化疗药物对骨髓间充质干细胞的损伤作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.50.008

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (50): 8080-8087.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.50.008

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化疗药物对骨髓间充质干细胞的损伤作用

王金焕，王振玲，王晓芳，赵智刚

天津医科大学肿瘤医院血液肿瘤科，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市“肿瘤防治”重点实验室，天津市 300060

收稿日期:2014-11-24 出版日期:2014-12-03 发布日期:2014-12-03
通讯作者: 赵智刚，副主任医师，天津医科大学肿瘤医院血液肿瘤科，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市“肿瘤防治”重点实验室，天津市 300060
作者简介:王金焕，女，1989年生，山东省济宁市人，汉族，天津医科大学在读硕士，主要从事干细胞生物学研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81172833)

Damage of chemotherapy agents to bone marrow mesenchymal stem cells

Wang Jin-huan, Wang Zhen-ling, Wang Xiao-fang, Zhao Zhi-gang

Department of Hemooncology, Tianjin University Cancer Institute & Hospital, Tianjin 300060, China

Received:2014-11-24 Online:2014-12-03 Published:2014-12-03
Contact: Zhao Zhi-gang, Associate chief physician, Department of Hemooncology, Tianjin University Cancer Institute & Hospital, Tianjin 300060, China
About author:Wang Jin-huan, Studying for master’s degree, Department of Hemooncology, Tianjin University Cancer Institute & Hospital, Tianjin 300060, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81172833

摘要/Abstract

摘要：

背景：多种化疗药物在杀灭肿瘤细胞的同时会产生骨髓抑制的不良反应，不仅仅损伤造血细胞，也对骨髓间充质干细胞造成损伤，明确各种化疗药物对骨髓间充质干细胞的作用有利于合理选择、搭配化疗药物，实现高效、低毒的临床疗效。
目的：探讨不同化疗药物对骨髓间充质干细胞增殖、分化和支持造血能力的影响。
方法：获取正常成人骨髓间充质干细胞(n=8)，用不同剂量化疗药物(环磷酰胺、马利兰、阿糖胞苷、柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙、甲氨蝶呤、地塞米松)对骨髓间充质干细胞进行处理。检测化疗药物对骨髓间充质干细胞的增殖、凋亡作用及化疗药物撤除后骨髓间充质干细胞的恢复能力；体外诱导药物处理后骨髓间充质干细胞向脂肪细胞和骨细胞分化，通过油红O和Von Kossa染色鉴定；RT-PCR检测药物处理后骨髓间充质干细胞造血因子的表达；集落形成实验检测药物处理后骨髓间充质干细胞支持造血的功能。
结果与结论：两种剂量的长春新碱、柔红霉素、足叶乙甙、阿糖胞苷和地塞米松不同程度诱导骨髓间充质干细胞凋亡，并且抑制骨髓间充质干细胞的增殖，其中长春新碱和地塞米松的抑制作用可以逆转，而柔红霉素、足叶乙甙和阿糖胞苷对间充质干细胞的抑制作用持续存在。化疗药物处理后骨髓间充质干细胞仍具有多向分化能力，可以在体外分化为脂肪细胞和成骨细胞。化疗药物处理后骨髓间充质干细胞同正常细胞一样表达造血相关因子：干细胞因子、单核细胞集落刺激因子、白细胞介素6和粒细胞集落刺激因子。柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙和阿糖胞苷处理后骨髓间充质干细胞支持造血能力明显下降。结果显示临床常用的一些化疗药物(长春新碱、柔红霉素、足叶乙甙、阿糖胞苷)可以影响骨髓间充质干细胞的增殖和支持造血能力，而不影响骨髓间充质干细胞表达造血相关因子和多向分化能力；部分化疗药物(环磷酰胺、甲氨蝶呤和马利兰)在使用浓度下不影响骨髓间充质干细胞的上述生物学特性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 化疗药物, 增殖, 多向分化, 支持造血, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Many chemotherapy drugs can produce adverse reactions, such as bone marrow suppression, when they kill tumor cells. It cannot only damage hematopoietic cells, but also damage bone marrow mesenchymal stem cells. To understand the role of various chemotherapy agents on bone marrow mesenchymal stem cells is conductive to rational choice of chemotherapy drugs as well as achievement of high-efficiency, low-toxicity, clinical efficacy.
OBJECTIVE: To investigate the changes in proliferation, differentiation and hematopoiesis support ability of bone marrow mesenchymal stem cells after exposure to chemotherapy agents.
METHODS: Mesenchymal stem cells were isolated from normal adult bone marrow and cultured in media with different chemotherapy agents (cyclophosphamide, busulfan, cytarabine, daunorubicin, vincristine, etoposide, methotrexate, dexamethasone). After exposure to chemotherapeutic agents, the changes of cell proliferation,
apoptosis and recovery ability were detected. In vitro drug-treated bone marrow mesenchymal stem cells differentiated into adipocytes and osteocytes, identified by oil red O and Von Kossa staining. RT-PCR method was used to detect the expression of hematopoietic cytokines in bone marrow mesenchymal stem cells after drug treatment. Colony formation assay was used to detect the hematopoiesis support ability of bone marrow mesenchymal stem cells after drug treatment.
RESULTS AND CONCLUSION: Bone marrow mesenchymal stem cells were resistant to three agents: cyclophosphamide, busulfan and methotrexate, and other agents could induce apoptosis of bone marrow mesenchymal stem cells and reduce the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells. However, bone marrow mesenchymal stem cells recovered after withdrawal of vincristine and dexamethasone. Bone marrow mesenchymal stem cells, after exposure to chemotherapy agents, still had the ability of multi-directional differentiation, which could differentiate into adipocytes and osteoblasts in vitro. Moreover, chemotherapy agent-treated bone marrow mesenchymal stem cells could express hematopoietic cytokines (stem cell factor, monocyte colony stimulating factor, interleukin-6 and granulocyte colony-stimulating factor) and possessed hematopoietic supportive ability. But, after exposure to daunorubicin, vincristine, etoposide, and cytarabine, bone marrow mesenchymal stem cells showed limited proliferation capacity and impaired haematopoiesis support ability. These findings demonstrate that chemotherapy agents commonly used clinically (daunorubicin, vincristine, etoposide, and cytarabine) can impact the proliferation and hematopoiesis supportabilities of bone marrow mesenchymal stem cells, but these agents cannot affect the multi-directional differentiation ability and expression of hematopoietic cytokines of bone marrow mesenchymal stem cells. Moreover, several chemotherapy agents have no effects on biological characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells, such as cyclophosphamide, busulfan and methotrexate.

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Key words: bone marrow, mesenchymal stem cells, drug therapy, combination, transplantation conditioning

中图分类号:

R392.4

王金焕，王振玲，王晓芳，赵智刚. 化疗药物对骨髓间充质干细胞的损伤作用[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(50): 8080-8087.

Wang Jin-huan, Wang Zhen-ling, Wang Xiao-fang, Zhao Zhi-gang. Damage of chemotherapy agents to bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(50): 8080-8087.

图/表（结果） 3

2.1 化疗药物对骨髓间充质干细胞增殖的影响为了检测化疗药物对骨髓间充质干细胞的影响，不同剂量(常规剂量组，大剂量组)、不同类型化疗药物(环磷酰胺、阿糖胞苷、甲氨蝶呤、足叶乙甙、地塞米松、长春新碱、柔红霉素、马利兰)加入骨髓间充质干细胞中，处理3 d后检测骨髓间充质干细胞的增殖情况。发现任何浓度的环磷酰胺、甲氨蝶呤、马利兰和常规剂量的地塞米松不影响骨髓间充质干细胞的增殖；而常规剂量和大剂量长春新碱、足叶乙甙、柔红霉素、阿糖胞苷和大剂量地塞米松均不同程度抑制骨髓间充质干细胞的增殖，见图1。

2.2 化疗药物作用后骨髓间充质干细胞的恢复如图2所示，柔红霉素、足叶乙甙和阿糖胞苷持续性抑制骨髓间充质干细胞的增殖。当柔红霉素、足叶乙甙和阿糖胞苷撤除后，继续培养9 d，骨髓间充质干细胞仍处于增殖受抑状态。而长春新碱、地塞米松对骨髓间充质干细胞的增殖抑制作用随着药物的撤除有所恢复，但是不能恢复到正常。环磷酰胺、甲氨蝶呤和马利兰作用后骨髓间充质干细胞的早期(3 d)和晚期(12 d)的增殖能力并不发生改变。

2.3 化疗药物诱导骨髓间充质干细胞凋亡 5种检测的化疗药物(阿糖胞苷、柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙、地塞米松)均可以诱导骨髓间充质干细胞凋亡。不同类型、不同剂量的化疗药物诱导骨髓间充质干细胞凋亡的程度存在差异。大剂量组化疗药物对骨髓间充质干细胞的凋亡作用要明显强于常规剂量组(P < 0.05)，不同类型化疗药物诱导骨髓间充质干细胞凋亡的作用存在差异，其中大剂量组柔红霉素诱导细胞凋亡的能力最强，而地塞米松诱导凋亡的作用最弱；此外，不同类型、不同剂量化疗药物对骨髓间充质干细胞的凋亡率与处理时间成正相关。随着处理时间的延长，细胞凋亡率上升，见图3。

2.4 化疗药物处理后骨髓间充质干细胞的分化能力化疗药物处理后和未处理骨髓间充质干细胞都能在体外向脂肪和成骨诱导分化。成脂肪诱导1周后看见大部分细胞胞体变大，胞浆出现大量脂肪滴，油红O染色证实为脂肪滴，RT-PCR证实诱导后细胞表达脂肪形成特异性基因脂蛋白脂酶。成骨诱导3周后细胞呈现多层生长的结节状，Von kossa 染色证实为钙盐沉积，RT-PCR证实上述被诱导的细胞表达骨形成特异性基因Osteocalcin(图4)。化疗药物处理前后的骨髓间充质干细胞具有相似的体外分化能力。

2.5 造血相关因子的表达应用RT-PCR方法检测化疗药物处理前后骨髓间充质干细胞中造血相关因子的表达，结果显示干细胞因子(SCF)，单核细胞集落刺激因子(M-CSF)，白细胞介素6(IL-6)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)在化疗药物处理前后的骨髓间充质干细胞中稳定表达，但是没有检测到粒、单核细胞集落刺激因子，白细胞介素3(IL-3)和血小板生长因子(TPO)的表达(图5)。2.6 体外支持造血能力为了明确化疗药物是否影响骨髓间充质干细胞支持造血的能力，将不同类型、不同剂量处理后的骨髓间充质干细胞照射后，将骨髓单个核细胞接种其中，在长期骨髓培养基中培养4周后检测CFU生成情况。各种化疗药物均不同程度影响骨髓间充质干细胞支持造血的能力，见图6。

环磷酰胺、甲氨蝶呤、马利兰处理后骨髓间充质干细胞支持造血的能力虽然有所下降，与未处理骨髓间充质干细胞相比，没有明显差别。而阿糖胞苷、柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙和地塞米松处理后骨髓间充质干细胞支持造血的能力下降，与未处理骨髓间充质干细胞相比，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2。

参考文献

[1] Arthur A, Zannettino A, Panagopoulos R,et al.EphB/ephrin-B interactions mediate human MSC attachment, migration and osteochondral differentiation.Bone. 2011;48(3):533-542.
[2] Bian L, Zhai DY, Tous E,et al.Enhanced MSC chondrogenesis following delivery of TGF-β3 from alginate microspheres within hyaluronic acid hydrogels in vitro and in vivo. Biomaterials. 2011;32(27):6425-6434.
[3] Du Z, Wang L, Zhao Y,et al.Sympathetic denervation-induced MSC mobilization in distraction osteogenesis associates with inhibition of MSC migration and osteogenesis by norepinephrine/adrb3.PLoS One. 2014;9(8):e105976.
[4] Jamnig A, Lepperdinger G.From tendon to nerve: an MSC for all seasons.Can J Physiol Pharmacol. 2012;90(3):295-306.
[5] Lv F, Lu M, Cheung KM,et al.Intrinsic properties of mesemchymal stem cells from human bone marrow, umbilical cord and umbilical cord blood comparing the different sources of MSC.Curr Stem Cell Res Ther. 2012;7(6):389-399.
[6] Bessout R, Sémont A, Demarquay C,et al.Mesenchymal stem cell therapy induces glucocorticoid synthesis in colonic mucosa and suppresses radiation-activated T cells: new insights into MSC immunomodulation.Mucosal Immunol. 2014; 7(3):656-669.
[7] Prata Kde L, Orellana MD, De Santis GC,et al.Effects of high-dose chemotherapy on bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells isolated from lymphoma patients. Exp Hematol. 2010;38(4):292-300.
[8] Stute N, Fehse B, Schröder J,et al.Human mesenchymal stem cells are not of donor origin in patients with severe aplastic anemia who underwent sex-mismatched allogeneic bone marrow transplant.J Hematother Stem Cell Res. 2002; 11(6):977-984.
[9] Cilloni D, Carlo-Stella C, Falzetti F,et al.Limited engraftment capacity of bone marrow-derived mesenchymal cells following T-cell-depleted hematopoietic stem cell transplantation.Blood. 2000;96(10):3637-3643.
[10] Wu KH, Wu HP, Chan CK,et al.The role of mesenchymal stem cells in hematopoietic stem cell transplantation: from bench to bedsides.Cell Transplant. 2013;22(4):723-729.
[11] Epstein RB, Sarpel SC.Autologous bone marrow infusion following high dose chemotherapy of the canine transmissible venereal tumor (TVT).Exp Hematol. 1980;8(6):683-689.
[12] Majumdar MK, Thiede MA, Haynesworth SE,et al.Human marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) express hematopoietic cytokines and support long-term hematopoiesis when differentiated toward stromal and osteogenic lineages.J Hematother Stem Cell Res. 2000; 9(6):841-848.
[13] Carrancio S, Romo C, Ramos T,et al.Effects of MSC coadministration and route of delivery on cord blood hematopoietic stem cell engraftment.Cell Transplant. 2013; 22(7):1171-1183.
[14] Zhang C, Zhang X, Chen XH.Granulocyte-colony stimulating factor-mobilized mesenchymal stem cells: A new resource for rapid engraftment in hematopoietic stem cell transplantation. Med Hypotheses. 2011;76(2):241-243.
[15] Yeh SP, Lo WJ, Lin CL,et al.Anti-leukemic therapies induce cytogenetic changes of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells.Ann Hematol. 2012;91(2):163-172.
[16] Li J, Law HK, Liu YL,et al.Effect of cisplatin, topotecan, daunorubicin and hydroxyurea on human mesenchymal stem cells.Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 2010;18(4): 991-996.
[17] Domenech J, Cartron G, Clement N,et al.Persistent decrease in proliferative potential of marrow CD34(+)cells exposed to early-acting growth factors after autologous bone marrow transplantation.Bone Marrow Transplant. 2002;29(7):557-562.
[18] Koç ON, Day J, Nieder M,et al.Allogeneic mesenchymal stem cell infusion for treatment of metachromatic leukodystrophy (MLD) and Hurler syndrome (MPS-IH).Bone Marrow Transplant. 2002;30(4):215-222.
[19] Li J, Law HK, Lau YL,et al.Differential damage and recovery of human mesenchymal stem cells after exposure to chemotherapeutic agents.Br J Haematol. 2004;127(3): 326-334.
[20] Ben-Ishay Z, Barak V.Bone marrow stromal dysfunction in mice administered cytosine arabinoside.Eur J Haematol. 2001;66(4):230-237.
[21] Kushwaha P, Khedgikar V, Gautam J,et al.A novel therapeutic approach with Caviunin-based isoflavonoid that en routes bone marrow cells to bone formation via BMP2/Wnt-β-catenin signaling.Cell Death Differ. 2014;5:e1422.
[22] Cartron G, Herault O, Benboubker L,et al.Quantitative and qualitative analysis of the human primitive progenitor cell compartment after autologous stem cell transplantation.J Hematother Stem Cell Res. 2002;11(2):359-368.
[23] Banfi A, Bianchi G, Galotto M,et al.Bone marrow stromal damage after chemo/radiotherapy: occurrence, consequences and possibilities of treatment.Leuk Lymphoma. 2001;42(5):863-870.

引言

骨髓中除含有能分化发育成各种血细胞的造血干细胞之外，还含有产生非造血组织的间充质干细胞。由于它们来自骨髓，并且可以作为滋养层支持造血干细胞的生长，因此也有人称其为骨髓间充质干细胞。鉴于骨髓间充质干细胞具有以下特点而日益引起人们的兴趣：①自我更新能力。②在不同的理化环境和细胞因子的诱导下，具有可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞和神经元样细胞等多系分化潜能^[1-4]。③骨髓间充质干细胞是造血支持细胞，作为滋养层支持造血干细胞的生长^[5]。④骨髓间充质干细胞具有免疫抑制作用，在体内和体外均可以抑制T淋巴细胞的增殖，因此可以减轻移植排斥反应^[6]。而且其具有易分离、扩增和体外操作简便等特点，骨髓间充质干细胞在组织工程、细胞治疗和基因治疗等领域具有十分广阔的应用前景。

目前，大剂量化疗作为造血干细胞移植前的预处理方案或者一些难治性恶性肿瘤的备选方案已经广泛应用于临床。大剂量化疗在杀灭肿瘤细胞的同时会产生骨髓抑制的不良反应，不仅仅损伤造血细胞，也对骨髓间充质干细胞造成损伤^[7]。普通的造血干细胞移植可以重建造血，但是不能恢复被损伤的骨髓间充质干细胞。Stute等^[8]的研究结果显示：造血干细胞移植后，骨髓中的间充质干细胞仍然是受者本身的，而且常规的骨髓移植不能挽救受损的骨髓间充质干细胞。鉴于骨髓间充质干细胞具有造血支持作用，可以支持造血干细胞的生长，骨髓移植前的大剂量化疗对骨髓间充质干细胞的损伤会影响造血干细胞的植入和移植疗效，甚至导致移植失败^[9-10]。同样，骨髓间充质干细胞的损伤会影响化疗后受抑骨髓的造血恢复，增加患者的临床风险。因此，明确各种化疗药物对骨髓间充质干细胞的作用有利于合理选择、搭配化疗药物，实现高效、低毒的临床疗效。

大剂量化疗方案往往由多个化疗药物组成，无法分辨究竟是哪种药物对骨髓间充质干细胞产生损伤作用。因此本研究检测了临床常用化疗药物(环磷酰胺、马利兰、阿糖胞苷、柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙、甲氨蝶呤、地塞米松)对骨髓间充质干细胞的增殖能力、体外分化能力、造血因子表达和支持造血能力的影响，为临床合理化选择药物治疗提供实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞学体外实验。

时间及地点：于2012年11月至2014年4月在天津医科大学附属肿瘤医院实验室完成。

材料：

化疗药物对骨髓间充质干细胞损伤实验所用试剂：
试剂	来源
IMDM培养基、DMEM培养基、DF12、MCDB培养基、Trizol裂解液	美国Gibco公司
胎牛血清	美国Hyclone公司
重组人干细胞生长因子、粒-巨噬细胞集落刺激因子、促红细胞生成素、白细胞介素3	美国Peprotech公司
胰酶、EDTA、β-磷酸甘油、1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤	Sigma公司

化疗药物：环磷酰胺购自上海华联制药公司，马利兰购自Orphan Medcl公司，阿糖胞苷购自Pharmacia＆Opjohn公司，柔红霉素购自Pharmacia＆Opjohn公司，长春新碱购自上海华联制药公司，足叶乙甙购自Bristol-Myers Squibb公司，甲氨蝶呤购自苏州苏瑞医药化工有限公司，地塞米松购自Sigma公司。

实验方法：

骨髓间充质干细胞的分离、培养：8例正常成人髂后上棘穿刺抽取骨髓，将无菌获取的骨髓用Ficoll(1.077 g/cm³) 400×g离心20 min，分离、获取全部单个核细胞，然后将其接种在培养液中(体积分数为2%胎牛血清，40%MCDB培养基，60%DF12，10 μg/L 表皮生长因子，10^-⁸ mol/L地塞米松，0.1 mmol/L抗坏血酸，100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素，1%牛血清白蛋白)，37 ℃培养箱内孵育，48 h后去掉悬浮细胞，每3 d换1次液。待细胞约80%融合时，应用胰酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化后按照1∶3的比例传代。取第3-6代细胞进行以下实验。

化疗药物对骨髓间充质干细胞的处理：根据化疗药物在个体中的有效血药浓度将不同化疗药物配制成常规剂量组和大剂量组^[11]，见表1。将骨髓间充质干细胞接种在24孔培养板中，每孔1×10⁴个细胞。然后将不同化疗药物按照不同剂量加入各孔中培养3 d；同时设立对照孔，不加任何药物。3 d后获取不同化疗药物处理的各孔细胞，计数后和对照孔细胞数进行比较。

化疗药物处理后骨髓间充质干细胞的恢复：将骨髓间充质干细胞接种在24孔培养板(5×10³/孔)中，培养24 h后将不同化疗药物按照不同剂量加入各孔中继续培养3 d，然后更换新鲜不含化疗药物的培养基再培养9 d，分别在更换培养基后的3，6，9，12 d时获取细胞进行计数，并同对照孔(设立方法同上，与实验组同时更换培养基)细胞数进行比较，检测不同剂量、不同类型化疗药物作用后骨髓间充质干细胞的恢复情况。

化疗药物处理后骨髓间充质干细胞凋亡的检测：将2×10⁵个骨髓间充质干细胞接种在60 mm培养皿中，培养24 h后将化疗药物(足叶乙甙、长春新碱、地塞米松、柔红霉素、阿糖胞苷)按照不同剂量加入各孔中继续培养，分别在加入化疗药物后的24，48，72 h获取细胞，用Annexin V试剂盒(晶美公司)进行凋亡检测，具体步骤如下：①细胞用冷PBS洗2次，并重悬于1×Binding Buffer，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-¹。②吸100 μL的细胞液(1×10⁵个细胞)于试管中。③加5 μL Annexin-V FITC和10 μL PI。④轻轻振荡细胞悬液，室温避光孵育15 min。⑤加400 μL 1×Binding Buffer，1 h之内用流式细胞仪检测；在流式分析图上，左下区细胞群为活细胞，表现为AV及PI低染(AV^-/PI^-)；右下区细胞群为早期凋亡细胞，表现为AV高染而PI低染(AV⁺/PI^-)；右上区细胞群为晚期凋亡细胞，表现为AV和PI高染(AV⁺/PI⁺)，本实验定义凋亡细胞为早期凋亡和晚期凋亡细胞之和。

化疗药物处理后骨髓间充质干细胞的体外分化能力：将2×10⁴个骨髓间充质干细胞接种在35 mm培养皿中，培养24 h后将不同剂量、不同类型化疗药物加入各孔中继续培养3 d，然后更换相应诱导分化培养基诱导细胞向脂肪细胞、成骨细胞分化。应用油红O染色、Von Kossa染色、RT-PCR鉴定细胞向脂肪、成骨分化能力。具体方法：获取化疗药物处理3 d的骨髓间充质干细胞，依据Trizol操作手册提取细胞RNA并用反转录聚合酶链法，real time-PCR扩增脂肪形成特异性基因脂蛋白脂酶(LPL)、骨形成特异性基因Osteocalcin。管家基因GAPDH作为内对照。所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。反应条件：94 ℃变性5 min后开始循环；94 ℃变性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循环35次；72 ℃延伸5 min。PCR产物用15 g/L琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色并观察结果。

检测造血相关细胞因子在化疗药物处理后骨髓间充质干细胞中的表达：获取化疗药物处理3 d的骨髓间充质干细胞，依据Trizol操作手册提取细胞RNA并用反转录聚合酶链法，real time-PCR扩增干细胞因子(SCF)，白细胞介素6(IL-6)，白细胞介素3(IL-3)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，粒、单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)，单核细胞集落刺激因子(M-CSF)和血小板生长因子(TPO)基因。管家基因GAPDH作为内对照。引物设计、扩增条件和检测同上。

化疗药物处理后骨髓间充质干细胞支持造血作用的检测：获取化疗药物处理3 d的骨髓间充质干细胞，然后检测其支持造血作用。具体方法：将骨髓间充质干细胞经Co γ射线10.0 Gy照射，然后接种于长期培养基中(含体积分数为12.5%胎牛血清，体积分数为12.5%马血清，2 mmol/L谷氨酰胺，10^-⁶ mol/L氢化考的松的IMDM)。获取健康人骨髓单个核细胞，预先培养4 h以去除贴壁细胞，将悬浮细胞按照1×10⁹ L^-¹接种在照射后的骨髓间充质干细胞中，在37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中培养，每周半量换液。4周后获取全部细胞接种于甲基纤维素体系中培养， 14 d后在倒置显微镜下计数集落，50个以上细胞为1个集落。

主要观察指标：①化疗药物对骨髓间充质干细胞增殖、凋亡作用及化疗药物撤除后骨髓间充质干细胞的恢复能力。②化疗药物对骨髓间充质干细胞体外分化能力、造血因子表达和支持造血能力的影响。

统计学分析：采用SPSS 11.0软件进行统计分析，实验数据用平均值±标准差表示，组间比较应用t 检验或者方差分析。

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讨论

骨髓造血微环境是造血干细胞自我更新、增殖和分化的场所。骨髓间充质干细胞和由其分化而来的内皮细胞、成骨细胞、脂肪细胞等是造血微环境的主要细胞成分，对造血干细胞的正常发育和调控起重要作用。骨髓间充质干细胞通过以下方式来调控造血：①与造血细胞的直接接触。②分泌蛋白质形成细胞外基质。③产生多种细胞因子如干细胞因子、酪氨酸激酶受体3(Flt3)配体、集落刺激因子、转化生长因子β、肿瘤坏死因子等。

既往研究证实骨髓间充质干细胞具有支持造血的功能特性。Majumdar等^[12]的研究显示间充质干细胞在体外具有维持长期培养启始细胞(LTC-IC)和促进造血干细胞增殖和分化的能力。Carrancio等^[13]将骨髓间充质干细胞联合脐血CD34⁺细胞移植给NOD/SCID小鼠，发现间充质干细胞可以促进造血干细胞的植入和脐血CD34⁺细胞的体内扩增。

Zhang等^[14]将骨髓间充质干细胞联合外周血造血干细胞移植，发现间充质干细胞可以促进受者造血恢复，而且间充质干细胞移植不具有任何毒副作用。但是，大剂量化疗(造血干细胞移植前的预处理方案或者一些难治性恶性肿瘤的备选方案)在杀灭肿瘤细胞的同时也会对骨髓间充质干细胞造成损伤^[15-16]，破坏造血微环境，不利于造血细胞的归巢、自我更新、增殖和分化，进而影响造血干细胞移植的疗效^[17]，而常规的造血干细胞移植并不能及时修复受损的造血微环境^[18]。此外，骨髓间充质干细胞的损伤会影响化疗后受抑骨髓的造血恢复，增加大剂量化疗方案治疗患者的临床风险和经济负担。上述研究结果促使大家思考是否可以通过合理选择化疗药物实现既不影响临床疗效，又可以尽可能减少对骨髓间充质干细胞造成损伤的目的，实现这一目标的前提条件是必须明确临床常用化疗药物对骨髓间充质干细胞的损伤程度。

在本研究中，检测临床常用的化疗药物(环磷酰胺、马利兰、阿糖胞苷、柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙、甲氨蝶呤、地塞米松)对骨髓间充质干细胞的损伤作用，结果证实了化疗药物对骨髓间充质干细胞具有损伤作用，但是不同的化疗药物对骨髓间充质干细胞的损伤作用存在很大差异。阿糖胞苷、柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙和地塞米松(大剂量)明显抑制骨髓间充质干细胞的增殖(抑制率> 20%)，而且大剂量药物的抑制作用强于常规剂量。而环磷酰胺、马利兰、甲氨蝶呤和常规剂量地塞米松对骨髓间充质干细胞的抑制作用不明显。虽然长春新碱对骨髓间充质干细胞具有明显的抑制作用(抑制率> 55%)，但是随着长春新碱的撤除，骨髓间充质干细胞的增殖能力有不同程度的恢复。同样，大剂量地塞米松对骨髓间充质干细胞的抑制作用随着药物撤除也逐渐恢复，其恢复程度明显强于长春新碱。阿糖胞苷、柔红霉素和足叶乙甙对骨髓间充质干细胞的抑制作用则相对持久，在药物撤除后仍然抑制间充质干细胞的增殖。本研究结果同Li等^[19]和Ben-Ishay等^[20]的研究结果是一致的，他们的研究分别阐述了上述化疗药物(阿糖胞苷、柔红霉素、足叶乙甙)对骨髓的造血微环境的损伤作用，在化疗药物作用后，骨髓微环境中的基质细胞群体的数量和集落形成能力明显受损，从而影响造血细胞的正常生长和发育。所以，临床常用的化疗药物阿糖胞苷、柔红霉素和足叶乙甙对骨髓间充质干细胞的损伤作用必须引起重视。

几乎所有化疗药物在体内和体外都能通过细胞凋亡机制杀死肿瘤细胞。细胞凋亡是基因控制下的细胞主动死亡过程，化疗药物的抗癌效果不仅取决于药物对靶细胞的直接作用，更在于其诱导肿瘤细胞凋亡的能力。这一观点促使研究者考虑化疗药物对骨髓间充质干细胞的抑制作用是否通过诱导凋亡的途径来实现。研究结果发现应用治疗相关剂量(包括大剂量和常规剂量)的长春新碱、地塞米松、阿糖胞苷、柔红霉素和足叶乙甙均可诱导骨髓间充质干细胞发生凋亡，说明诱导凋亡可能是化疗药物抑制骨髓间充质干细胞增殖的重要机制。剂型、剂量和作用时间与化疗药物诱导骨髓间充质干细胞凋亡的程度存在相关性。大剂量组化疗药物(长春新碱、地塞米松、阿糖胞苷、柔红霉素和足叶乙甙)对骨髓间充质干细胞的凋亡作用要明显强于常规剂量组，不同类型化疗药物诱导骨髓间充质干细胞凋亡的作用存在差异，其中柔红霉素诱导细胞凋亡的能力最强，而地塞米松诱导凋亡的作用最弱；此外，随着处理时间的延长，细胞凋亡率上升。鉴于化疗药物通过诱导凋亡机制杀灭肿瘤细胞，在促进肿瘤细胞凋亡的同时诱导骨髓间充质干细胞凋亡，提示肿瘤细胞和骨髓间充质干细胞可能有相似的凋亡诱导途径。

自我更新和多向分化能力是骨髓间充质干细胞的基本特性。化疗药物对骨髓间充质干细胞的损伤作用是否累及其多向分化能力，既往并无报道。本研究检测结果显示，不同剂量、不同类型的化疗药物(环磷酰胺、马利兰、阿糖胞苷、柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙、甲氨蝶呤、地塞米松)不影响骨髓间充质干细胞的多向分化能力。在本研究中各种化疗药物作用后，骨髓间充质干细胞仍具有在体外向脂肪细胞、成骨细胞分化的能力。化疗会影响钙代谢，导致钙生成不足及钙流失，引发骨质疏松问题。Kushwaha等^[21]发现间充质干细胞可促进骨形成，减少骨吸收和骨转换。骨髓间充质干细胞移植对于缓解患者化疗不良反应具有一定的积极意义。

间充质干细胞是造血微环境中主要组成部分，通过合成、分泌多种造血因子和黏附分子来调控造血干细胞的增殖、分化和自我更新。化疗药物对骨髓间充质干细胞的损伤是否会影响其支持造血的作用，尚不清楚。在本实验中，通过检测造血因子的表达和体外长期培养体系中集落形成能力来评估化疗药物作用后骨髓间充质干细胞的支持造血作用。通过RT-PCR检验发现化疗药物作用后的骨髓间充质干细胞仍可以稳定表达造血调控因子干细胞因子、白细胞介素6、单核细胞集落刺激因子和粒细胞集落刺激因子，这些分子与造血细胞表面的相关受体相结合，从而促进造血细胞的增殖和分化。然后，通过检测体外长期培养体系中集落形成情况来评估化疗药物作用后间充质干细胞对造血细胞的支持作用。结果显示各种化疗药物均不同程度影响骨髓间充质干细胞支持造血的能力。进一步分析上述不同培养体系中CFU-GM、CFU-E和CFU-GEMM的生成情况，结果表明化疗药物作用后间充质干细胞促进CFU-GM、CFU-E和CFU-GEMM增殖的能力均有所下降。化疗药物的剂型和剂量均影响骨髓间充质干细胞支持造血能力。大剂量组化疗药物抑制骨髓间充质干细胞支持造血能力强于常规剂量组。柔红霉素和长春新碱对骨髓间充质干细胞支持造血功能的影响最强，柔红霉素对骨髓间充质干细胞造血功能的抑制作用可能与它不可逆抑制骨髓间充质干细胞增殖有关系，而长春新碱对骨髓间充质干细胞的抑制作用随着化疗药物的撤除而减弱，并且其作用后的间充质干细胞仍表达造血相关细胞因子，因此其抑制骨髓间充质干细胞支持造血能力与骨髓间充质干细胞的数量、细胞因子表达的相关性不强。骨髓间充质干细胞通过几种不同途径促进造血干细胞的发育，包括：细胞之间的直接接触、细胞因子的分泌、分泌蛋白基质等。因此，推测长春新碱作用后的骨髓间充质干细胞虽然在数量上有所恢复并且仍表达造血相关细胞因子，但是通过其他途径调节造血细胞的功能受到了损伤，从而抑制骨髓间充质干细胞的支持造血作用。另外，环磷酰胺、甲氨蝶呤和马利兰虽然不影响骨髓间充质干细胞的增殖，但是它们作用后的骨髓间充质干细胞支持造血定向祖细胞增殖能力略有下降。上述结果与既往临床和体外实验的结果是一致的^[22-23]。

综上所述，本研究通过体外实验初步证实：临床常用的化疗药物，如长春新碱、柔红霉素、足叶乙甙、地塞米松、阿糖胞苷可以影响骨髓间充质干细胞的增殖和支持造血能力，而不影响骨髓间充质干细胞表达造血相关因子和多向分化能力；其他的化疗药物(环磷酰胺、甲氨蝶呤和马利兰)在使用浓度下并不影响骨髓间充质干细胞的上述生物学特性。因此，在明确各种化疗药物对骨髓间充质干细胞作用的情况下，对于临床医师合理选择、搭配化疗药物，实现高效、低毒的临床疗效，具有很高的指导价值。

化疗药物对骨髓间充质干细胞的损伤作用

Damage of chemotherapy agents to bone marrow mesenchymal stem cells

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[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[5]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.
[6]	梁学奇, 郭黎姣, 陈贺捷, 武杰, 孙雅琪, 邢稚坤, 邹海亮, 陈雪玲, 吴向未. 泡状棘球绦虫原头蚴抑制骨髓间充质干细胞向成纤维细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 996-1001.
[7]	樊全宝, 罗惠娜, 王丙云, 陈胜锋, 崔连旭, 江文康, 赵明明, 王静静, 罗冬章, 陈志胜, 白银山, 刘璨颖, 张晖. 低氧培养犬脂肪间充质干细胞的生物学特性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1002-1007.
[8]	耿瑶, 尹志良, 李兴平, 肖东琴, 侯伟光. hsa-miRNA-223-3p调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1008-1013.
[9]	伦志刚, 金晶, 王添艳, 李爱民. 过氧化物还原酶6干预骨髓间充质干细胞增殖及体外向神经谱系诱导分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1014-1018.
[10]	朱雪芬, 黄成, 丁健, 戴永平, 刘元兵, 乐礼祥, 王亮亮, 杨建东. 胶质细胞神经营养因子诱导骨髓间充质干细胞向功能性神经元分化的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1019-1025.
[11]	段丽芸, 曹晓沧. 人胎盘间充质干细胞来源细胞外囊泡调节肠炎小鼠肠黏膜胶原的沉积[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1026-1031.
[12]	裴丽丽, 孙贵才, 王弟. 丹酚酸B抑制骨髓间充质干细胞氧化损伤及促进分化为心肌样细胞[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1032-1036.
[13]	邹刚, 徐志, 刘子铭, 李豫皖, 杨继滨, 金瑛, 张骏, 葛振, 刘毅. 人脱细胞羊膜支架促进Scleraxis修饰人羊膜间充质干细胞体外成韧带分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1037-1044.
[14]	管倩, 栾佐, 叶豆, 杨印祥, 汪兆艳, 王倩, 姚瑞芹. 人少突胶质前体细胞传代过程中形态学的变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1045-1049.
[15]	李偲, 赵婷, 谭戈, 郑雨林, 张若男, 吴艳, 唐俊明. 血小板源生长因子BB可促进骨骼肌成肌细胞增殖、分化与迁移[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1050-1055.