抑制血管生成药安维汀玻璃体腔注射后房水细胞因子的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.42.016

摘要/Abstract

摘要：

背景：关于抑制血管生成药安维汀(Avastin)治疗增殖型糖尿病视网膜病变的机制研究大多数均局限在血管内皮生长因子本身，而结缔组织生长因子、血管增生抑制因子也在其疾病中扮演着重要的角色。
目的：考察增殖性糖尿病视网膜病变玻璃体切割术前应用安维汀玻璃体腔注射前后房水细胞因子的变化。
方法：选取增殖性糖尿病视网膜病变患者30例(30眼)，采用随机数字表法分为3组，每组10例(10眼)。玻璃体切割组：直接行玻璃体切割手术；安维汀注射0.05 mL组：于玻璃体切割前7 d玻璃体腔注射0.05 mL安维汀(1.25 mg)；安维汀注射0.1 mL组：于玻璃体切割前7 d玻璃体腔注射0.1 mL安维汀(2.5 mg)。分别于术中抽取少量房水，检查血管内皮生长因子、结缔组织生长因子及色素上皮衍生因子的表达变化。
结果与结论：与玻璃体切割组比较，安维汀注射组房水中血管内皮生长因子含量降低，色素上皮衍生因子和结缔组织生长因子含量增高，并能抑制血管内皮生长因子的表达，差异有显著性意义；安维汀注射0.05 mL组与安维汀注射0.1 mL组相比，差异无显著性意义。结果说明玻璃体腔注射安维汀在增殖性糖尿病视网膜病变玻璃体切割前辅助应用可以减少与增殖相关的细胞因子的含量，同时增加了拮抗新生血管生长的细胞因子。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 增殖性糖尿病视网膜病变, 眼, 安维汀(Avastin), 房水, 细胞因子

Abstract:

BACKGROUND: Studies on the inhibitory mechanism of Avastin for proliferative diabetic retinopathy are mostly confined to the vascular endothelial growth factor, while connective tissue growth factor and angiogenesis inhibitor also play an important role in the disease.
OBJECTIVE: To evaluate the changes of cytokines in the aqueous undergoing Avastin intravitreous injection or not prior to pars plana vitrectormy in the treatment of proliferative diabetic retinopathy.
METHODS: Thirty patients with proliferative diabetic retinopathy (30 eyes) were selected and randomly divided into groups A, B and C, each group containing 10 patients. Group A was treated with single pars plana vitrectormy; and group B and group C had 0.05 mL/1.25 mg and 0.1 mL/1.25 mg Avastin via intravitreous injection at 7 days before pars plana vitrectormy, respectively. Aqueous humor samples were collected during pars plana vitrectormy. The levels of vascular endothelial growth factor, connective tissue growth factor and pigment epithelium-derived factor were assessed by using ELISA technique.
RESULTS AND CONCLUSION: The levels of connective tissue growth factor and pigment epithelium-derived factor in the aqueous humor of two Avastin injection groups were increased significantly compared to the group with single pars plana vitrectormy. However, the level of vascular endothelial growth factor was lower in the Avastin injection groups. In addition, there was no significant difference between two Avastin injection groups. These results reveal that intravitreous injection of Avastin assisted vitrectomy for proliferative diabetic retinopathy is more effective than single pars plana vitrectormy treatment. The underlying mechanisms may be that Avastin could inhibit the intraocular angiogenesis by not only reducing the secretion of some growth factors but also increasing the levels of anti-angiogenesis related cytokines.

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Key words: eye, retinal diseases, diabetic mellitus, aqueous humor, cytokines

中图分类号:

R318

肖津安，白清玉，谢安明 . 抑制血管生成药安维汀玻璃体腔注射后房水细胞因子的变化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(42): 6805-6810.

Xiao Jin-an, Bai Qing-yu, Xie An-ming . Changes of cytokines in the aqueous humor following Avastin intravitreous injection[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(42): 6805-6810.

图/表（结果） 2

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引言

增殖型糖尿病视网膜病变是世界上主要的导致视力丧失的眼病之一，其主要标志为视网膜新生血管形成和纤维增生，严重影响视功能的并发症有黄斑水肿、玻璃体积血、牵拉性视网膜脱离和新生血管性青光眼等，目前有效的治疗手段有玻璃体切割术联合全视网膜光凝治疗，但术中纤维血管膜剥离困难，术中出血多影响手术操作，拖延手术时间，术后由视网膜新生血管过度形成和纤维增生引起玻璃体再出血及视网膜脱离，从而使该疾病致盲率很高，手术后视功能恢复不佳^[1]。

近期研究提示术后生长因子在增殖型糖尿病视网膜病变的发生发展中起重要作用^[2-3]，眼内存在的促视网膜新生血管形成的主要因子为血管内皮生长因子，抗血管内皮生长因子治疗成为近年研究的热点。抑制血管生成代表性的药物之一安维汀(Avastin)为贝伐单抗(Bevacizumab)，是一种重组的人源化单克隆抗体，能与人血管内皮生长因子结合并防止其与内皮细胞表面的受体结合从而阻断血管内皮生长因子的生物活性，其商品名为Avastin，是由美国基因泰克(Genentech)公司研发的，于2004年由美国FDA批准使用，早期主要是用于治疗实体肿瘤，后期经临床试验逐渐被证实可用于多种眼科疾病的治疗，目前被广泛用于治疗眼部血管性疾病。以往研究已经证明，增殖性糖尿病视网膜病变在玻璃体切割术前应用玻璃体腔注射安维汀能有效减少术中出血、增殖膜剥离不彻底、医源性裂孔、牵拉性视网膜脱离等并发症的发生^[4-5]，简化手术过程，减少术后玻璃体再出血及血管增生，提高患者视功能。

关于安维汀治疗增殖型糖尿病视网膜病变的机制研究目前国内外报告很多，不过大多数均局限在血管内皮生长因子分子本身，但是增殖型糖尿病视网膜病变的发病不仅仅涉及到血管内皮生长因子这一种生长因子，结缔组织生长因子也在其中扮演着重要的角色，同时该疾病还和血管增生的抑制因子调控失衡有关，例如眼内能够抑制血管生成和组织纤维化的色素上皮衍生因子。因此，鉴于玻璃体液抽取困难以及抽取后引发的视网膜脱离、视网膜出血、玻璃体出血、黄斑水肿，眼内炎等并发症较多，试验以房水为对象，全面考察安维汀使用前后房水中与血管增生及基质分泌密切关联的几种生长因子和生长抑制因子的变化，为优化安维汀对于增殖型糖尿病视网膜病变的临床治疗提供更多机制上的证据。

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材料方法

设计：分组对照病例分析。

时间及地点：试验于2013年5月至2014年4月在西安交通大学第一附属医院眼科实验室完成。

对象：选取西安交通大学第一附属医院眼科收治的增殖性糖尿病视网膜病变患者30例(30眼)，所有患者年龄均在35-75岁之间，均为2型糖尿病患者，且病程都在5年以上。

诊断标准：按照1984年国内眼底病学组制订的分期标准^[6]，均为Ⅳ期糖尿病性视网膜病变。

纳入标准：①所有患者均未进行过视网膜激光治疗、眼周注射在内的任何眼部治疗。②本试验经西安交通大学第一附属医院眼科中心医学伦理委员会批准。③安维汀手术的患者均已被告知安维汀的国内外使用现状、治疗适应证、使用方法，不良反应及疗效等，并签署玻璃体腔注射安维汀知情同意书。

排除标准：①对试验结果有影响的眼部疾病及眼外伤病史眼部手术史。②糖尿病视网膜病变伴发玻璃体积血患者经眼部B超检查确诊未见增殖膜。③晶体手术的患者。④血糖、血压等全身状况控制不理想者及自身免疫性疾病、恶性肿瘤、严重的肝、肾、心脑血管病变及血液系统等全身慢性疾病者。

药品：安维汀(Avastin)：100 mg，4 mL，(25 mg/mL)，批号：H0129B03，批准文号：进口药品注册证号S20100023，美国罗氏生产。ELISA检测试剂盒购于美国Sigma公司。

方法：

分组：用随机数字法将患者分组，分3组，每组10例(10 眼)。玻璃体切割组：直接行玻璃体切割手术；安维汀注射0.05 mL(1.25 mg)组：于玻璃体切割前7 d玻璃体腔注射0.05 mL安维汀(1.25 mg)；安维汀注射0.1 mL (2.5 mg)组：于玻璃体切割前7 d玻璃体腔注射0.1 mL安维汀(2.5 mg)。

玻璃体腔注射：安维汀玻璃体腔注射在手术室内进行，术前3 d抗生素滴眼液点眼，常规消毒、铺巾，严格无菌操作，注射前常规前房穿刺降低前房压力，便于后续步骤玻璃体腔注射药物，同时收集前房穿刺的少量房水，并冷冻保存，统一检测，于患眼颞上角膜缘后4 mm处用 1 mL注射器玻璃体腔内注射安维汀0.05 mL或0.1 mL，术后给予抗炎治疗，术后每日进行眼压、裂隙灯及眼底检查，所有患者眼压正常且均未发生晶状体损伤、虹膜损伤、医源性视网膜裂孔及眼内新鲜出血、眼内炎症、高眼压等并发症。

房水抽取：3组试验对象均于玻璃体切割前，以 1∶2 000的妥布霉素生理盐水冲洗结膜囊，减少眼内炎的发生，常规无菌消毒铺巾，以无菌1 mL一次性塑料TB针管接9号针头，于角膜缘内1 mm作前房穿刺，从中央瞳孔区抽吸房水100-200 μL，-20 ℃冰箱保存，手术结束后转至-80 ℃深低温保存，统一检测。

细胞因子检测：选择玻璃体腔注药前及注射后7 d检测房水。采用ELISA法测定标本中的血管内皮生长因子，色素上皮衍生因子，结缔组织生长因子的浓度，比较3组患者房水中细胞因子的表达，以及不同剂量安维汀对细胞因子表达的影响。

主要观察指标：各组患者房水中血管内皮生长因子、色素上皮衍生因子及结缔组织生长因子质量浓度变化。

统计学分析：采用SPSS 13.0统计软件包进行统计学处理，所有数据用x(_)±s表示，组间比较采用独立样本t 检验，安维汀注射前后的组内比较用配对t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

糖尿病视网膜病变的病理特征是新生血管的出现、视网膜缺血、缺氧、纤维血管膜形成和血-视网膜屏障(blood-retinal barrier，BRB)的破坏，其进展过程与多种血管源性细胞因子和炎性趋化因子异常表达相关联。视网膜新生血管生成导致增殖性糖尿病视网膜病变患者出现玻璃体积血、视网膜增生膜形成、牵拉性视网膜脱离及新生血管性青光眼。增殖性糖尿病视网膜病变目前有效的治疗手段有玻璃体切割手术和全视网膜光凝术，伴随着玻璃体手术技术提高及设备的更新，以上治疗后部分患者视功能改善，部分患者视力不提高或丧失，原因是眼部新生血管和纤维增殖病变导致并发症丧失视力，引起患者生活质量降低，加重社会家庭的负担。致力于减少新生血管出现、抑制视网膜纤维血管膜的形成，对已形成的新生血管逆转和控制发展是目前治疗增殖性糖尿病视网膜病变的一个热点。

安维汀是目前临床应用最广泛的、价格低廉、疗效快、并发症少的具有抗新生血管作用的一种药物。计岩等^[7]的Meta分析表明，在玻璃体切割术前实施玻璃体腔安维汀注射治疗增殖型糖尿病视网膜病变，能使术后患者视力更好的恢复，缩短手术时间和减少术中、术后并发症，降低手术风险，提高手术效果。Schmidinger等^[8]研究发现安维汀玻璃体腔注射能明显减少增殖型糖尿病视网膜病变患者视网膜内的新生血管的数量，提出每3个月为1个疗程能控制视网膜的新生血管。Rizzo等^[9]及Oshima等^[10]的临床试验对增殖型糖尿病视网膜病变患者玻璃体切除术辅助安维汀玻璃体腔注射与单纯行玻璃体切除进行了对比研究，发现安维汀辅助手术提高了视网膜复位率，降低手术并发症，明显缩短手术时间。而目前关于安维汀这种疗效的机制研究，大部分学者都局限在血管内皮生长因子本身，但是影响血管增殖和纤维增生的因素很多，不排除安维汀可能会对多种生长因子的表达和分泌产生影响。为此，本研究除了考察安维汀对于血管内皮生长因子的影响以外，同时综合考察了和血管增生密切关联的两种生长因子色素上皮衍生因子和结缔组织生长因子，发现安维汀能够显著性降低房水中血管内皮生长因子水平，同时增加色素上皮衍生因子和结缔组织生长因子的分泌，因此可以明显抑制术后的新生血管形成。

玻璃体腔注射安维汀剂量仅为全身用药的1/200，全身不良反应主要包括：脑血管意外、短暂性脑缺血、深静脉血栓形成、血压升高等，但发生率极低，以上的不良反应均与患者治疗前的基础疾病有明显相关性。因此本试验设计时排除了有全身系统性疾病的患者，选取试验对象时排除眼部疾病因素，同时选择了增殖性糖尿病视网膜病变Ⅳ期的患者，目的是为了排除其他疾病对试验结果的干扰及了解纤维增殖较轻的患者注药后的效果，从而得到准确的安维汀玻璃体腔注射前后房水细胞因子的数值，以往针对此类情况的研究内容较少。房水是一种复合的眼内生物活性液体，内含多种细胞因子，其中由视网膜产生的各种生长因子通过多种途径进入到房水循环中，房水代谢与血液循环相通，因此眼房水中生长因子的浓度变化可在一定程度上反映其在眼内组织尤其是视网膜的表达情况。鉴于玻璃体液抽取困难以及抽取后引发的视网膜脱离、视网膜出血、玻璃体出血、黄斑水肿，眼内炎等并发症较多，而房水的获取简单、可行性高、且抽取后并发症相对较少，因此本研究以房水作为研究对象。目前，检测相关因子的报道主要集中在玻璃体液中，而在房水中的检测报道还非常少，尤其是结缔组织生长因子。有研究发现，采用高敏感度ELISA检测对侧未注射眼的眼内药物浓度，用低敏感度ELISA检测注射眼的眼内药物浓度，两者测量的结果显示注射后第8天血清中bevacizumab达到最大浓度^[11]，因此本试验选择玻璃体腔注药后7 d检测房水。

血管内皮生长因子是重要的促血管生成细胞因子^[12]，血管内皮生长因子过度表达不但能增加血管渗透性，而且直接刺激血管内皮细胞生长和新生血管生成。已有文献证实糖尿病患者玻璃体和血清中血管内皮生长因子水平明显升高^[13]。李巧等^[14]发现房水中的血管内皮生长因子水平随着糖尿病病程的进展而逐渐升高。而安维汀则具有促进新生血管消退、减轻黄斑水肿以及减少血管渗漏的作用^[2-3^，^14]。本文结果证实增殖性糖尿病视网膜病变Ⅳ期患者在玻璃体腔注射安维汀后，房水中血管内皮生长因子水平明显降低，进一步证实安维汀在增殖性糖尿病视网膜病变玻璃体切割术前应用具有抑制新生血管作用，因此安维汀可以作为增殖型糖尿病视网膜病变手术治疗的辅助手段，能有效减少术中出血^[15]，并可以减少术后复发性出血的发生率^[9]。

色素上皮衍生因子是人体内生成量最大的蛋白质之一，它由体内多种组织器官合成与分泌，其中肝脏、脂肪组织是外周血色素上皮衍生因子的主要来源^[16]，在眼部分布在角膜上皮、内皮细胞、晶体上皮细胞、脉络膜、睫状体、感光细胞、神经节细胞层，玻璃体和房水。色素上皮衍生因子是眼内一种具有抑制新生血管生成作用因子，是血管内皮生长因子的对抗因子，在增殖型糖尿病视网膜病变的发生中具有抑制血管新生抗炎抗氧化和营养神经及神经保护的作用^[17-18]。大量研究表明，增殖型糖尿病视网膜病变新生血管形成与血管生成因子和抑制因子二者的失衡有关，表现为血管内皮生长因子水平升高伴随色素上皮衍生因子水平降低。本组结果证实在房水中血管内皮生长因子与色素上皮衍生因子成反向变化，患者眼内血管内皮生长因子和色素上皮衍生因子含量反向改变及比例失调可能与该病引起的新生血管形成有关。Matsuyama等^[19]研究显示血浆色素上皮衍生因子浓度在糖尿病微血管病变(包括糖尿病视网膜病变和糖尿病肾病)时增加，且糖尿病视网膜病变增殖期血浆色素上皮衍生因子浓度较非增殖期明显升高，差异有显著性。同时，如果能够对同一患者在不同病程阶段测量其眼内液(房水及玻璃体液)对预测疗疾病分期有重大意义。本研究证实，安维汀玻璃体腔注射后，房水色素上皮衍生因子浓度升高，证明了安维汀的抑制新生血管的作用不仅仅在于血管内皮生长因子的抑制，而且还表现在对于色素上皮衍生因子分泌的促进。

结缔组织生长因子在正常生理情况的生物学效应主要为促有丝分裂作用、趋化细胞、诱导细胞黏附、促进细胞增生和细胞外基质的合成等^[20]，结缔组织生长因子参与维持人眼部正常组织代谢及功能。在泪液、房水、血液等均有存在^[21-22]，但在病理情况下，过度表达的结缔组织生长因子的可诱发及增加Ⅰ型胶原等的合成，使细胞外基质合成增加，从而导致纤维化。结缔组织生长因子过度表达和翼状胬肉、角膜瘢痕、青光眼、白内障、视网膜、脉络膜及视网膜新生血管等疾病的发生有关。有研究发现，在增殖性糖尿病视网膜病变的发生和发展过程中，结缔组织生长因子促进了新生血管形成及纤维增殖^[23]。糖尿病视网膜病变增殖性视网膜纤维化程度与其结缔组织生长因子水平相关^[24]。Hughes等^[25]检测到结缔组织生长因子在12周的糖尿病大鼠视网膜中表达提高了2倍。Van Geest等^[26]研究发现给增殖性糖尿病性视网膜病变患者玻璃体腔注射安维汀后引起结缔组织生长因子/血管内皮生长因子的比例提高，确认结缔组织生长因子在促纤维化形成中起重要作用，以后的研究有望成为新生血管治疗的新的靶点。

作者的研究在增殖性糖尿病性视网膜病变结果也同样证实了安维汀可以上调房水结缔组织生长因子的表达，这一结果说明了抗血管内皮生长因子治疗同时采取抗纤维化治疗的必要性。本研究也提示在糖尿病视网膜病变患者的房水中结缔组织生长因子浓度高于正常对照组，证实了在糖尿病初期房水结缔组织生长因子浓度高于正常对照组，因此检查结缔组织生长因子的浓度可以监测增殖性糖尿病性视网膜病变中纤维化的进展程度，在预防增殖型糖尿病视网膜病变发生中发挥重要作用。Van Geest等^[26]研究证实安维汀玻璃体腔注射后能够增加视网膜中结缔组织生长因子的表达，促进增殖性糖尿病视网膜病变的发生，发现结缔组织生长因子和血管内皮生长因子间存在一种平衡关系在增殖性糖尿病视网膜病变的前期由血管内皮生长因子促进视网膜新生血管的形成，而在增殖性糖尿病视网膜病变的后期由结缔组织生长因子促进视网膜纤维化增殖，血管内皮生长因子和结缔组织生长因子可能共同参与了视网膜新生血管形成及纤维化，相当于眼内纤维血管化的调控开关。此外，结缔组织生长因子在视网膜前视网膜下脉络膜新生血管膜中和增殖性糖尿病性视网膜病变视网膜前膜中肌纤维母细胞和血管内皮细胞均有表达^[27]，增殖性糖尿病视网膜病变后期将出现纤维增殖膜和新生血管，这与其早期血管病变、各种细胞因子的作用密不可分。近期有研究发现结缔组织生长因子是眼内纤维化的标志物，如在增殖性糖尿病视网膜病变和增殖性玻璃体视网膜疾病中检测意义重大^[28-32]。房水监测简单易行，如果通过检测房水结缔组织生长因子达到预测玻璃液内浓度及视网膜内浓度，进行早期干预，可以有效控制病程进展，防止纤维化发生；而对于安维汀注射后的患者可以监测房水结缔组织生长因子，了解纤维增殖作用的进展以及视网膜增殖的进展情况。

增殖性糖尿病视网膜病变由于其多条致病机制协同作用，单一的治疗方法或是药物在临床应用上的效果不太理想。针对安维汀玻璃体腔注射后的促进纤维增殖作用，若能够应用类似于抗血管内皮生长因子的生物制剂(如贝伐单抗等)的抗结缔组织生长因子制剂，进行双靶点干预治疗也许能够抑制增殖性糖尿病视网膜病变的进展和逆转增殖性糖尿病视网膜病变已形成的新生血管。增殖性糖尿病视网膜病变患者安维汀玻璃体腔注射术后行玻璃体切割术，术后重复注射安维汀时机选择达到抑制新生血管需要进一步研究。由于本研究样本量有限，仅能推测增殖性糖尿病视网膜病变患者和早期糖尿病大鼠玻璃体腔注射安维汀后上述3种细胞因子的质量浓度变化趋势，这种趋势有抑制新生血管生成的作用，同时还有促进纤维增殖的作用，对指导临床选择安维汀玻璃体腔注射手术适应证有一定意义，选择纤维增殖较轻的增殖性糖尿病视网膜病变患者，进行多中心、大样本的随机双盲对照研究为目标，以期待达到抑制新生血管和纤维增殖最终目标。

目前抗纤维化治疗尚在动物实验阶段，待时机成熟可进行双靶点治疗(抗纤维化与抗新生血管)，达到控制病情进展的目的，提高患者的视觉效果和生存质量。

另外，本试验证实，两种不同剂量的安维汀玻璃体腔注射比较，差异无显著性意义，因此推荐使用较小剂量安维汀玻璃体腔注射达到抑制新生血管的作用，减少全身不良反应的发生，节省患者医疗费用支出。

目前，国内外多项临床和动物实验研究证实，玻璃体腔注射抗血管内皮生长因子药物治疗增殖性糖尿病视网膜病变短期有较好的效果，但需要更多的多中心研究机构参与进行其长期疗效和安全性的临床试验验证，关于增殖性糖尿病视网膜病变玻璃体切割术前应用时间、玻璃体腔注射频次、药物的最佳剂量、注射间隔时间、术后用药指征及联合用药方法尚没有统一的标准，期待标准尽快制定，更好的指导临床治疗眼部新生血管性疾病。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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