152DB，规格：10 mg/支。

主要试剂：鼠抗人VEGF单克隆抗体，SABC免疫组化试剂、CD34鼠抗人单克隆抗体(购自武汉博士德公司)。

主要实验仪器设备：超净工作台(苏净安泰公司)，CO₂培养箱(SHEL-LAB，Hitachi)，倒置显微镜(XDS-1B，重庆光学仪器厂)，台式离心机(TDZ5-40，长沙天创仪器公司)，双重纯水蒸馏器(上海玻璃仪器一厂)，BFXS-320型离心机(河北白洋离心机厂)；切片机(SLEE-CUT5062，德国SLEE公司)，BMJ-1型生物组织包埋机(上海珂淮仪器有限公司)。

实验方法：

动物分组：BALB/c 6-8周龄裸小鼠48只，按完全随机原则查随机数字表将8只裸鼠设为空白组。除空白组外，其余40只造模后按随机数字表分5组：六神丸高剂量组、六神丸中剂量组、六神丸低剂量组、顺铂组、模型组，每组8只。

食管癌移植瘤模型的构建：参照Guan等^[4]的方法，采用皮下接种人食管癌细胞复制移植瘤模型。接种前，腹腔注射水合氯醛麻醉裸鼠，用体积分数为75%乙醇消毒进针部位。用带6号针头的1 mL注射器，抽取浓度为1×10¹⁰ L^-¹人食管癌细胞悬液0.2 mL(含2×10⁶个人食管癌细胞)，从腋部皮下进针，接种后，皮下出现皮丘，用棉球轻按压针孔片刻。待成瘤后病理切片验证模型是否成功。

给药方法：六神丸各组给药剂量根据“人和动物体表面积折算等效计量”表以60 kg成年人计算实验裸鼠标准用量为2.66 g/(kg•d)，裸鼠平均体质量20 g，则六神丸剂量标准为0.053 2 g/(只•d)。实验采用六神丸剂量标准为低剂量标准，中剂量为剂量标准的2倍[0.106 4 g/(只•d)]，高剂量为剂量标准的4倍[0.212 8 g/(只•d)]。

六神丸高、中、低剂量组给予质量浓度为0.532 g/mL，0.266 g/mL，0.133 g/mL的六神丸水溶液，0.2 mL/只，造模后第1天开始用药，每日上午9点给药1次，给药20 d。顺铂组给予质量浓度为0.1 g/L的现配顺铂水溶液，分别于造模后24，48 h腹腔注射顺铂1次，0.2 mL/只，共给药2次。模型组：造模后第1天开始给予蒸馏水0.4 mL灌胃，每日上午9点1次，灌胃20 d。空白组：常规给予食物、水。

裸鼠状态行为观察及肿瘤大小：给药期间，定期观察裸鼠精神、饮食、尿便及移植瘤生长情况，每5 d用游标卡尺体外测量移植瘤的长径(a)及短径(b)，按公式V(mm³)=ab²π/6计算移植瘤的体积。根据肿瘤体积的变化绘制各组移植瘤生长曲线。

抑瘤率：给药20 d后，颈椎脱臼法处死裸鼠，剥取瘤体，称取瘤体质量，按照公式计算瘤体的生长抑制率。抑瘤率=(模型组平均瘤体质量-给药组平均瘤体质量)/模型组平均瘤体质量×100%。

各组瘤组织病理形态学观察：给药20 d后，采用颈椎脱臼法处死裸鼠，剪开皮肤，显露接种部位，剥离周围肌肉及筋膜组织，剪下移植瘤，瘤组织经40 g/L多聚甲醛固定后，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片，常规苏木精-伊红染色，置光学显微镜下观察。

微血管密度、血管内皮生长因子表达测定：取食管癌移植瘤组织标本经40 g/L多聚甲醛充分固定48 h，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，每一组织块行4 pm连续切片4张，其中3张采用SABC法分别行CD34、VEGF免疫组化染色，参照试剂盒说明操作。染色切片在物镜为10倍的光镜下，选择阳性细胞较多的区域采集3-5个视野，输入HP₂AS-1000高清晰度彩色病理图像分析系统内，在统一的背底、倍体条件下，对积分光度、平均灰度、面密度进行计算机定量分析。积分吸光度=阳性目标面密度×积分光度，面密度阳性率=阳性目标面密度/(阳性目标面密度+阴性目标面密度)×100%。

统计学分析：计量资料以x(_)±s表示，多组比较采用单因素方差分析，方差齐性检验后，方差齐组间比较采用LSD法；方差不齐用Dunnett’s T3检验。用SPSS 17.0软件进行统计学处理，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

在肿瘤的生长和转移过程中新生血管的生成是必要条件之一，Folkman首先提出通过阻断肿瘤组织的血管生成以达到抑制实体瘤的生长和转移的方法，这为实体瘤的治疗提供了新的方向。血管形成是受到血管生成因子严格调控的，在正常情况下，血管生成促进因子与抑制因子处于平衡状态，血管内皮细胞维持稳定，血管有序生长。而在肿瘤组织中，由于血管生成因子之间的平衡被破坏，导致肿瘤血管生长因子过度表达，使得肿瘤组织血管无序生长，且由于肿瘤组织血管结构不同于正常组织，更有利于肿瘤组织的生长，进一步促进肿瘤的浸润和转移。血管内皮生长因子是近年来研究得最多也是最有价值的与血管生成机制有关的因子^[5]，能够参与血管内皮细胞的生长、增殖、分化和转移等过程从而调控血管生成。血管内皮生长因子在许多癌症中的过表达能促进肿瘤的血管生成^[6]，与肿瘤微血管密度的增加、较晚期肿瘤分期、较差的生存率有关^[7-8]。有研究发现食管鳞癌中血管内皮生长因子的表达与血管生成关系密切^[9-10]。Su等^[11]在研究中发现血管内皮生长因子C能上调CTTN的表达且促进食管鳞癌的转移。Peng等^[12]通过分析发现血管内皮生长因子的阳性表达与食管癌预后有明显关系。同时有研究发现血管内皮生长因子与微血管密度的表达有密切关系^[13-14]。

微血管密度能够反映肿瘤组织内的血液灌注情况，是目前评估肿瘤血管生成状态的金标准^[15]，与肿瘤血管生成的程度密切相关。肿瘤生成的血管数越多，肿瘤获取的营养、供氧也就越丰富，而且由于肿瘤血管独特的结构，也就更利于肿瘤细胞进入血液循环，则更容易发生肿瘤的复发和转移。在许多恶性肿瘤组织中的微血管密度计数都显著增高，与肿瘤的生长、转移和复发均有密切关系^[16]。有研究发现微血管密度的高表达与食管鳞癌的浸润及转移有关，对判断食管鳞癌的侵袭转移及预后有重要意义^[17]。因此，观察血管内皮生长因子、微血管密度的变化能够从肿瘤血管生成方面了解六神丸抗食管癌的机制。

食管癌属中医“噎膈”、“反胃”等范畴，以吞咽困难、胸膈痞满、疼痛、咽喉干燥感、食物反流等为临床特征，中医认为其发病是因人体内阴阳失调，热毒内生，气滞血瘀，毒瘀互结，久而成瘤，治疗方法有扶正固本、活血化瘀、清热解毒等，这与六神丸清热解毒、消肿散结止痛功效相符，故运用六神丸治疗食管癌具有一定的意义。六神丸出自于《雷允上诵芬堂方》，是清热解毒、散结消肿止痛代表方。六神丸中重用麝香、牛黄为君，辅以雄黄、蟾酥为臣，以珍珠、冰片为佐，全方共奏清热解毒、散结消肿止痛之功。现代药理研究也证明，六神丸具有抗炎、镇痛、强心、抗病毒、抗肿瘤等作用，临床上对各类感染性疾病、免疫功能失调性疾病、恶性肿瘤等疾病表现出独特的疗效^[18-20]。齐元富等^[21-23]发现六神丸具有抑制肝癌瘤体、S180肉瘤生长且有增效减毒作用。据报道在六神丸组方中，如蟾酥^[24-25]、雄黄^[26]、牛黄^[27]、麝香均具有抗肿瘤作用^[28]，这就进一步为六神丸抗肿瘤作用提供了理论支撑。在本次研究中，观察到六神丸对食管癌移植瘤具有抑制作用，且与药物浓度有一定的关系，同时发现各用药组微血管密度和血管内皮生长因子表达较模型组均明显减低，这表明六神丸可以通过减少肿瘤组织的微血管密度及血管内皮生长因子的表达，从而抑制肿瘤新生血管生成，达到抑制肿瘤生长的作用，其机制是否与血管内皮生长因子介导的信号通路调控、是否与促使肿瘤血管结构正常化有关等等，且由于六神丸具有一定的药物毒性，是否具有一定的血管毒性，都值得进一步研究。

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