高压氧治疗肢体缺血再灌注无复流现象：血管内皮细胞生长因子及细胞间黏附分子1的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.42.015

摘要/Abstract

摘要：

背景：肢体血管损伤修复后缺血再灌注无复流现象严重影响患者的预后，高压氧对于治疗心肌缺血再灌注的效果确切，但对于治疗肢体缺血再灌注的疗效鲜有报道。
目的：检测患肢血清血管内皮细胞生长因子、细胞间黏附分子1的表达，探讨高压氧对肢体缺血再灌注后无复流现象预后的影响。
方法：临床筛选肢体主干动脉损伤病例，行血管修复，恢复肢体血供。术后随机分为2组(外科治疗并高压氧组、外科治疗组)，每组16例。外科治疗并高压氧组以高压氧仓结合临床抗凝、趋聚等治疗，外科治疗术后仅使用临床抗凝、趋聚等治疗方案。另外选取正常成年人体检志愿者16例单纯使用高压氧治疗为高压氧组。3组均于术后8 h、72 h、7 d以酶联免疫吸附法检测再灌注肢体血清血管内皮细胞生长因子、细胞间黏附分子1表达水平。
结果与结论：外科治疗两组患者血管内皮细胞生长因子在术后呈现高表达，各时间显著高于高压氧组(P < 0.01)；在72 h外科治疗并高压氧组血管内皮细胞生长因子表达显著高于外科治疗组(P < 0.01)。外科治疗两组患者相对于高压氧组细胞间黏附分子1同样呈现高表达(P < 0.01)，在8 h、72 h时间段外科治疗并高压氧组表达水平低于外科治疗组(P < 0.05)。结果提示高压氧能诱导血管内皮细胞生长因子的高表达，抑制细胞间黏附分子1的表达，对于促进毛细血管的生长、内皮细胞生成、减轻缺血再灌注无复流现象对组织的损害有重要意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 高压氧, 缺血再灌注, 无复流现象, 血管内皮细胞生长因子, 细胞间黏附分子1

Abstract:

BACKGROUND: Clinical limb ischemia-reperfusion with no reflow phenomenon after vascular injury repair seriously affects the prognosis of patients. Therapeutic effect of hyperbaric oxygen in myocardial ischemia reperfusion is exactly confirmed, but hyperbaric oxygen is rarely reported in the treatment of limb ischemia-reperfusion.
OBJECTIVE: To detect the expression of vascular endothelial growth factor and intracellular adhesion molecule 1 and to investigate the effect of hyperbaric oxygen on the prognosis of limb ischemia-reperfusion with no reflow phenomenon.
METHODS: By clinical screening, cases of main arterial injury of the limbs were selected and subjected to vascular repair for restoring limb blood supply. After surgery, all the cases were randomly divided into two groups (Combined treatment group and surgical group), 16 cases in each group. Combined treatment group was treated with hyperbaric oxygen combined with clinical anticoagulant, antiplatelet treatment; surgical group treated with only postoperative clinical treatment. Another 16 adult healthy volunteers were selected to receive hyperbaric oxygen as hyperbaric oxygen group. Expressions of vascular endothelial growth factor and intracellular adhesion molecule 1 were detected using enzyme-linked immunosorbent assay at 8, 72 hours and 7 days after surgery.
RESULTS AND CONCLUSION: In the combined treatment and surgical groups, patients exhibited higher expressions of vascular endothelial growth factor and intracellular adhesion molecule 1 than those in the hyperbaric oxygen group (P < 0.01). After 72 hours, the expression of vascular endothelial growth factor was significantly higher in the combined treatment group than the surgical group (P < 0.01). At 8 and 72 hours, the expression of intracellular adhesion molecule 1 was lower in the combined treatment group than the surgical group (P < 0.05). These findings suggest that hyperbaric oxygen can induce high expression of vascular endothelial growth factor and inhibit intracellular adhesion molecule 1, which is crucial for improving growth of blood capillary, formation of endothelial cells, reducing no reflow phenomenon.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: hyperbaric oxygenation, reperfusion injury, vascular endothelial growth factors, cell adhesion molecules

中图分类号:

R318

付召军，向敏华，魏健，张陈. 高压氧治疗肢体缺血再灌注无复流现象：血管内皮细胞生长因子及细胞间黏附分子1的表达[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(42): 6800-6804.

Fu Zhao-jun, Xiang Min-hua, Wei Jian, Zhang Chen. Hyperbaric oxygen for limb ischemia-reperfusion with no reflow phenomenon: expression of vascular endothelial growth factor and intracellular adhesion molecule 1[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(42): 6800-6804.

图/表（结果） 1

参考文献

[1] Butler MJ, Chan W, Taylor AJ, et al.Management of the no-reflow phenomenon. Pharmacol Ther. 2011;132(10): 72-85.
[2] Szijártó A, Turóczi Z, Szabó J, Kaliszky P, et al.Rapidly progressing fatal reperfusion syndrome caused by acute critical ischemia of the lower limb. Cardiovasc Pathol. 2013; 22(6):493-500.
[3] Buras JA, Colgan SP, Stahl GL, et al.Hyperbaric oxygen decreases intercellular adhesion molecule-1 mRNA expression in an in vitro model of ischemia/reperfusion. Annals of emergency medicine.2009;34(4):S3.
[4] Baynosa RC, Naig AL, Murphy PS, et al. The effect of hyperbaric oxygen on nitric oxide synthase activity and expression in ischemia-reperfusion injury. J Surg Res. 2013; 183(1):355-361.
[5] Yuan J, Handy RD, Moody AJ, et al. Response of blood vessels in vitro to hyperbaric oxygen (HBO): Modulation of VEGF and NOx release by external lactate or arginine. Biochim Biophys Acta. 2009;1787(7):828-834.
[6] 徐江,黄晓琳.高压氧对脑缺血再灌注大鼠核因子-kB及细胞间黏附分子-1表达的影响,中华物理医学与康复杂志[J],2005,27(5): 259-262.
[7] Fok TC, Jan A, Peel SA, et al. Hyperbaric oxygen results in increased vascular endothelial growth factor (VEGF) protein expression in rabbit calvarial critical-sized defects. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2008;105(4): 417-422.
[8] Carla M, Brian K. Hyperbaric oxygen decreases neutrophil adherence in ischemia reperfusion by a VEGF-dependent mechanism.Journal of the American college of surgeons. 2010;201(3):s57.
[9] Shah J. Hyperbaric oxygen therapy. J Am Col Certif Wound Spec.2010;2(1):9-13.
[10] 冯娟娟,何予工,粱维娣,等.脑缺血后立即高压氧治疗对脑缺血再灌注损伤大鼠脑梗塞体积的影响[J].中华物理医学与康复杂志, 2014,36(2):141-143.
[11] Liu S, Shen GY, Deng SK, et al. Hyperbaric oxygen therapy improves cognitive functioning after brain injury. Neural Regen Res.2013;8(35): 3334-3343.
[12] Feng ZH, Liu J, Rong Ju R. Hyperbaric oxygen treatment promotes neural stem cell proliferation in the subventricular zone of neonatal rats with hypoxic-ischemic brain damage. Neural Regen Res.2013;8(13): 1220-1227.
[13] 张陈陈,施莼,王映红,等.高压氧医学伦理问题的编审防范措施[J]. 中国科技期刊研究,2011,22(6):938-940.
[14] 王海东,潘树义,肖宏,等.高压氧舱质量安全管理体系的建立和运行[J].中国医疗设备,2014,29(1):77-79.
[15] 鲍瑞军,张茜,张佩军,等.重复高压氧预处理对大鼠脊髓缺血再灌注损伤保护中环氧合酶-2表达的影响及机制[J].中国老年学杂志, 2013,33(13):3134-3134.
[16] Stoekenbroek RM, Santema TB, Legemate DA, et al. Hyperbaric oxygen for the treatment of diabetic foot ulcers: a systematic review. Eur J Vasc Endovasc Surg. 2014;47(6): 647-646.
[17] Goldman RJ.Hyperbaric Oxygen Therapy for Wound Healing and Limb Salvage: A Systematic Review. PMR. 2009;1(5): 471-489.
[18] Wang YC, Zhang S, Du TY,et al.Hyperbaric oxygen preconditioning reduces ischemia–reperfusion injury by stimulating autophagy in neurocyte. Brain Res. 2010;1323: 149-151.
[19] 王友彬,戚征,高春锦,等.高压氧预处理对皮瓣组织Cx43和TNF- a表达的影响[J].中华航海医学与高气压医学杂志,2013,20(1): 9-12.
[20] 马永信,张振英,吴学田,等.高压氧对移植皮瓣患者血清血管内盘细胞生长因子和缺氧诱导因子-1含量的影响[J].中华航海医学与高压医学杂志,2012,19(5):307-308.
[21] Liu X, Zhou Y, Wang Z, et al. Effect of VEGF and CX43 on the promotion of neurological recovery by hyperbaric oxygen treatment in spinal cord–injured rats. Spine J. 2014;14(1): 119-127.
[22] 戴铁,高春锦,王国忠.脑缺血及高压氧治疗中血管内皮细胞生长因子mRNA表达的研究[J].北京医学,2008,28(10):602-604.
[23] Oliveira N, Rosa P, Borges L,et al. Treatment of diabetic foot complications with hyperbaric oxygen therapy: a retrospective experience. Foot Ankle Surg. 2014;20(2):140-143.
[24] He X, Xu X, Fan M, et al. Preconditioning with Hyperbaric Oxygen Induces Tolerance Against Renal Ischemia-Reperfusion Injury Via Increased Expression of Heme Oxygenase-1.J Surg Res. 2011;170(2):e271-7e277.
[25] Zhou Y, Liu XH, Qu SD, et al.Hyperbaric oxygen intervention on expression of hypoxia-inducible factor-1α and vascular endothelial growth factor in spinal cord injury models in rats.Chin Med J (Engl). 2013;126(20):3897-3903.
[26] Asano T, Kaneko E, Shinozaki S, et al.Hyperbaric oxygen induces basic fibroblast growth factor and hepatocyte growth factor expression, and enhances blood perfusion and muscle regeneration in mouse ischemic hind limbs.Circ J. 2007;71(3): 405-411.
[27] Teas J, Cunningham JE, Cone L, et al.Can hyperbaric oxygen therapy reduce breast cancer treatment-related lymphedema? A pilot study.J Womens Health (Larchmt). 2004;13(9): 1008-1018.
[28] Salgado CJ, Jamali AA, Ortiz JA, et al.Effects of hyperbaric oxygen on the replanted extremity subjected to prolonged warm ischaemia.J Plast Reconstr Aesthet Surg. 2010;63(3): 532-537.
[29] Kendall AC, Whatmore JL, Harries LW, et al.Different oxygen treatment pressures alter inflammatory gene expression in human endothelial cells.Undersea Hyperb Med. 2013;40(2): 115-123.
[30] Kemper TC, de Jong VM, Anema HA, et al.Frostbite of both first digits of the foot treated with delayed hyperbaric oxygen:a case report and review of literature.Undersea Hyperb Med. 2014;41(1):65-70.
[31] Bozok S, Ilhan G, Yilmaz Y, et al.Protective effects of hyperbaric oxygen and iloprost on ischemia/reperfusion- induced lung injury in a rabbit model.Eur J Med Res. 2012; 17:14.

引言

缺血再灌注无复流现象既往常用来定义急性冠脉综合征病例，经急诊经皮冠状动脉介入术(PCI)后，血管再通出现的心肌无灌注现象^[1]。而骨骼肌缺血再灌注后的无复流现象在临床上研究较少。研究表明，临床上肢体损伤导致主干血管断裂或损伤，导致肢体血供中断后，经手术行血管修复恢复肢体血流后，有5%-20%的肢体会出现缺血、缺氧性改变，而这其中有部分病例经检查肢体血供已恢复，其只能通过肢体骨骼肌缺血再灌注后无复流现象来解释^[2]。

肢体损伤修复后缺血再灌注无复流现象是影响预后的最重要因素之一^[3]，无复流现象对肢体骨骼肌的影响主要体现在以下两方面：一方面是通过对肢体血管的再灌注损伤，导致血管内皮细胞脱落，导致内皮下层组织裸露，启动凝血机制，导致形成微血栓，影响组织微循环^[4]；另一方面是调动机体炎性反应，刺激机体炎性细胞如中性粒细胞、巨噬细胞等在肢体的聚集，同时表达产生大量的炎性细胞因子，而这些产生的炎性因子反过来刺激更多的炎性细胞聚集到缺血的肢体，这种“恶性循环”加重了肢体的再灌注损伤，导致出现临床出现如肢体坏死等不可逆的病理损害。

在既往的研究中发现，细胞内血管内皮细胞生长因子^[5]、细胞间黏附分子1在其中起着非常重要的作用^[6]。血管内皮细胞生长因子在维持血管内皮的完整性，维持凝血系统和纤溶系统平衡方面有举足轻重的地位^[7]。研究表明，血管内皮细胞生长因子表达水平与血管内皮细胞完整性成正相关，是一种促进血管内皮细胞生长及渗透的因子，具有增加血管通透性、促进内皮细胞增殖及维持血管功能的作用。近年来广泛地应用于脑、心脏和肌肉组织血管再生的领域的研究^[8]。而细胞间黏附分子作为重要的炎症诱导因子，属于黏附分子免疫球蛋白超家族(IgSF)成员，其广泛表达于造血细胞和免疫细胞表面，与造血发育和免疫应答密切相关，其表达水平与机体炎症反应导致的损伤有直接关系。

高压氧作为近年来新起的治疗缺血、缺氧性疾病的措施^[9]，其疗效得到了证实。研究表明，高压氧能激发机体的内源性保护机制，减轻全身及局部的炎症反应、调节免疫功能，改善细胞的有氧代谢，而广泛应用于改善脑、脊髓及组织缺血、缺氧的治疗^[10-12]。高压氧对肢体血管损伤后缺血再灌注损伤的治疗有肯定的疗效^[7]，而其作用于机体所产生的细胞分子效应，目前正处于研究阶段。本课题通过检测血管损伤修复术后患者组织血管内皮细胞生长因子、细胞间黏附分子1水平，探讨高压氧对通过对部分细胞因子的影响，影响肢体血管损伤的预后情况。

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材料方法

设计：随机对照病例分析。

时间及地点：病例来源于2012年5月至2014年2月自贡市第四人民医院收治的肢体血管损伤患者。　

对象：选择同期本院骨科确诊并收治的32例肢体血管损伤患者，肢体缺血时间均在8 h内，平均为(5.6±1.8) h。男23例，女9例；年龄15-67岁，平均年龄(38.3±6.4)岁。其中单纯肢体主干动脉损伤8例，血管离断5例，合并神经、肌腱断裂19例。

肢体血管损伤诊断标准：①有明确的肢体外伤史。②术前查体发现肢体主干血管已部分或完全离断。③辅助检查提示远端肢体无血流信号。

纳入标准：①肢体血管损伤者。②肢体缺血时间均在 8 h内。③经患者知情同意，经医院批准并签署知情同意书^[13]。

排除标准：①合并糖尿病、心脑血管疾病等干扰因素。②术后经简易多普勒超声探及患肢足背动脉血流信号，无血栓形成者。

将32例患者随机分为外科治疗并高压氧组和外科治疗组。外科治疗并高压氧组16例，男12例，女4例；年龄18-67岁，平均年龄(39.5±7.0)岁。外科治疗组16例，男11例，女5例，年龄15-63岁，平均年龄(37.2±6.8)岁。另选健康体检志愿者16例为高压氧组，男12例，女4例，年龄16-66岁，平均年龄(38.6±6.7)岁。入院检查肾功均正常，既往无肾病史，同时各组年龄、性别组成具有可比性(P > 0.05)。

设备、仪器和试剂：GY2600医用高压氧仓为烟台宏远氧业有限公司制造^[14]；ELX800自动酶标仪为Bio-tek公司产品；酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒购置美国R＆D公司。

方法：

各组治疗方法：外科治疗并高压氧组在外科手术行血管、神经、肌腱修复后，常规抗凝、抗血小板治疗的基础上，术后3 h内即用高压氧仓治疗，压力为0.2 MPa，加压20 min，减压20 min，吸纯氧60 min，间歇2次，5 min/次，1次/d，7次为1个疗程。外科治疗组行血管、神经、肌腱修复后，只行常规治疗。高压氧组单纯使用高压氧治疗。

标本收集：外科治疗并高压氧组及外科治疗组均于术后8 h、72 h、7 d各抽取患肢静脉血5 mL。高压氧组于高压氧治疗后对应时间抽取外周静脉血5 mL，加入枸橼酸钠抗凝，混合10-20 min后，离心机3 000 r/min离心20 min，分离血清，-80 ℃冰箱保存。

血清血管内皮细胞生长因子、细胞间黏附分子1水平测定：采用酶联免疫吸附法(ELISA)、Bio-tek ELX800自动酶标仪测定血清血管内皮细胞生长因子、细胞间黏附分子1水平。操作均按试剂盒说明书进行，所有样品均设立复孔，均为同一时间段检测。

主要观察指标：①各组各时间段血清血管内皮细胞生长因子和细胞间黏附分子1水平。②各组各时间段血清血管内皮细胞生长因子、细胞间黏附分子1间相关性分析。

统计学分析：所有资料均使用SPSS 17.0软件处理，计量资料以x(_)±s表示，并对各组资料进行t 检验，血管内皮细胞生长因子、细胞间黏附分子的相关性采用直线相关分析。以P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

无复流是指机体在无明显持续性机械性病变(如外伤、残留狭窄、夹层、痉挛、血栓形成及急性闭塞)的情况下，血流减慢或完全无血流的现象。无复流现象常见于心肌，也可见于脑、肾、骨骼肌等处，无复流现象造成的组织损伤实际上是缺血在时间上的延续和程度的叠加^[15]。其发生的机制目前有以下几类：微循环血管栓塞、微循环血管痉挛、白细胞和血小板作用、氧自由基介导的微循环血管损伤。对无复流现象的治疗临床上大致分为药物治疗和非药物治疗两种。高压氧在近年已经通过临床证实，其作为一种非药物、无创治疗方法，对缺血再灌注有很好的治疗作用^[16]。

高压氧治疗作为一种无创疗法，对组织缺血再灌注损伤的疗效已得到医学上的肯定。高压氧在医学上的治疗因素中，治疗时间的长短和治疗压力的大小是一个明显原因。研究表明高压氧能分化内皮细胞、改善组织缺血缺氧和微环境，可能减轻缺血再灌注损伤，高压氧可以明显提高血液和组织液的氧含量和氧张力，降低无氧酵解，增强有氧氧化和能量代谢，进而改善局部缺氧状态^[17-18]。另外，高压氧还能降低组织细胞内的炎症因子和氧自由基，防止过度炎症反应和过氧化反应，减轻缺血再灌注对细胞膜的损伤，一定程度上改善细胞的水肿和细胞变性，减低细胞黏度以及改善微循环，同时也能减轻再灌注后对远隔脏器如心、肾功能的损害作用。

目前航海和高压医学学会推荐高压氧治疗压力应在240-300 kPa，避免氧性抽搐的毒性作用。目前临床治疗高压氧压力设置多为150-300 kPa，治疗持续时间多数控制在60 min，疗程多为1-10 d^[19]。试验结果表明所设计的治疗疗程和治疗压力是可行的。具有可操作性。

血管内皮细胞生长因子在正常成年组织中表达量很少，在肺、肾、脑等组织有一定低水平的表达，而在某些如外伤、缺血等应激状况下，血管内皮细胞生长因子在局部组织中的表达量显著增加。创伤修复后6-12 h后毛细血管芽开始生长，48 h逐步建立血液循环，1周左右建立较好的循环。血管内皮细胞生长因子是目前发现的惟一作用于血管内皮细胞的生长因子，可调节血管生成的大多数环节，如内皮细胞外基质溶解，内皮细胞迁移、增生和管腔形成，促进新生血管的生长与形成^[20]。本试验通过检测术后各不同时间段血清血管内皮细胞生长因子水平，发现术后8 h血管内皮细胞生长因子变化不明显，术后72 h其水平明显升高，外科治疗并高压氧组相对于外科治疗组及高压氧组升高差异有显著性(P < 0.05)，说明高压氧状态可改善局部组织的氧合状态，从分子水平上增强血管内皮细胞生长因子及其受体(血管内皮细胞生长因子受体1和受体2)的活性，进一步促进内皮细胞增殖和新生血管形成。减轻缺血再灌注无复流状态对组织的损害^[21-22]。

细胞间黏附分子主要在内皮细胞、平滑肌细胞和纤维母细胞等细胞中表达，其生物学作用主要是与其配体结合介导白细胞与血管内皮细胞的黏附，促进炎症的发生与发展。也是与T细胞和B细胞活化密切相关的协同刺激配体，影响着T、B淋巴细胞的活化及增殖。其升高情况在一定程度上反映了炎症情况，可作为炎症反应的标志。本实验研究发现，外科治疗组(外科治疗并高压氧组和外科治疗组)术后细胞间黏附分子水平相对高压氧组显著升高，反映了创伤后机体炎症反应过程，而炎症反应的高风险一般在创伤或手术后72 h左右，其与中性粒细胞、T、B淋巴细胞作用时间一致^[23]。而外科治疗并高压氧组相对于外科治疗组，其细胞间黏附分子1水平在术后72 h偏低(P < 0.05)，反映了其在炎症反应高峰期。高压氧通过改善组织氧供，减低细胞黏度以及改善微循环，从而减轻缺血再灌注对组织的损害。

血管内皮细胞生长因子，细胞间黏附分子作为肢体缺血再灌注无复流现象中的重要因子，其表达量在一定程度上影响了患者的预后。本试验通过高压氧的治疗对比，发现其无论是在改善患肢血供，还是减轻炎症反应、减轻组织损害上都有确切的效果^[24]。研究表明高压氧在促进肢体微循环建立，新生血管的生长有促进作用，同时能抑制某些炎性细胞如淋巴细胞、白细胞的增殖。本文结果提供了高压氧在治疗肢体损害修复后所产生细胞因子变化的理论依据，可能对临床上治疗肢体缺血再灌注损伤提供了一些方向。但高压氧对于治疗肢体缺血再灌注无复流现象的机制仍然存在双重性、复杂性，需要进一步的基础及临床研究加以探索、研究和论证，同时也需要基础和临床的大样本试验予以验证。随着高压氧对机体影响的研究逐渐深入^[25-31]，已有可能使用基因分析的方法，检测高压氧对蛋白质产物在基因方面的影响，高压氧对肢体缺血再灌注现象的影响也将进行更深入的研究。

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