胶原蛋白与黏土混合材料的性能研究

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.47.006

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (47): 7573-7578.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.47.006

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胶原蛋白与黏土混合材料的性能研究

王九娜^1，2，赵兴绪¹，唐俊杰²，李根²，姜拓之²，赵玲²，秦文²，赵红斌^1，2

1甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃省兰州市 730070
2解放军兰州军区兰州总医院骨科研究所，甘肃省兰州市 730050

修回日期:2014-10-19 出版日期:2014-11-19 发布日期:2014-11-19
通讯作者: 赵红斌，博士，副教授，硕士生导师，解放军兰州军区兰州总医院骨科研究所，甘肃省兰州市 730050
作者简介:王九娜，女，1988年生，河南省安阳市人，汉族，甘肃农业大学在读硕士，主要从事组织工程、外周神经修复的研究。
基金资助:
甘肃省重大专项项目(1203FKDA036)

The performance research of a mixed material of collagen and clay

Wang Jiu-na^{1, 2}, Zhao Xing-xu¹, Tang Jun-jie², Li Gen², Jiang Tuo-zhi², Zhao Ling², Qin Wen², Zhao Hong-bin^{1, 2}

1College of Life Sciences and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, Gansu Province, China
2Institute of Bone Injury, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area Command, Lanzhou 730050, Gansu Province, China

Revised:2014-10-19 Online:2014-11-19 Published:2014-11-19
Contact: Zhao Hong-bin, M.D., Associate professor, Master’s supervisor, College of Life Sciences and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, Gansu Province, China; Institute of Bone Injury, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area Command, Lanzhou 730050, Gansu Province, China
About author:Wang Jiu-na, Studying for master’s degree, College of Life Sciences and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, Gansu Province, China; Institute of Bone Injury, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area Command, Lanzhou 730050, Gansu Province, China
Supported by:
the Major Special Project of Gansu Province, No. 1203FKDA036

摘要/Abstract

摘要：

背景：凹凸棒黏土质轻，吸水性强，湿时具有黏性和可塑性等特性，被广泛应用于各个领域，但将凹凸棒黏土作为骨修复材料鲜有报道。
目的：将胶原蛋白与不同比例凹凸棒黏土混合，构建一种新型组织工程支架材料，以期运用于骨修复。
方法：将胶原蛋白和凹凸棒黏土以干质量比为1∶0、5∶1、4∶1、3∶1的比例混合均匀，冷冻干燥，制备支架材料，扫描电镜观察材料的表观特征，检测1%京尼平交联前后材料的孔隙率和质量吸水率。将4组比例材料分别与大鼠骨髓间充质干细胞共培养，培养3 d及7 d分别进行扫描电镜观察及苏木精-伊红染色。将1%京尼平交联后的4组比例材料分别植入大鼠体内，1个月后观察材料降解情况。
结果与结论：材料呈多孔海绵状，交联前材料的孔隙率在60%-80%之间，交联后材料的孔隙率在40%-65%之间，4组之间交联前后孔隙率比较差异无显著意义(P > 0.05)。4组材料交联后的质量吸水率较交联前显著降低(P < 0.05)。胶原蛋白-凹凸棒黏土支架材料具有良好的细胞相容性，在动物体内可以完全降解并被吸收，但不同比例配比降解速率不一，无炎症反应。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 骨生物材料, 胶原蛋白, 凹凸棒黏土, 支架, 生物相容性

Abstract:

BACKGROUND: Attapulgite clay is light with strong water absorption, and it has viscosity and plasticity in wet condition, which has been widely used in various fields. However, there is rarely report about attapulgite clay as bone repair material.
OBJECTIVE: To mix collagen with different proportion of attapulgite clay to fabricate a new type of tissue engineering scaffold material for bone repair.
METHODS: Collagen and attapulgite clay were melted by dry weight ratio of 1:0, 5:1, 4:1, 3:1 to fabricate scaffold materials. The apparent characteristics of the materials were observed by scanning electron microscopy, the porosity and water absorption of quality of materials were determined before and after 1% genipin cross-linked. Rat bone marrow mesenchymal stem cells were inoculated on the four different materials. The materials were observed by scanning electron microscopy after 3 days. And the materials were stained by hematoxylin-eosin staining after 7 days. The four different materials cross-linked by 1% genipin were implanted into rats and the degradation of materials was observed 1 month after implantation.
RESULTS AND CONCLUSION: Materials were sponge and porous. The porosity of materials was between 60% and 80% before cross-linked, while the porosity of materials was between 40% and 65% after cross-linked. There was no significant difference among four groups (P > 0.05). The water absorption of quality of the materials was significantly reduced after cross-linked (P < 0.05). The collagen-attapulgite clay scaffolds have good biocompatibility and can be completely degraded and absorbed in vivo without inflammation. The collagen-attapulgite clay materials of different ratios have different biodegradation rates.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: collagen, egg white, stem cells

中图分类号:

R318

王九娜，赵兴绪，唐俊杰，李根，姜拓之，赵玲，秦文，赵红斌. 胶原蛋白与黏土混合材料的性能研究[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(47): 7573-7578.

Wang Jiu-na, Zhao Xing-xu, Tang Jun-jie, Li Gen, Jiang Tuo-zhi, Zhao Ling, Qin Wen, Zhao Hong-bin. The performance research of a mixed material of collagen and clay[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(47): 7573-7578.

图/表（结果） 5

2.1 胶原蛋白-凹凸棒黏土支架材料的表征 扫描电镜显示，支架材料呈海绵多孔状，纯胶原蛋白材料表面相对光滑，胶原-凹凸棒黏土表面粗糙，形成突起。不同比例的材料表面多孔，相互连通，交织成网状，孔隙大小不均一，随着加入的凹凸棒黏土的增多，材料的孔隙变密，见图1。

2.2 胶原蛋白-凹凸棒黏土支架材料的孔隙率及质量吸水性 1%京尼平交联前后，各组材料之间的孔隙率比较差异均无显著性意义；当胶原蛋白与凹凸棒黏土比例为3∶1时，交联后材料的孔隙率较交联前显著降低(P < 0.05)，见表1。1%京尼平交联后，各组材料的质量吸水率较交联前显著降低(P < 0.05)；交联前，胶原组与其他各组材料的质量吸水率比较差异有显著性意义(P < 0.05)；交联后，各组材料之间的质量吸水率比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1。

2.3 胶原蛋白-凹凸棒黏土支架材料的生物相容性 骨髓间充质干细胞接种于材料3 d，扫描电镜结果见图2，细胞核大小均一，较均匀地贴附在材料表面，细胞在材料上黏附、生长并增殖，材料与细胞有良好的生物相容性。加入凹凸棒黏土后，材料表面黏附的细胞增多，加入不同比例的凹凸棒黏土对细胞的黏附无显著影响。细胞接种于材料7 d，苏木精-伊红染色结果，见图3A，材料上有细胞黏附、生长。细胞在交联前后胶原蛋白材料表面的黏附无显著差异，在不同比例胶原蛋白-凹凸棒黏土材料间的黏附无显著差异。细胞化学免疫荧光结果，见图3B，不仅材料表面有细胞黏附，材料内部也可见细胞生长。胶原蛋白交联前后，材料表面的细胞无显著差异，不同比例的胶原蛋白-凹凸棒黏土材料间差异不显著。

2.4 胶原蛋白-凹凸棒黏土支架材料的动物体内降解情况 材料植入大鼠体内30 d后基本完全降解，被大鼠良好吸收，无组织粘连及炎症反应。材料降解速率不一，其中胶原蛋白与凹凸棒黏土比例为3∶1且经过交联的材料未完全降解，苏木精-伊红染色结果见图4。

参考文献

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引言

组织工程是用细胞-生物材料复合物修复损伤并重建功能，生物材料组织工程是目前研究最为广泛的组织工程方法，其3大要素是种子细胞、生物材料支架和生长因子^[1]。其中，支架材料作为细胞外基质，为细胞的黏附、生长、迁移、增殖和分化提供了适宜的环境，在人工组织构建中起着关键作用，是组织工程中重要的研究内容^[2]。

在骨组织工程中，支架材料主要包括人工合成材料、天然生物材料及复合支架材料3种类型^[3-5]。人工合成材料包括生物陶瓷(羟基磷灰石，磷酸三钙)、多孔金属(不锈钢，钴基合金)、聚乳酸、聚羟基乙酸及纳米材料等。天然生物材料主要有天然骨、珊瑚材料、胶原蛋白、纤维蛋白、几丁质、壳聚糖等。复合支架材料即将两种或两种以上的单一材料按不同比例混合，制备复合支架材料，发挥每种材料的优势，规避单一材料的缺点。近年来，对复合材料的研究取得许多成果^[6-8]。胶原蛋白作为一种天然高分子生物材料，已被证实可以用作组织工程支架。胶原蛋白是一种白色、不透明、无支链的蛋白质，呈纤维状，存在于动物皮肤和骨骼中，是哺乳动物中含量最丰富的动物蛋白，占人体或其他动物体总蛋白质的25%-33%，相当于体质量的6%^[9]。胶原蛋白是动物体内结缔组织的重要结构蛋白，其中富含甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸，能与各种细胞结合以构成性能各异的组织，可形成细胞外支架，维持组织和器官形态的完整性。胶原蛋白对细胞具有趋化作用，可促进细胞的黏附和增殖，诱导细胞分化^[10-12]，免疫原性低^[13]，具有易于降解和促进伤口愈合的生物学性能，是一种良好的支架材料。胶原蛋白黏稠，具有保护、支持人体骨骼张力强度等性质，被广泛用于医疗材料中，但由于机械强度低也限制了其应用。大量研究报道，通过改性增强胶原蛋白的力学性能，或通过添加其他物质改变其性质，能有效发挥胶原蛋白作为支架材料的独特优势^[14-16]。姜东林等^[17]研究表明经京尼平交联后，胶原蛋白具有更好的力学性能、更好的生物相容性及更低的生物降解速率，并且不影响细胞在材料上的增殖。

凹凸棒黏土又名坡缕石，是一种自然界较稀少、性能独特、用途广泛的非金属矿产，被誉为“千种用土，万土之王”，化学成分以SiO₂、MgO、Al₂O₃为主，化学性能稳定，广泛应用于医药、环保等领域^[18]。凹凸棒黏土矿物几乎遍布世界各地，中国甘肃、江苏、安徽、山东、辽宁等地已探明许多凹凸棒黏土矿点。美国早在20世纪40年代就已经开采应用凹凸棒黏土^[19]。中国凹凸棒黏土资源储量很大，但发现较国外晚，生产加工技术水平相对落后，因此国内凹凸棒黏土产品主要应用于少数低端领域，初加工产品及低附加值产品较多，从而造成许多优质原料没有得到合理利用。对凹凸棒黏土进行改性和加工处理，改变其性能，提高其应用价值，是开发凹凸棒黏土的重要研究方向^[20]。有研究报道硅元素具有促进成骨作用，而凹凸棒黏土中SiO₂为其主要成分，可以提供丰富的硅，成为一种潜在的骨替代材料^[21]。

本实验将不同比例凹凸棒黏土与胶原蛋白混合，采用真空冷冻方法构建一种新型组织工程支架材料，以期用于骨组织损失修复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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材料方法

设计：体内外细胞与材料实验。

时间及地点：于2014年2至6月在解放军兰州军区总医院骨研所完成。

材料：凹凸棒黏土由中科院兰州化学物理研究所环境材料与生态化学发展中心制备。

实验动物：3月龄清洁级雌性Wistar大鼠，体质量(200±10) g，由解放军兰州军区兰州总医院动物实验科提供，许可证号：SYXK(甘)2011-0001，符合国家实验动物检疫标准。

实验方法：

材料的制备：将胶原蛋白(从猪皮中提取)和凹凸棒黏土以干质量比为1∶0、5∶1、4∶1、3∶1的比例混合均匀，置于24孔板中，-20 ℃冰箱冷冻过夜，冷冻干燥机真空冻干，1%京尼平37 ℃交联0.5 h，冷冻干燥，密闭分装，⁶⁰Co照射，常温保存备用。

干细胞的分离与培养：取3月龄雌性Wistar大鼠1只，脱颈处死，体积分数75%乙醇消毒10 min，在超净工作台里取其后腿的股骨及胫骨，去掉肌肉，分别用剪刀剪去一端，完全培养基(含体积分数10%血清)冲洗骨髓腔至其发白，细胞筛过滤，得到大鼠骨髓间充质干细胞，37 ℃ CO₂培养箱里培养，隔日换液。取第4代细胞用于实验。

材料表征：材料经过干燥、喷金等常规处理后进行扫描电镜观察。

材料孔隙率的测定：由Wang等^[22]的方法加以改进，取青霉素小瓶，加入4 mL无水乙醇，称其质量为m₁；把材料加入到小瓶内，待乙醇将其完全浸没，在乙醇液面处做标记，取出材料后，称其质量为m₂；加无水乙醇使液面至标记处，称其质量为m₃；每组材料设7次重复。计算材料的孔隙率w：w=(m₁-m₂)/(m₃-m₂)×100%。

材料质量吸水率的测定：将材料烘干，称其质量为M₁，每组材料各设7次重复，将其放入装有蒸馏水的瓶子里浸泡，待其吸水饱和后称其质量为M₂，计算材料的吸水率W：W=(M₂-M₁)/M₁×100%。

材料与干细胞复合培养：无菌环境下将材料剪成15 mm×5 mm×1 mm的长方体状，置24孔板，加入3 mL 0.01 mol/L PBS浸泡，37 ℃ CO₂培养箱过夜。弃PBS，接种骨髓间充质干细胞，细胞浓度为2×10⁹ L^-¹，置37 ℃ CO₂培养箱培养，隔日换液。培养3 d，每组各取出1个材料，3%戊二醛固定，系列脱水，真空冷冻干燥, 喷金后扫描电子显微镜下观察细胞与材料的黏附情况。培养7 d后，将材料用体积分数10%甲醛固定，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，行组织切片。

免疫组织化学染色：石蜡切片经常规脱蜡，0.01% tritonX-100作用10 min，0.02 mol/L PBS洗，每次3 min；体积分数3% H₂O₂作用10 min，0.02 mol/L PBS洗，每次 3 min，5%BSA封闭20 min，弃多余封闭液，加入兔抗大鼠β-Tubulin(1∶1 000稀释)一抗，湿盒4 ℃过夜，0.02 mol/L PBS洗，每次5 min，加入FITC标记的羊抗兔二抗(1∶1 000稀释)，37 ℃湿盒避光作用30 min，0.02 mol/L PBS洗3次，0.5 μg/L的DAPI室温避光染核10 min，0.02 mol/L PBS洗3遍后，50%甘油磷酸缓冲液封固，荧光显微镜下观察并拍照。

动物实验：取3月龄Wistar雌性大鼠5只，3%戊巴比妥钠按30 mg/kg行腹腔麻醉，背部被毛后，碘伏消毒，分别切4个长1 cm切口，分别植入4种比例交联后直径为1 cm、厚度为0.2 mm的圆柱体材料，1个月后将大鼠脱颈处死，取材后体积分数10%甲醛固定，经脱水，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红染色。

主要观察指标：胶原蛋白-凹凸棒黏土支架材料的表观特征、孔隙率、质量吸水率、细胞相容性及降解性能。

统计学分析：采用SPSS 17.0统计软件进行分析，对材料的孔隙率和质量吸水率分别进行多重比较F 检验， P < 0.05认为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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讨论

随着骨组织工程的发展，复合材料支架越来越引起关注。有报道将羟基磷灰石与壳聚糖或胶原复合支架用于骨修复^[23-24]。羟基磷灰石是人体骨骼的主要无机成分，具有良好的生物活性，能够与骨组织形成骨键合，但羟基磷灰石抗疲劳度不佳，塑形困难，不利于新生骨的改建，不能完全满足骨替代材料的要求。凹凸棒黏土作为一种无毒、化学性能稳定的非金属矿产，有望成为潜在的骨替代材料。

凹凸棒黏土是一种具链层状结构的含水富镁硅酸盐黏土矿物，具有独特的分散、耐高温、抗盐碱等良好的胶体性质和较高的吸附脱色能力，并具有一定的可塑性及黏结力，其晶体结构模型的基本构成单元是由平行于c轴的硅氧四面体双链组成，各个链间通过氧原子连接，硅氧四面体的自由氧原子的指向(即硅氧四面体的角顶)每4个一组，上下交替地排列。但四面体的自由氧原子指向的不一致性决定了八面体片是不连续的，形成很多孔道，内部拥有巨大的比表面积。凹凸棒黏土中富含硅元素，而在动物的骨头与软骨中硅元素是必需的，主要形成胶原与黏多糖一类有机物质^[25]。对于骨质疏松症，由于钙质不停地从身体各大系统流失导致骨头变脆弱，人体需要有机硅帮助吸收和利用无机钙，而且有机硅能止痛，对于身体各项功能起着重要作用，与矿物质的吸收有着直接关系，甚至恢复身体的自我修复功能。凹凸棒黏土可以提供丰富的硅元素，是一种生物相容性良好的潜在骨替换材料。

作为一种良好的生物支架材料必须达到以下几个要求^[26]：第一，良好的生物相容性，支架材料本身或其降解产物对细胞和机体无毒，为细胞的生长提供良好的微环境，不影响细胞的增殖，很少甚至不会引发炎症或免疫排斥反应，能安全用于人体；第二，适当的生物降解速率，即支架材料的降解速率应当与组织再生速率相一致，降解过快或过慢都不利于损伤修复；第三，一定的力学强度和可塑性，支架材料需要具有一定的力学强度而起到支撑作用，使支架不易变形，在植入体内一段时间内保持其形状，良好的可塑性能使支架更好的与机体结合从而达到修复目的；第四，合适的孔隙率^[27]，有利于细胞的黏附，促进新生组织长入，利于营养成分的运输和代谢产物的排出^[27]。

本实验将凹凸棒黏土加入到胶原蛋白中构建出一种新型支架材料，扫描电镜观察结果显示材料表面多孔，交织成网状，孔隙间连续性好，为细胞提供了广泛的生长空间。在胶原蛋白中加入凹凸棒黏土后，材料的孔隙变密，且随着凹凸棒黏土比例的增大越明显。材料的孔隙率影响成骨细胞的增殖^[28]，1%京尼平交联前，胶原蛋白-凹凸棒黏土材料的孔隙率在60%-80%之间，交联后材料的孔隙率在40%-65%之间，京尼平交联对材料的孔隙率有影响。随着凹凸棒黏土比例的增加，材料的孔隙率有降低趋势，因此可以通过控制混合材料中胶原蛋白与凹凸棒黏土比例来控制孔隙率。人体松质骨的孔隙率为71%^[29]，可以通过改变交联剂对材料作进一步研究。

细胞在材料表面的黏附是评价材料生物相容性的重要指标之一。将骨髓间充干细胞接种于材料上3 d，扫描电镜即可见大量细胞黏附，细胞接种7 d后，苏木精-伊红染色及细胞化学免疫荧光结果可见细胞在材料上黏附、生长并增殖，证明胶原蛋白-凹凸棒黏土材料具有良好的生物相容性。凹凸棒黏土具有较大的表面积，其表面的物理化学结构及离子状态决定了凹凸棒黏土具有吸附性^[30]，在胶原蛋白中加入一定比例的凹凸棒黏土，可以更好地黏附大量细胞及其他生长因子，有助于促进损伤修复和功能重建。

在组织工程修复中，材料的降解速率过快或过慢都会影响组织修复，因此控制支架的降解时间很重要。在动物体内降解实验中，将经过1%京尼平交联的不同比例混合材料植入大鼠体内30 d后，只有胶原蛋白与凹凸棒黏土比例为3∶1的材料未完全降解，说明不同比例的混合材料的降解速率不同，加入凹凸棒黏土可以降低材料的降解速率，则混合材料具有可控的生物降解率。通过调节凹凸棒黏土与胶原蛋白的比例，控制材料的降解速率，使材料的降解时间与组织的形成时间一致。不同比例的材料植入动物体内可被大鼠完全吸收，且无炎症反应，材料具有良好的组织相容性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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