Ad-hBMP-2与Ad-hTGF-β1基因共转染骨髓间充质干细胞后的体外成骨诱导

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.50.001

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (50): 8037-8041.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.50.001

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Ad-hBMP-2与Ad-hTGF-β1基因共转染骨髓间充质干细胞后的体外成骨诱导

陈剑平，邱俊钦，曾昭勋，陈宗雄，尹承慧

解放军南京军区福州总医院骨一科，福建省福州市 350025

收稿日期:2014-11-09 出版日期:2014-12-03 发布日期:2014-12-03
通讯作者: 尹承慧，博士，副主任医师，解放军南京军区福州总医院骨一科，福建省福州市 350025
作者简介:陈剑平，男，1986年生，江西省赣州市人，汉族，硕士，主治医师，主要从事骨创伤急救研究。
基金资助:
福建省青年科技人才创新项目(2005J075)

In vitro osteogenic induction of bone marrow mesenchymal stem cells after co-transfection with Ad-hBMP-2 and Ad-hTGF-β1

Chen Jian-ping, Qiu Jun-qin, Zeng Zhao-xun, Chen Zong-xiong, Yin Cheng-hui

First Department of Orthopedics, Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Region, Fuzhou 350025, Fujian Province, China

Received:2014-11-09 Online:2014-12-03 Published:2014-12-03
Contact: Yin Cheng-hui, M.D., Associate chief physician, First Department of Orthopedics, Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Region, Fuzhou 350025, Fujian Province, China
About author:Chen Jian-ping, Master, Attending physician, First Department of Orthopedics, Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Region, Fuzhou 350025, Fujian Province, China
Supported by:
the Scientific Young Talent Innovative Project of Fujian Province, No. 2005J075

摘要/Abstract

摘要：

背景：重组DNA技术的进展为骨组织工程研究的发展提供巨大动力，将其应用于组织工程骨构建可以显著提高骨修复的质量和效率。
目的：拟将Ad-hBMP-2联合Ad-hTGF-β1转染骨髓间充质干细胞体外成骨诱导，观察二者在成骨过程中的相互关系。
方法：以腺病毒AdMax为基因转移载体，将携带转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2基因的高滴度腺病毒感染SD大鼠骨髓间充质干细胞，利用外源性基因编码的生长因子诱导其表达，通过RT-PCR、ELISA、MTT 实验及碱性磷酸酶水平检测等方法鉴定。
结果与结论：腺病毒感染骨髓间充质干细胞后RT-PCR可检测出外源基因的表达，MTT实验和碱性磷酸酶活性检测双基因共转染的骨髓间充质干细胞增殖能力最强，碱性磷酸酶活性最高。结果表明联合应用Ad-hTGF-β1和Ad-hBMP-2转染可明显促进骨髓间充质干细胞的成骨化，效果优于单用一种生长因子。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 转化生长因子β1, 骨形态发生蛋白2, 腺病毒载体

Abstract:

BACKGROUND: Advances in recombinant DNA technology provide a huge impetus to the development of bone tissue engineering research, which used for tissue-engineered bone construction can significantly improve the quality and efficiency of bone repair.
OBJECTIVE: To evaluate the in vitro osteogenic induction of Ad-hBMP-2 and Ad-hTGF-β1 co-transfected bone marrow mesenchymal stem cells and to elucidate their relationship in bone formation．
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells from Sprague-Dawley rats were infected by high-titer recombinant adenoviruses carrying transforming growth factor-β1 and bone morphogenetic protein-2 genes, and then transfected cells were induced by exogenous genes detected with RT-PCR, ELISA, MTT and alkaline phosphatase test．
RESULTS AND CONCLUSION: Adenovirus-infected bone marrow mesenchymal stem cells could express exogenous genes detected by RT-PCR. MTT test and alkaline phosphatase test showed the proliferation ability of co-transfected bone marrow mesenchymal stem cells was the strongest and the alkaline phosphatase activity was the highest. It has been observed that bone marrow mesenchymal stem cells co-transfected with Ad-hBMP-2 and Ad-hTGF-β1 can be induced to form bone tissue cooperatively and synergistically.

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Key words: bone marrow, mesenchymal stem cells, transforming growth factor beta1, bone
morphogenetic proteins

中图分类号:

R394.2

陈剑平，邱俊钦，曾昭勋，陈宗雄，尹承慧. Ad-hBMP-2与Ad-hTGF-β1基因共转染骨髓间充质干细胞后的体外成骨诱导[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(50): 8037-8041.

Chen Jian-ping, Qiu Jun-qin, Zeng Zhao-xun, Chen Zong-xiong, Yin Cheng-hui. In vitro osteogenic induction of bone marrow mesenchymal stem cells after co-transfection with Ad-hBMP-2 and Ad-hTGF-β1[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(50): 8037-8041.

图/表（结果） 2

2.1 感染细胞外源目的基因表达的RT-PCR鉴定未感染和Ad-hTGF-β1及Ad-hBMP-2病毒共感染的大鼠骨髓间充质干细胞cDNA经RT-PCR扩增，结果可见未感染的大鼠骨髓间充质干细胞只有內参mGapdh条带(图1泳道3，4)，而Ad-hTGF-β1及Ad-hBMP-2病毒共感染的大鼠骨髓间充质干细胞除内参mGapdh条带外，同时可见特定的目的基因片段(图1泳道1，2)，表明外源基因hTGF-β1和hBMP-2 mRNAs在大鼠骨髓间充质干细胞中得以成功表达。

2.2 ELISA方法检测hTGF-β1和hBMP-2的表达各孔均有目的蛋白的分泌，各基因转染组目的基因的表达明显高于空病毒转染组及未转染组，差异有非常显著性意义(P < 0.01)，空病毒转染组及未转染组之间差异无显著性意义 (P > 0.05)，见表1。

2.3 MTT法检测转染对骨髓间充质干细胞增殖的影响由不同基因转染组吸光度可知：空病毒转染组细胞增殖与未转染组相比无明显变化，经Ad-hTGF-β1、Ad-BMP-2基因修饰后，骨髓间充质干细胞的增殖能力均得到不同程度增强，与空病毒转染组与未转染组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)。双基因修饰对骨髓间充质干细胞的增殖能力促进作用均强于Ad-BMP-2转染组和Ad-hTGF-β1转染组(P < 0.05)，见图2。

2.4 转染细胞胞质中碱性磷酸酶活性分析细胞转染后第3天经碱性磷酸酶ELISA试剂盒检测定细胞内碱性磷酸酶的活性(U/10⁹细胞)。Ad-hBMP-2+ Ad-hTGF-β1双基因转染组碱性磷酸酶活性高于单基因转染组(P < 0.05)，Ad-hBMP-2转染组和Ad-hTGF-β1转染组碱性磷酸酶活性高于空病毒转染组和未转染组(P < 0.01)，而 Ad-hBMP-2转染组碱性磷酸酶活性高于Ad-hTGF-β1转染组(P < 0.05)，见图3。

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引言

骨缺损、骨不连的治疗一直是骨科领域的一大难题。目前，骨移植是临床治疗骨缺损最有效且最常用的方法之一，但自体骨、异体骨、生物替代材料移植存在着一些弊端和局限性，如供源不足、供区损伤和取骨后的并发症、异体骨移植的免疫反应、病毒感染或成骨能力弱等^[1]。目前骨组织工程学是一个飞速发展的领域，主要是体外制成细胞/生物材料复合体植入体内进行骨修复重建。骨髓间充质干细胞由于可诱导定向分化为成骨细胞，并具有良好的体外扩增能力而成为骨组织工程较为理想的种子细胞来源，但它需要适当生长因子的诱导分化和调控^[2-3]。支架材料是骨组织工程的核心，目前在人工合成材料和天然骨衍生材料方面做了大量的研究，但存在支架材料降解和骨组织合成速率不一致，材料机械强度难于和降解速率相统一，炎性反应、免疫排斥反应等缺陷，迄今为止尚缺乏理想支架材料^[4-5]。

骨的再生过程中有多种细胞因子参与，骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)是目前已知效应最强的骨生长因子^[6]，体内研究提示骨形态发生蛋白2的主要作用是诱导未分化的骨髓间充质干细胞不可逆地分化成为成骨细胞和成软骨细胞，通过钙盐沉积导致新骨形成，启动骨生成，对已分化、成熟的成骨细胞无作用。转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)的直接效应是促进骨膜中的前成骨细胞增殖，促进成骨细胞和成软骨细胞增殖，但是单独转化生长因子β1骨形成能力较弱，仅能够引起局部骨膜增生及少量的骨形成。研究表明骨形态发生蛋白2和转化生长因子β1在诱导骨形成上具有良好的协同作用^[7]，现已有大量体外实验证实骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1联合应用可增强Ⅰ、Ⅱ型胶原的分泌及碱性磷酸酶的表达，促进骨痂形成^[8-9]。自1965年Urist发现骨形态发生蛋白以来，其体内诱导成骨的作用也被Ren等证实，但外源性的骨形态发生蛋白应用于骨缺损部位容易被机体内的酶降解，不能长时间发挥诱导成骨作用^[10]。于是研究者将目光转向重组DNA技术，骨形态发生蛋白基因治疗的骨修复作用也得到大量的实验证实^[11-12]。同时重组DNA技术的进展为骨组织工程研究的发展提供巨大动力，将其应用于组织工程骨构建可以显著提高骨修复的质量和效率，如基因修饰骨髓间充质干细胞后能促进胶原合成和骨钙素的分泌，提高碱性磷酸酶的活性，促进矿物质在骨小梁上的沉积，加速骨的修复作用^[13]。本研究拟将Ad-hBMP-2和Ad-hTGF-β1基因共转染骨髓间充质干细胞进行体外诱导成骨，观察二者在成骨诱导中的协同作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞生物学观察实验。

时间及地点：实验于2009年4月至2012年3月在解放军南京军区福州总院实验室完成。

材料：

腺病毒载体：人BMP-2腺病毒表达载体和人TGF-β1腺病毒表达载体由上海沃森生物科技有限公司提供，由AdMax腺病毒包装系统包装而成。

实验动物：清洁级3周龄健康雄性SD大鼠20只，体质量60-80 g，由解放军南京军区福州总医院动物实验中心提供。常规饲养1周后进入细胞实验，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学要求。

试剂：DMEM/F12 培养基(Hyclone公司)；Alkalire Phosphagse试剂盒、人TGF-β1 ELISA Kit试剂盒、人 BMP-2 ELISA Kit试剂盒(华美公司)；Trizol RNA试剂盒、qRT-PCR试剂盒(Invitrogen公司)。

实验方法：

大鼠骨髓间充质干细胞分离培养和感染：自SD大鼠胫骨和股骨髓腔中获得骨髓，采用密度梯度离心和贴壁筛选相结合的方法获得骨髓间充质干细胞^[14-17]。取培养的第2代骨髓间充质干细胞按密度2.0×10⁵/孔接种到6孔细胞培养板，24 h后观察细胞生长情况，见生长良好、融合度达到70%-80%时，将Ad-hTGF-β1病毒液按感染复数值为80感染骨髓间充质干细胞，Ad-hBMP-2病毒液按感染复数值为100感染骨髓间充质干细胞，观察细胞生长增殖情况。

RT-PCR 检测目的基因表达：根据Genebank中已知基因序列，设计合成引物如下：hTGF-β1基因正向引物为5’-GCG AGA TCC TCT CCA TTT TG-3’，反向引物为：5’- TTC CTT GTC ATG TTC CAC GA-3’，预期扩增片段长269 bp；hBMP-2基因正向引物：5’-ACT TTT GGA CAC CAG GTT GG-3’，反向引物：5’-GCT GTT TGT GTT TGG CTT GA-3’；预期扩增片段长296 bp；以小鼠3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参，正向引物为5’-AGC TTG TCA TCA ACG GGA AG-3’，反向引物为5’-ACA CAT TGG GGG TAG GAA CA-3’，预期扩增片段长525 bp。用Trizol法提取感染细胞总RNA，反转录合成cDNA第一链，取1 μL反转录产物分别以上述引物进行PCR扩增。常规PCR扩增体系含：2.5 μL 10×buffer、上下游引物各100 pmol、1.5 μL dNTP(2.5 mmol/L)、Taq酶1.25 U、cDNA 1 μL，ddH₂O补足至25 μL。PCR反应条件，94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s的条件下循环30次；最后72 ℃延伸10 min。取PCR产物15 μL行1.2%琼脂糖凝胶电泳，80 V电压电泳30 min后，在Fluors凝胶成像系统下观察并记录结果。

酶联免疫吸附实验(ELISA)检测目的基因表达量：Ad-hTGF-β1、Ad-hBMP-2和空病毒转染骨髓间充质干细胞72 h后，收集培养液上清6份，经盐酸活化后加到单抗包被96孔板中，分别参照hTGF-β1和hBMP-2 ELISA定量试剂盒说明进行酶联免疫吸附测定。

不同基因转染细胞增殖能力的MTT实验：将骨髓间充质干细胞分为5组：①未转染组。②空病毒(Ad-EGFP)转染组。③Ad-hBMP-2转染组。④Ad-hTGF-β1转染组。⑤Ad-hTGF-β1+ Ad-hBMP-2转染组。取各组大鼠骨髓间充质干细胞分别接种入96孔板，每孔200 μL(细胞密度5×10³，每组6孔)。37 ℃、体积分数为5%CO₂，饱和湿度的CO₂孵箱中静置培养。3 d后，向每孔中加入20 μL MTT溶液。4 h后吸出培养液，按150 μL/孔加入二甲基亚砜，轻柔振摇10 min，全自动酶标仪读取每孔吸光度(A₄₉₀)值。

碱性磷酸酶活性定量检测：将未转染组、空病毒转染组、Ad-hBMP-2转染组、Ad-hTGF-β1转染组、Ad-hBMP-2+ Ad-hTGF-β1基因共转染组骨髓间充质干细胞，分别接种于100 mm的培养皿中，每组4皿。于转染后72 h(48 h前更换为无血清DMEM培养液)收集上清液，用大鼠碱性磷酸酶ELISA试剂盒检测。

主要观察指标：①紫外透照仪下观察RT-PCR产物的电泳条带并摄取图像。②ELISA检测hTGF-β1或hBMP-2目的基因表达量。③MTT实验检测不同基因转染细胞的增殖能力。

统计学分析：用SPSS 13.0软件进行统计分析，数据采用x(_)±s表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用q 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

在骨伤领域，由于严重创伤导致的骨缺损十分常见；脊柱外科近年进展迅速，长期的治疗效果往往依赖牢固的椎间融合；在关节外科翻修术中常常面临难以处理的骨缺

损，使得假体无法有效固定，因此可控的局部骨再生在骨科领域有重要意义。本研究立足于这一临床需求，试图依赖基因工程及组织工程技术最新进展，观察转化生长因子β1/骨形态发生蛋白2双基因共转染骨髓间充质干细胞诱导成骨中的作用。结果证实转化生长因子β1可以提高骨形态发生蛋白2的诱导成骨活性，二者在成骨作用上具有协同作用。体外实验结果显示，转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2双基因共转染骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性最高，且其对骨髓间充质干细胞的增殖促进能力也最强。

以往研究证实骨形态发生蛋白2是已知骨形态发生蛋白家族中诱导成骨能力最强的骨生长因子之一，具有促使骨髓间充质干细胞向成骨或软骨系分化、诱导原位和异位成骨的作用^[18-19]，在骨折愈合早期的骨诱导中发挥重要作用。转化生长因子β1是能促进成骨细胞的增殖和募集，能诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化，而且能抑制多种炎性递质的生物学活性^[20]，主要在骨折愈合后期调节成骨细胞和软骨细胞的增殖，并增强其合成基质的能力。理论上二者在骨重建中的作用不仅具有序贯性，还有互补性^[21-24]，本研究进一步证实了二者具有协同作用。

提高骨髓间充质干细胞的成骨分化能力需要提供高浓度成骨诱导性细胞因子，以启动外源性及内源性间充质干细胞的成骨方向分化，这是一个十分复杂的过程，并不仅仅是某种细胞因子的单一作用能够完成的，需要多种细胞成骨因子的相互协调和相互配合。已有大量实验表明骨形态发生蛋白2和转化生长因子β1在诱导骨形成上具有良好的协同作用^[25-28]，因此本实验还设计了转化生长因子β1和骨形态发生蛋白对同一骨髓间充质干细胞的共转染，实验结果显示，转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2基因共转染及单基因转染骨髓间充质干细胞后，细胞碱性磷酸酶活性均比未转染组高，尤以共转染组活力明显，且其对骨髓间充质干细胞的增殖促进能力也最强。碱性磷酸酶是成熟成骨细胞标志酶之一^[29]，在体外钙化中起关键性作用，即若没有碱性磷酸酶活力，钙化就不会发生^[30]。因此碱性磷酸酶可看作骨形成的早期标志，其活性总是和诱导骨形成联系在一起的。

实验发现不同目的基因修饰均可以促进骨髓间充质干细胞的增殖，还可提高碱性磷酸酶活性，这与以往的研究结果相一致，且双基因共转染组细胞效果最为明显，这就提示：在骨髓间充质干细胞的成骨分化过程中，多种细胞成骨因子之间存在相互促进作用，实现成骨化的放大效果，细胞因子的联合应用将更有利于骨修复。

本研究从临床骨重建需求现状出发，将分子生物学和组织工程学有机地结合起来，为临床治疗骨缺损和促进骨融合提供了多基因转染协同诱导成骨理论依据，为后期的目的基因修饰细胞复合骨组织工程支架材料植入动物骨缺损修复实验奠定基础。

Ad-hBMP-2与Ad-hTGF-β1基因共转染骨髓间充质干细胞后的体外成骨诱导

In vitro osteogenic induction of bone marrow mesenchymal stem cells after co-transfection with Ad-hBMP-2 and Ad-hTGF-β1

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