Ficoll密度梯度离心法分离培养纯化猪的骨髓间充质干细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.50.006

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究报道显示猪骨髓间充质干细胞体外分离方法、效率、培养条件各不相同，并且尚无统一的鉴定标准。
目的：建立一种高效、经济的猪骨髓间充质干细胞分离培养及鉴定方法。
方法：采集健康猪股骨骨髓，Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞，进行原代和传代培养，流式细胞仪检测细胞膜表面抗原表达情况，并观察细胞成骨、成脂及成软骨分化的能力。
结果与结论：分离培养的单个核细胞活力旺盛，体外生长良好，细胞呈梭形、纺锤形和小多角形，具有稳定的增殖分裂能力；细胞膜表面抗原CD29、CD44、CD90呈阳性表达，而CD14、CD34、CD45、CD166、HLA-DR呈阴性表达；在特定诱导条件下，该细胞可分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。说明采用Ficoll密度梯度离心法成功分离培养出纯化的猪骨髓间充质干细胞，其生长状态良好，具有多项分化潜能，可作为组织工程的种子细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 分离培养, 鉴定, 猪

Abstract:

BACKGROUND: Culture condition, isolation method and efficiency of porcine bone marrow mesenchymal stem cells are different, and there is a lack of unified identification standards.
OBJECTIVE: To establish a high-efficiency and economical method of isolating, culturing and identifying porcine bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: The bone marrow was collected from healthy porcine femur to isolate mononuclear cells by Ficoll density gradient centrifugation method. After primary and subculture, the cell surface antigens were detected by flow cytometery, and the osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation abilities of the cells were observed.
RESULTS AND CONCLUSION: The isolated mononuclear cells showed exuberant viability, and grew well in vitro. They were spindle- or small polygonal-shaped and had a stable doubling time on culture. Flow cytometric analysis revealed that they were positive for CD29, CD44, CD90, and negative for CD14, CD34, CD45, CD166, HLA-DR. Furthermore, they were able to differentiate into osteogenic, adipogenic and chondrogenic lineages under specific conditions in vitro. Porcine bone marrow mesenchymal stem cells isolated by Ficoll density gradient centrifugation method can be purified, grow well in vitro, and have multi-lineage differentiation potentials, which can act as seed cells for tissue engineering research.

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Key words: bone marrow, mesenchymal stem cells, cell culture techniques, cells, cultured, swine

中图分类号:

R394.2

刘传斌，吕双红，张孝忠. Ficoll密度梯度离心法分离培养纯化猪的骨髓间充质干细胞[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(50): 8066-8071.

Liu Chuan-bin, Lǚ Shuang-hong, Zhang Xiao-zhong. Isolation, cultivation and identification of porcine bone marrow mesenchymal stem cells using Ficoll density gradient centrifugation method[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(50): 8066-8071.

图/表（结果） 2

2.1 猪骨髓间充质干细胞的活力及生长特征利用Ficoll密度梯度离心结合贴壁法分离的骨髓单个核细胞经锥虫蓝染色后活细胞百分率为(93.0±2.5)%。接种48 h后，部分细胞黏附到培养瓶底部，呈多角形(图1A)。原代培养6 d，细胞开始增殖，并转化为梭形、纺锤形和小多角形(图1B)。原代培养第9天，细胞汇合度接近100%，呈旋涡状或鱼尾状生长(图1C)。细胞连续接种传至第10代的第5天，细胞形态未见明显改变，生长状态良好，细胞汇合度达到100%(图1D)。

2.2 猪骨髓间充质干细胞的生长曲线传代培养至第3代后，细胞形态及密度均匀，增殖迅速，图2为用CCK-8法绘制的细胞生长曲线，接种前1 d为生长潜伏期，此后为对数生长期，7 d以后基本处于稳定生长期。

2.3 猪骨髓间充质干细胞的表面抗原鉴定流式细胞仪检测结果显示CD29(98.8%)、CD44(99.6%)、CD90(99.5%)呈阳性表达，CD14(0.09%)、CD34(1.27%)、CD45 (0.459%)、CD166(0.111%)、HLA-DR(1.13%)呈阴性表达，符合骨髓间充质干细胞的表型特点(图3)。

2.4 成骨诱导分化结果加入诱导液后，细胞生长变缓，培养2周左右时，实验组细胞结节中心的细胞逐渐融合失去细胞结构，形成小的骨化结节；4周时，小的结节出现部分融合，形成稍大的结节。经茜素红染色后，实验组钙结节被染成红色(图4A)，对照组细胞几乎不着色，呈阴性(图4B)。

2.5 成脂诱导分化结果猪骨髓间充质干细胞成脂诱导后胞浆内分泌出许多微小脂滴，随着诱导时间的延长，脂滴逐渐增大并开始聚集融合。诱导14 d，细胞由长梭形变为多角形或椭圆形，经油红O染色后脂滴呈红色(图5A)，而对照组细胞形态无明显改变，胞浆内无脂滴形成，油红O染色呈阴性(图5B)。

2.6 成软骨诱导分化结果猪骨髓间充质干细胞离心后变成小微球沉降在管底，经诱导28 d，微球变的膨大、疏松。40 g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，切片脱蜡后，经阿尔新蓝染色后呈蓝色(图6A)，而对照组几乎不着色(图6B)。

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引言

间充质干细胞是一类具有自我复制和多向分化能力的细胞，它们可以不断地进行自我更新，在特定的条件下可诱导成一种或多种构成人体组织或器官的细胞。间充质干细胞主要分布于骨髓^[1]、脐带^[2]、脂肪组织中^[3]，外周血和心脏中也有发现^[4]。

Friedenstein等^[5]于1976年首先报道在骨髓中存在一种能贴附塑料培养皿，呈长梭形成纤维样的细胞，培养时呈克隆生长，在一定条件下可分化为骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞等。1991年，Caplan等发现骨髓来源的基质细胞具有自我更新和分化能力，并且首次将其定义为骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞因为取材方便，体外容易培养，免疫原性较低^[6]，易于外源基因的转染和表达^[7]，是目前最常用的种子细胞，在骨组织工程、心血管疾病、神经系统疾病的治疗中均显示出良好的应用前景^[8-10]。

猪是生物医学研究最理想的实验动物之一，它在解剖结构、组织代谢、病理生理等方面与人类极为相似，常用作缺血性心脏病、烧伤等疾病的动物模型^[11]。分离培养猪骨髓间充质干细胞并进行自体移植、同种异体移植和异种移植的文献均有报道^[12-14]，但文献中采用的分离培养方法不同、执行的鉴定标准不一致，这有可能影响移植后的疗效。本研究选择Ficoll密度梯度离心法分离培养猪的骨髓间充质干细胞。参照人间充质干细胞的鉴定标准，根据猪骨髓间充质干细胞表面抗原特点，较为系统和完善的介绍了猪骨髓间充质干细胞的鉴定方法，以期达到控制种子细胞质量的目的，为其后续的应用研究奠定基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞培养，形态学观察。

时间及地点：于2013年7月至2014年1月在解放军第307医院血液科实验室完成。

材料：

猪骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定实验所用主要试剂与仪器:
试剂及仪器	来源
胎牛血清、高糖DMEM	美国Gibico
低糖DMEM、0.25%胰酶-0.02%EDTA、PBS	天津百诺克
Ficoll淋巴分离液(1.077 g/mL)	天津TBD
CD14、CD29、CD34、CD44、CD45、CD90、CD166、HLA-DR单克隆抗体	美国BD
地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸、3-异丙酮酸钠、ITS+1、丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、胰岛素、吲哚美辛	美国Sigma
转化生长因子β3	美国Peptech
CCK-8	北京庄盟国际
倒置相差显微镜	日本Nikon
流式细胞仪	美国Beckman Coulter
酶标仪	美国Bio-tek

实验动物：6月龄广西巴马小型猪1只，体质量20 kg，购自北京实创世纪小型猪养殖基地，实验过程中对动物的处置方法符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

实验方法：

猪骨髓采集：取6月龄健康广西巴马小型猪，盐酸氯胺酮注射液10 mg/kg+地西泮注射液2 mg/kg肌肉注射麻醉动物，股骨部安尔碘局部消毒，用15号骨髓穿刺针穿刺股骨，缓慢抽取5 mL骨髓液，含200 U/mL肝素钠PBS等倍稀释，上下颠倒几次，防止凝血，立即送实验室进行分离培养。

猪骨髓间充质干细胞的分离、培养：将稀释后的骨髓液缓慢注入至内含10 mL Ficoll分离液(1.077 g/mL)的 50 mL离心管中，2 000 r/min离心10 min，可见在血清和分离液之间出现薄薄的一层絮状分层；小心抽取界面处细胞悬液，加入PBS重悬后1 500 r/min离心5 min 2次；最后加入骨髓间充质干细胞培养液(低糖DMEM+体积分数为10%胎牛血清+100 U/mL青链霉素双抗)重悬，轻轻吹打均匀制成单细胞悬液，锥虫蓝染色鉴定细胞活力。细胞计数后，按照2×10⁴/cm²的密度接种到25 cm²的培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为5% CO₂、饱和湿度培养箱中培养。原代培养48 h后更换培养液，去除非贴壁细胞，以后每3 d换液1次。在培养第8天左右时，细胞汇合度可达80%左右，消化后的细胞按照1×10⁴/cm²的密度接种到25 cm²培养瓶中进行传代培养。倒置相差显微镜下定期观察细胞形态及生长状况。

CCK-8法绘制细胞生长曲线：密度梯度离心结合贴壁分离法获取骨髓间充质干细胞，传2代后，获得均一的成纤维样细胞。以0.25%胰酶-0.02%EDTA 消化，制成细胞悬液，并计数。96孔板中梯度浓度接种细胞，培养4 h后，轻轻弃去培养液，重新加入90 μL培养基，再加入10 μL CCK-8，培养箱中孵育1.5 h，酶标仪检测450 nm处的吸光度值。最后以吸光度值为纵坐标，细胞数为横坐标绘制标准曲线。按照2×10³/孔的密度接种至6块96孔培养板中，每个板设6个复孔，分别在培养第1，3，5，7，9，11天取1块96孔板用酶标仪检测各个孔的吸光度值，剩余孔板每3 d换液1次。取每个孔板6个复孔的吸光度值的平均数代入标准曲线，计算细胞数，最后以时间为横坐标，细胞数为纵坐标绘制细胞生长曲线。

流式细胞仪检测：第3代细胞培养第4天，达90%融合后，彻底清洗去除悬浮细胞后，0.25%胰酶-0.02% EDTA 消化，PBS重悬、计数，分别加入CD14-FITC、CD166-PE、CD44-PC5、CD29-FITC、CD34-PE、CD45-ECD、HLA-DR-PC5、CD90-FITC抗体，混匀后室温下避光保存15 min，1 200 r/min离心5 min，弃去上清液后加入PBS制成300 μL单细胞悬液，上机检测；Beckman Coulter流式细胞仪分析，Flow jo7.6软件处理。

猪骨髓间充质干细胞成骨诱导：取第3代细胞行成骨细胞诱导，以1×10⁴/cm²的密度接种到含有盖玻片的12孔板中，待细胞贴壁生长汇合度达到80%时，用成骨细胞诱导培养液(含体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养基+ 0.1 μmol地塞米松+20 mmol/L β-磷酸甘油+50 μmol/L抗坏血酸)替换各诱导孔的骨髓间充质干细胞培养液，对照孔则继续使用骨髓间充质干细胞培养液，在37 ℃、体积分数为5%CO₂及饱和湿度的培养箱中培养，每3 d换液1次，并定期观察细胞状态。诱导21 d后，行茜素红染色进行鉴定。

猪骨髓间充质干细胞成脂诱导：取第3代细胞行成脂细胞诱导，以1×10⁴/cm²的密度接种到含有盖玻片的12孔板中，待细胞贴壁生长汇合度达到80%时，用成脂细胞诱导培养液(含体积分数为10%胎牛血清的DMEM高糖培养基+ 10 mg/L胰岛素+0.5 μmol/L地塞米松+0.5 mmol/L IBMX+ 50 μmol/L吲哚美辛)替换各诱导孔的骨髓间充质干细胞培养液，对照孔则继续使用骨髓间充质干细胞培养液，在 37 ℃、体积分数为5%CO₂和饱和湿度的培养箱中培养，每3 d换液1次，定期观察细胞状态。诱导14 d后，行油红O染色进行鉴定。

猪骨髓间充质干细胞成软骨诱导：取第3代细胞行成软骨诱导，用骨髓间充质干细胞培养液重悬，按4×10⁶/管接种于15 mL尖底塑料离心管中，1 200 r/min×10 min 离心，使细胞形成微团，旋松离心管盖，正立于37 ℃、体积分数为5%CO₂和饱和湿度的培养箱培养。24 h后，实验组换用成软骨诱导液(无血清的DMEM高糖培养基+0.1 μmol/L地塞米松+1×ITS1+1 mmol/L丙酮酸钠+50 μmol/L抗坏血酸+10 μg/L 转化生长因子β3)，对照组则继续使用骨髓间充质干细胞培养液，以后每3-5 d换液1次，连续培养4周，固定脱水后石蜡包埋切片，行阿尔新蓝染色鉴定。

主要观察指标：分离所得细胞的生长形态、生长曲线、表面抗原特性以及向骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞分化的能力。

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讨论

目前，分离骨髓间充质干细胞的方法主要有4种^[15]，分别是：①全骨髓贴壁培养法，根据骨髓间充质干细胞在塑料培养瓶中贴壁生长的特性，将骨髓间充质干细胞与其他类型的细胞进行分离。②密度梯度离心法，使用细胞分离液，根据骨髓间充质干细胞与其他细胞的密度不同而将它分离出来。③流式细胞仪分离法，根据骨髓间充质干细胞大小及特异性标志物进行分选。④免疫磁珠分离法，根据骨髓间充质干细胞表面带有或缺失的抗原成分进行正选或负选，用抗体包被磁珠，获得高纯度的骨髓间充质干细胞。流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法对细胞活性影响较大，甚至可以导致细胞完全失去活性，且操作复杂，加之价格昂贵，过程繁琐，所以使用较少。樊懿萱等^[16]采用全骨髓贴壁分离法分离培养梅山猪的骨髓间充质干细胞，但该方法所获骨髓间充质干细胞纯度低，红细胞、破骨细胞等杂质细胞较多，增殖速度相对较慢，且经数次传代仍有较多杂质细胞存在。本实验采用的Ficoll密度梯度离心法对设备要求低，操作相对简便，分离所得的骨髓间充质干细胞活性好，杂质细胞少，增殖活性强，是猪骨髓间充质干细胞分离培养的首选方案。

现有的研究对猪骨髓间充质干细胞的鉴定尚缺乏统一的标准^[17-18]，多参照国际细胞治疗学会间充质与组织干细胞委员会提出的鉴定人骨髓间充质干细胞最低标准^[19]：①对塑料底物的贴附特性。②CD105、CD73及CD90等阳性表达率≥95%，而CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a或CD19、HLA-DR等阳性表达率≤2%。③具有多向分化潜能(在特定条件下可以诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞)。骨髓间充质干细胞表达多种表面标志物，包括黏附分子、生长因子、细胞因子及受体和整合素等，尽管尚未筛选到猪骨髓间充质干细胞特异性表面标志，但现有的研究表明，猪骨髓间充质干细胞表达CD29、CD44、CD49d、CD49f、CD90、CD105、CD106、 CD117、SLA class Ⅰ，不表达CD14、CD31、CD34、CD45、CD54、CD166、SLA class Ⅱ等分子^[16-18^，^20-23]。实验利用流式细胞仪对分离所得第3代细胞的CD29、CD44、CD90、CD14、CD34、CD45、CD166、HLA-DR抗原进行了鉴定，结果显示CD29、CD44、CD90呈阳性表达，CD14、CD34、CD45、CD166、HLA-DR呈阴性表达，符合骨髓间充质干细胞的表型特点。

由于鉴定猪骨髓间充质干细胞缺乏特异性的表面抗原，其向多种间质组织细胞如脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化的潜能被认为是最有力的证据^[24]。实验将分离所得的第3代细胞向成脂、成骨、成软骨诱导分化，并分别用油红O染色、茜素红染色、阿尔新蓝染色进行鉴定，结果表明成脂、成骨、成软骨诱导分化成功，这说明分离所得的细胞确实是具有多项分化潜能的间充质干细胞。

骨髓间充质干细胞作为细胞替代疗法及组织工程的种子细胞，在治疗心脏病^[25-27]、血液病^[28]、骨发生疾病等方面取得了良好的效果^[29]，但目前的研究仍然不够深入，细胞在体内的作用机制尚不清楚，有待从大动物实验中进一步阐明。此外，骨髓间充质干细胞的数量和分化潜能随着年龄的增长显著减少和降低^[30-31]，并且取材时容易对供体造成伤害，因此，非常有必要寻找新的干细胞来源。现有的研究显示，自体移植、同种异体移植甚至异种移植骨髓间充质干细胞均取得了良好的疗效^[32-33]，这为以后动物来源的干细胞用于临床提供了理论依据。实验通过Ficoll密度梯度离心结合贴壁的方法分离培养猪骨髓间充质干细胞，并参照人骨髓间充质干细胞的标准对猪骨髓间充质干细胞进行流式细胞检测及三系诱导分化，证实了所获得的细胞即为猪骨髓间充质干细胞，为猪骨髓间充质干细胞的后续研究应用奠定了技术基础。