牙髓细胞成牙本质分化的体外诱导：诱导因子及机制揭示

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.37.027

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究表明牙髓细胞在一定条件下经诱导可以向成牙本质细胞方向分化，该过程由信号网络调控。
目的：综述牙髓细胞向成牙本质细胞方向分化的诱导因子及作用机制的研究进展。
方法：应用计算机检索1998年1月至2014年7月中国知网(CNKI)和万方数据库相关文献，检索词“牙髓细胞，成牙本质细胞分化”限定文献语言种类为中文。同时计算机检索同期PubMed数据库相关文献，检索词“dental pulp cells，odontoblastic differentiation”，限定文献种类为英文。初检所得文献467篇。包括中文214篇，英文253篇。对于初检文献，阅读标题和摘要进行初筛，排除因研究目的与本研究无关者或内容重复性的研究，最终纳入63篇文章进行综述。
结果与结论：不同的诱导因子可以作为调控器，文章系统归纳了牙髓细胞在不同的诱导因子作用下，例如：骨形态发生蛋白、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸及多种生长因子等，通过相关信号通路信号转导在一定程度上参与牙髓细胞向成牙本质细胞分化定向诱导。但成牙本质细胞分化是一个复杂的过程，进一步从细胞及分子水平研究成牙本质分化诱导因子及相关机制对于牙齿再生治疗临床应用具有重要意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 诱导, 牙髓细胞, 成牙本质细胞分化, 信号转导

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that dental pulp cells can differentiate into odontoblastic like cells under certain stimulations, which is regulated by several signal pathways network.
OBJECTIVE: To summarize the research progress of stimulating molecules and underlying molecular mechanisms of dental pulp cells’ odontoblastic differentiation.
METHODS: A computer-based online search of CNKI and Wanfang databases was undertaken for the related Chinese articles dated from January 1998 to July 2014 with the keywords of “dental pulp cells” and “odontoblastic differentiation” in Chinese. Meanwhile, PubMed database was searched for the related English articles dated from January 1998 to July 2014 with the same keywords in English. Those with unrelated research subjects, or repetitive studies were excluded. Finally, 63 articles were reviewed.
RESULTS AND CONCLUSION: Various stimuli, including bone morphogenetic protein, β-glycerophosphate and ascorbic acid, can stimulate dental pulp cells differentiation into odontoblastic like cells under certain conditions regulated by several signal pathways network. But odontoblastic differentiation is a complex process, and further research into stimulating molecules and underlying molecular mechanisms of dental pulp cells’ odontoblastic differentiation is significantly important for clinical applications of dental regenerative therapy.

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Key words: dental pulp, odontoblasts, signal transduction

中图分类号:

R318

邹慧儒，Steven Brookes，Xuebin Yang. 牙髓细胞成牙本质分化的体外诱导：诱导因子及机制揭示[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(37): 6051-608.

Zou Hui-ru, Steven Brookes, Yang Xue-bin. Odontoblastic differentiation of dental pulp cells in vitro: odontogenic stimuli and the underlying mechanisms[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(37): 6051-608.

图/表（结果） 1

2.1 文献检索结果及质量评价 初检所得文献467篇。包括中文214篇，英文253篇。对于初检文献，阅读标题和摘要进行初筛，排除因研究目的与本研究无关者或内容重复性的研究，最终纳入63篇文章进行综述。符合纳入标准的63篇文献中，文献[1-8]探讨了转化生长因子β在牙髓细胞向成牙本质细胞方向分化过程中的作用及可能机制的相关研究进展，文献[9-16]探讨了骨形态发生蛋白2诱导牙髓细胞向成牙本质细胞方向分化的相关研究进展，文献[17-24]探讨了β-catenin 与Wnt/β-catenin信号通路在成牙本质细胞分化中的可能作用，文献[25-26]列举了矿化诱导液用于牙髓细胞矿化诱导方面的研究成果，文献[27-34]归纳了无机三氧化聚合物、Biodentine、Bioaggregate以及iRoot用于牙髓细胞分化诱导的研究报道，文献[35-44]分析了釉基质蛋白及其组成成分与其他基质类物质对成牙本质分化的诱导作用，文献[45-63]则就上述文中未提到的体外诱导牙髓细胞成牙本质分化的诱导因子及机制研究进行分析归纳。

2.2 综述情况 牙髓细胞在体内生理状况下，处于牙髓组织特殊的微环境中，能保持干细胞未分化状态，具备分化形成多种细胞的特性和功能。在某些炎症刺激或其他病理情况下，牙髓细胞可能向成牙本质细胞方向分化。众多研究表明，体外培养条件下不同的诱导因子，例如：转化生长因子β、骨形态发生蛋白、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸及其他诱导因子等可以作为调控器，通过相关信号通路信号转导在一定程度上参与成牙本质细胞分化定向诱导。

2.2.1 转化生长因子β与Smad信号通路 转化生长因子β是一类具有多种生物学活性的细胞因子，对细胞增殖、迁移、分化和凋亡等都有重要的调节作用。作为牙胚上皮-间充质之间相互作用的一种信号分子，转化生长因子β通过调节细胞核内转录因子、细胞黏附因子等活性水平参与调控细胞增殖、分化与牙齿发育。转化生长因子β1 在成体牙髓中能诱导成牙本质前体细胞分化和牙本质基质分泌，下调与牙本质矿化相关的细胞外基质蛋白的基因表达，促进牙髓-牙本质复合体形成^[1]。转化生长因子β1、转化生长因子β3 单独或与其他细胞因子协同作用可调节牙髓或前体细胞的增殖、迁移和分化，参与牙本质-牙髓复合体和修复性牙本质的形成^[2-4]。

聂鑫等^[5]将人第3磨牙牙髓组织剪碎，与牙本质陶瓷粉及2 mg/L转化生长因子β1混合，将该混合物以骨基质明胶为载体置于不锈钢金属网架上，成功构建牙髓组织体外培养模型，发现转化生长因子β1可明显促进牙髓细胞向成牙本质细胞的分化诱导潜能，并形成骨-成牙本质样组织。众多研究表明转化生长因子β可以作为一种成熟的诱导因子用于牙髓细胞向成牙本质细胞方向定向分化。

有关其作用机制，目前公认的是转化生长因子β可以结合到细胞表面的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶受体从而激活其受体，通过Smad信号通路或其它信号通路将信号转导至细胞内发挥作用。Smad信号分子包括9个成员，其中Smad2、Smad3是转化生长因子β在细胞内特异的信号转导分子。转化生长因子β与细胞表面受体结合，使Smad2、Smad3磷酸化，形成异源寡聚物，核转位后识别c-Jun等基因启动子的相关序列，启动其表达，进而调控成牙本质相关基因表达。包柳郁等^[6]通过激光共聚焦显微镜观察转化生长因子β1刺激初期牙髓细胞内Smad 2、3由胞质向胞核转位的现象，同时采用蛋白免疫印迹方法检测刺激后期Smad 2、3蛋白表达情况，发现转化生长因子β1刺激初期Smad 2、3通过发生核转位参与转导转化生长因子β1信号至胞核内，而刺激后期Smad 3表达水平的下调可能与转化生长因子β1负反馈调节有关。

之后，包柳郁等^[7]将转化生长因子β3作用于牙髓细胞，与空白对照组相比，牙髓细胞内Smad 3在转化生长因子β3刺激后6，12 h，其蛋白表达量无明显变化，而在刺激后24 h表达量明显下降，刺激48 h后表达十分微弱，Smad 2在空白对照组以及刺激后各时间组蛋白表达量无显著变化。该研究表明转化生长因子β3对Smad2、Smad 3二者表达的调控方式有所不同。Lee等^[8]研究发现转化生长因子β1通过蛋白酶解通路诱导核转录因子(Nuclear factor I-C，NFI-C)的降解，转化生长因子β1信号分子的激活通过降解NFI-C蛋白而非抑制NFI-C蛋白转录导致NFI-C蛋白水平降低。过表达Smad2或Smad3均可导致内源性NFI-C蛋白降解。Smad3敲除后，转化生长因子β1不再影响NFI-C蛋白的降解。该研究提出转化生长因子β1通过Smad信号通路增加p21和转化生长因子β应答基因的表达水平以及NFI-C蛋白的降解，从而抑制p21表达，诱导牙髓细胞发生成牙本质细胞分化。

2.2.2 骨形态发生蛋白2与Smad、丝裂原活化蛋白激酶信号通路 骨形态发生蛋白2是一种多功能的生长因子，属于转化生长因子β超家族，在细胞生长、分化、凋亡和机体各种组织及器官发育过程中起重要调节作用。骨形态发生蛋白2可体外诱导人牙髓细胞向成牙本质细胞分化^[9]。利用腺病毒载体诱导牙髓细胞产生骨形态发生蛋白7，发现可以明显增加牙髓细胞碱性磷酸酶活性，诱导牙本质涎磷蛋白表达，形成骨样牙本质。以骨形态发生蛋白2诱导牙髓细胞，观察到相似的结果。将转染的细胞接种于三维支架材料上，观察到明显的硬组织形成^[10-11]。

骨形态发生蛋白相关信号通路研究近年来开展的较多。Qin等^[12]研究骨形态发生蛋白/Smad通路在成牙本质细胞分化中的可能作用，发现骨形态发生蛋白2可诱导牙髓细胞Smad 1/5的磷酸化以及核转位。此外，骨形态发生蛋白2信号抑制剂noggin可显著抑制骨形态发生蛋白2诱导的牙髓细胞的碱性磷酸酶活性和成牙本质细胞分化，降低矿化结节形成。结果提示Smad 1/5与骨形态发生蛋白2诱导成牙本质细胞分化有关^[12]。小异源二聚体与许多转录因子例如Runx2互相作用，调控细胞增殖、分化、能量代谢等。研究显示小异源二聚体可能介导骨形态发生蛋白2信号通路，促进牙本质基质矿化^[13]。

丝裂原活化蛋白激酶是细胞内执行信号级联放大的一类蛋白质，该家族可以在一系列刺激因素作用下参与信号转导，调控细胞行为。作为该家族的四大亚家族之一，P38亚族在许多调控行为中发挥重要作用。P38 丝裂原活化蛋白激酶途径可由多种诱导因子刺激细胞发生蛋白磷酸化级联反应而激活，从而调节细胞增殖、分化、炎症反应甚至凋亡等。第一个发现的P38成员是p38α。Qin等^[14]通过构建重组反转录病毒shRNA干扰p38α 丝裂原活化蛋白激酶编码，研究p38α丝裂原活化蛋白激酶在骨形态发生蛋白2诱导成牙本质细胞分化中的可能作用。结果显示骨形态发生蛋白2上调人牙髓细胞p38α磷酸化，呈剂量和时间依赖性。与对照组相比，p38α丝裂原活化蛋白激酶基因敲除组人牙髓细胞的碱性磷酸酶活性及矿化结节形成显著抑制。此外，抑制p38α丝裂原活化蛋白激酶可以抑制人牙髓细胞的成牙本质细胞分化。该研究提出p38α丝裂原活化蛋白激酶参与骨形态发生蛋白2诱导人牙髓细胞的成牙本质细胞分化。付蕾等^[15]通过观察p38 丝裂原活化蛋白激酶抑制剂SB203580对人牙髓细胞矿化相关基因表达和矿化能力的影响，发现p38丝裂原活化蛋白激酶抑制剂SB203580具有抑制人牙髓细胞分化和矿化的作用，同样证实了p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路可能参与牙髓细胞向成牙本质细胞分化这一推论。

信号通路之间的交互作用在细胞调控中经常发生。例如，P38信号通路对ERK1/2通路具有抑制作用，P38与Jun 氨基末端激酶(Jun N-terminal kinase，JNK)的上游有很多相同的调节因子，可以被某些刺激因子共同激活，在下游两者也有重叠的地方，例如都可以激活AP-1的转录活性。Qin等^[16]研究发现骨形态发生蛋白2上调牙髓细胞中的JNK磷酸化，呈剂量和时间依赖性。成牙本质细胞分化的早期标志物，包括细胞碱性磷酸酶活性，骨桥蛋白和牙本质基质蛋白1表达不受JNK抑制剂SP600125的抑制。但是，JNK抑制剂对成牙本质细胞分化的晚期标记物，包括骨钙素、牙本质涎磷蛋白和骨涎蛋白的基因表达有明显的抑制作用，同时也降低了骨形态发生蛋白2诱导后的牙髓细胞矿化结节的形成。JNK 丝裂原活化蛋白激酶沉默减少了后期的成牙本质细胞分化。该结果表明JNK的活性是骨形态发生蛋白2诱导的成牙本质细胞分化晚期必需的。

2.2.3 β-catenin与Wnt/β-catenin信号通路 β-catenin最早作为一种黏附因子被发现，后来研究发现它还是一种多功能的蛋白质。β-catenin广泛存在于各种类型的细胞，如内皮细胞、成纤维细胞、成骨细胞、成牙本质细胞中，在细胞黏附、增殖、分化和凋亡等方面发挥重要调节作用。Kim等^[17]研究表明β-catenin在成牙本质细胞中强表达，在牙根形成中发挥重要作用。在发育中的成牙本质细胞中特异性失活β-catenin可导致形成的磨牙缺少牙根，切牙异常菲薄。Han等^[18]观察到β-catenin在直接盖髓术后修复性牙本质形成过程中露髓部位下方的成牙本质细胞样细胞和牙髓细胞中均有表达。体外培养的牙髓细胞向成牙本质方向分化过程中β-catenin的表达也显著上调。Runx2呈现与β-catenin相似的表达模式。免疫荧光染色结果表明，修复性牙本质形成过程中β-catenin表达阳性的成牙本质细胞样细胞和牙髓细胞Runx2表达也呈现阳性。β-catenin敲除可影响β-catenin与Runx2启动子的结合，减少Runx2的表达，打乱成牙本质细胞分化。相反，氯化锂(LiCl)诱导β-catenin积累产生与β-catenin敲除相反的效果。β-catenin可以通过激活Runx2增强成牙本质细胞分化，由此推测这可能是修复性牙本质形成过程中成牙本质细胞分化的机制。

β-catenin在经典Wnt信号通路作用于牙齿发育和干细胞自我更新中发挥至关重要的作用。Scheller等^[19]研究发现通过反转录病毒介导稳定转导典型Wnt-1或β-catenin活性形式的牙髓细胞细胞外骨桥蛋白表达显著升高，COL-1表达轻微升高，但是碱性磷酸酶活性及矿化结节形成显著降低。此外，过表达β-catenin也足以抑制大鼠牙髓干细胞的分化和矿化。由此该研究认为经典Wnt信号通路对牙髓干细胞的成牙本质细胞分化呈负调控。

Chen等^[20]研究发现在发育中的牙间充质细胞组织特异性失活β-catenin可导致细胞自主性丧失Lef1 mRNA的表达，但不影响骨形态发生蛋白4的表达。而在β-catenin介导的经典Wnt信号缺失情况下，骨形态发生蛋白4不足以维持牙间充质细胞中Lef1的表达。上述数据表明，在发育中的牙间充质细胞中Lef1 mRNA的表达直接受到Wnt /β-catenin信号调节，提示Wnt/ β-catenin信号在牙齿发育早期间充质细胞活化方面发挥重要作用。

有研究通过检测牙髓细胞向成牙本质细胞方向分化过程中的相关基因与microRNA表达，推测上述靶基因的不同表达情况与不同的生物学功能与丝裂原活化蛋白激酶和Wnt信号通路相关^[21-22]。Kim等^[23]通过观察MDPC-23细胞向成牙本质细胞分化过程中miR-663表达显著增高，对miR-663靶基因的预测显示，adenomatous polyposis coli (APC)基因与miR-663有一个结合位点在其3’-非翻译区(UTR)，该基因与Wnt/ β-catenin信号通路相关。APC的表达被miR-663显著抑制，而APC表达下调通过β-catenin在细胞核内聚集激活Wnt /β-catenin信号通路。该研究认为，miR-663通过靶向介导APC激活Wnt /β-catenin信号通路，从而促进MDPC-23细胞分化为成牙本质细胞。

在牙髓组织修复过程中，人牙髓细胞迁移到损伤部位，分化为成牙本质样细胞。在牙齿发育过程中，Wnt6可以激活非经典信号途径例如c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)通路。Li等^[24]研究发现Wnt6可以激活人牙髓细胞的JNK通路，促进细胞迁移、矿化结节的形成和碱性磷酸酶活性。Wnt6也增加Runx2、牙本质涎磷蛋白、牙本质基质蛋白mRNA的表达。阻断牙髓细胞的JNK通路可以导致Wnt6诱导产生的细胞迁移和分化能力降低，但不能完全消除该作用。该研究结果提示Wnt6可以激活人牙髓细胞JNK信号通路从而导致细胞迁移和分化。

2.2.4 矿化诱导液 大量研究表明，矿化诱导液可以诱导牙髓细胞发生成牙本质细胞分化。目前用于牙髓干细胞矿化诱导的矿化液种类较多，最常用的是含一定比例的地塞米松、抗坏血酸及β-甘油磷酸钠的培养液。其中地塞米松对成骨及成牙本质分化均有明显促进作用，抗坏血酸则广泛参与细胞增殖、分化等多项活动，β-甘油磷酸钠则可以为矿化提供必须的磷酸根离子。有研究采用含一定浓度的β-甘油磷酸钠、抗坏血酸和地塞米松的矿化液诱导人牙髓干细胞，通过倒置相差显微镜、透射电镜、免疫细胞化学染色、vonKossa染色方法，观察和检测矿化液诱导后细胞形态、超微结构、表型和矿化基质分泌的变化，以未诱导组为对照。经矿化液连续培养7 d，人牙髓干细胞细胞形态明显改变，呈成牙本质样细胞极化表现；超微结构观察显示诱导后的细胞体积增大，核浆比例下降，胞浆细胞器丰富；诱导前细胞不表达牙本质涎磷蛋白和骨钙素，诱导后均表达；连续培养21 d，诱导组细胞形成多个矿化结节。该研究结果提示矿化液能诱导人牙髓干细胞向成牙本质细胞样细胞分化并产生矿化基质^[25]。近来有研究将KH₂PO₄作为矿化液的常规添加成分，更加经济方便有效提供矿化所需的磷酸根离子，与矿化诱导液的其他成分共同作用发挥矿化诱导作用^[26]。但矿化液中各组成成分矿化诱导具体作用机制仍有待进一步阐明。

2.2.5 无机三氧化聚合物、Biodentine、Bioaggregate以及iRoot 无机三氧化聚合物可诱导牙髓细胞分化为成牙本质细胞，形成牙本质样矿化结构^[27-28]。Woo等^[29]研究发现1 g/L的无机三氧化聚合物可以显著上调牙本质涎磷蛋白、牙本质基质蛋白1表达水平，促进矿化结节形成。硝苯地平可以抑制无机三氧化聚合物诱导的牙髓细胞成牙本质分化作用。细胞外信号调控激酶(Extracellular signal-regulated kinase, ERK)、p38和JNK抑制剂U0126，SB203580和SP600125可以阻断无机三氧化聚合物的诱导效果。该研究显示无机三氧化聚合物中的钙离子释放在牙髓细胞成牙本质细胞分化中发挥重要作用，该过程通过ERK和JNK活化调控。

Jung等^[30]对Biodentine、Bioaggregate以及无机三氧化聚合物作用于人牙髓细胞的矿化诱导能力进行了比较并探讨其可能的信号转导通路，发现三者在细胞活性方面非常相似，与空白对照组相比都能上调牙本质涎磷蛋白、牙本质基质蛋白1 mRNA的表达，促进矿化结节形成，ERK、p38和JNK磷酸化。丝裂原活化蛋白激酶抑制剂可以抑制三者诱导牙髓细胞形成矿化结节的能力。上述3种材料都通过激活丝裂原活化蛋白激酶通路诱导成牙本质分化和矿化结节形成，表明Biodentine和Bioaggregate作为新型材料，可以用于牙髓再生治疗，与以往研究结果相符^[31-32]。Luo等^[33]研究发现Biodentine通过丝裂原活化蛋白激酶和钙/钙调蛋白依赖的蛋白激酶II途径促进牙髓细胞分化。Zhang等^[34]将牙髓细胞分别接种于BioAggregate、iRoot BP Plus和无机三氧化聚合物，比较了细胞增殖以及分化诱导情况，发现上述材料均没有细胞毒性，可以诱导成牙本质分化及矿化形成。

2.2.6 釉基质蛋白、釉原蛋白以及牙本质基质蛋白 釉基质蛋白可以促进牙髓细胞增殖，提高牙髓细胞碱性磷酸酶活性及钙盐沉积，上调碱性磷酸酶、骨桥蛋白、牙本质涎磷蛋白、骨涎蛋白以及骨形态发生蛋白表达水平。此外，还上调成牙本质相关转录因子Osterix和Runx2表达水平^[35-37]。也有研究联合釉基质蛋白与无机三氧化聚合物或辛伐他汀作用于牙髓细胞，均观察到良好的成牙本质分化诱导效果^[38-39]。作为釉基质蛋白的主要成分，釉原蛋白诱导牙髓细胞向成牙本质细胞方向分化的研究也多有报道。张艺文等^[40]取6月龄猪第2磨牙牙胚牙釉质，用液相色谱法分离纯化低分子猪釉原蛋白(LMWPA)，并观察其对人牙髓细胞和牙周膜细胞增殖及碱性磷酸酶活性的影响。结果发现LMWPA在50和100 mg/L时能显著促进牙髓细胞和牙周膜细胞的增殖，且碱性磷酸酶活性上调(P < 0.01)；而在≥150 mg/L时则显著抑制细胞的增殖，碱性磷酸酶活性下调(P < 0.01)。该研究表明LMWPA影响HDPCs和HPLCs的增殖和碱性磷酸酶活性。也有研究观察釉原蛋白的不同裂解产物对成牙本质分化的不同作用，发现含外显子8和9片段的富含亮氨酸的釉原蛋白多肽与不含外显子8和9片段的多肽相比，可以显著促进牙髓细胞增殖分化，促进修复性牙本质形成。提示釉原蛋白外显子8和9在牙髓再生修复中可能发挥重要作用^[41]。

此外，牙本质基质蛋白牙本质基质蛋白1在牙胚发育过程中具有诱导成牙本质细胞分化，促进细胞分泌基质，启动牙本质矿化等作用，还可以作为细胞间信号分子发挥作用^[42]。牙本质基质物质以及细胞基质物质在牙髓损伤修复、牙本质再生方面也显示出广泛的应用前景^[43-44]。但其作用受多种细胞因子、酶等因素综合调控，具体作用机制仍待进一步研究证实。

2.2.7 其他方面 有研究报道人牙髓细胞成牙本质分化过程中胸腺素β4 mRNA和蛋白表达上调。胸腺素β4 siRNA转染可通过降低碱性磷酸酶活性、分化标志物mRNA表达和钙结节形成降低成牙本质诱导液诱导成牙本质细胞分化效果。而胸腺素β4 激活可以通过增强p38、JNK、ERK 丝裂原活化蛋白激酶，骨形态发生蛋白2，骨形态发生蛋白4、Smad1/5/8和Smad2/3的磷酸化以及转录因子Runx2和Osterix的表达促进成牙本质细胞分化。该研究表明，胸腺素β4在人牙髓细胞成牙本质细胞分化中发挥重要作用，胸腺素β4活化可能在牙髓再生中具有关键作用^[45]。

血红素加氧酶1活性与干细胞分化相关。Kim等^[46]研究发现钴原卟啉作用后的牙髓细胞生成血红素加氧酶1，促进细胞生长和矿化形成，增加成牙本质细胞相关标记物碱性磷酸酶、骨桥蛋白、骨涎蛋白、牙本质基质蛋白1和牙本质涎磷蛋白 mRNA的表达, 血红素加氧酶1抑制剂可抑制牙髓细胞生长和分化。该研究推测药物性介入血红素加氧酶1有望做为牙髓盖髓及牙髓再生的一种有效的治疗方法。有研究表明机械应力可显著增加人牙髓细胞血红素加氧酶1，骨涎蛋白，骨桥蛋白，牙本质涎磷蛋白以及牙本质基质蛋白1 mRNAs的表达。血红素加氧酶1基因沉默以及应用血红素加氧酶1、ERK、p38 丝裂原活化蛋白激酶，磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphoinositide 3-kinase)或核转录因子κB抑制剂均可以抑制机械应力诱导的牙髓细胞分化。机械应力诱导的相关因子(NE-E2-related factor-2，Nrf2)核转位可以被PI3K和核转录因子κB抑制剂抑制。上述研究结果表明机械应力诱导牙髓细胞向成牙本质细胞分化可能通过机械应力诱导的相关因子介导血红素加氧酶1 通路进行调控^[47]。

Lee等^[48]研究茯苓酸是否影响牙髓炎症并通过血红素加氧酶1基因表达促进牙齿发育。研究发现过氧化氢可以导致牙髓炎症，并扰乱成牙本质细胞分化。但是，茯苓酸作用后可通过增加血红素加氧酶1表达发挥抗炎作用和成牙本质细胞诱导分化作用。此外，茯苓酸对过氧化氢处理的牙髓细胞有较强的保护作用和矿化作用。茯苓酸显著抑制核转录因子κB进入细胞核并诱导Nrf2进入细胞核。核转录因子κB和Nrf2易位由血红素加氧酶1通路调节。茯苓酸通过血红素加氧酶1通路发挥抗炎作用和成牙本质细胞分化诱导作用。结果表明，茯苓酸可以应用于口腔炎症的预防或改善应力作用下的牙本质矿化。

谷氨酰胺可以促进不同类型细胞的有丝分裂，有研究表明谷氨酰胺可以促进牙髓细胞的增殖、迁移、碱性磷酸酶活性、矿化结节形成以及成牙本质细胞标志物mRNA的表达，上述作用呈剂量依赖性。谷氨酰胺还可以上调白细胞介素6、白细胞介素8、MCP-1、MIP- 3α、CCL2、CCL20和CXCL1的表达。谷氨酰胺增加骨形态发生蛋白2和骨形态发生蛋白4基因的表达以及Smad 1/5/8磷酸化，增加β-catenin和Wnt信号通路的关键蛋白的表达。此外，谷氨酰胺还可以上调p38和JNK的表达。此外，noggin、DKK1以及p38，JNK，ERK的抑制剂均能显著抑制谷氨酰胺的诱导作用。该研究表明谷氨酰胺可能通过骨形态发生蛋白2、Wnt以及丝裂原活化蛋白激酶信号通路调控作用促进牙髓细胞增殖、迁移及成牙本质分化^[49]。

ATF6是一种内质网膜结合转录因子，可以调控多种细胞功能。在磨牙牙胚成牙本质细胞层观察到ATF6表达，并且ATF6、牙本质涎磷蛋白和牙本质基质蛋白1表达量随着牙胚的发育逐渐增加。诱导液体外培养的牙髓细胞，ATF6、牙本质涎磷蛋白以及牙本质基质蛋白1表达随着未折叠蛋白反应标记物增加而增加。ATF6过表达促进体外培养的牙髓细胞牙本质涎磷蛋白、牙本质基质蛋白1表达以及碱性磷酸酶活性和矿化形成。ATF6抑制可以降低碱性磷酸酶活性和矿化形成。上述结果提示ATF6可能参与成牙本质细胞分化^[50]。

最近，有研究表明PIN1，一种肽基脯氨酰顺反异构酶，也参与人牙髓干细胞的成牙本质分化以及成脂分化^[51]。作为一种凋亡转录因子，DDIT3不仅在炎症反应以及成骨分化中具有至关重要的作用，还同样参与成牙本质分化^[52]。除此以外，还有报道SIRT6在牙髓组织和牙髓细胞内表达，SIRT6参与牙髓细胞成牙本质分化与矿化^[53]。还有研究发现高迁移率族蛋白1在人牙髓组织和牙髓细胞的胞核内表达，在成牙本质分化过程中，高迁移率族蛋白1从胞核内转移到胞浆，之后分泌出细胞体外。外源性高迁移率族蛋白1可以促进牙髓细胞增殖和矿化结节的形成，上调成牙本质相关蛋白表达水平^[54]。

Krüppel-like factor 4(KLF4) 在细胞分化和增殖方面具有非常重要的作用。有研究显示KLF4特定表达于极化伸长的成牙本质细胞，能够抑制牙髓细胞增殖，促进成牙本质分化^[55]。

细胞外基质磷酸化糖蛋白又名成骨细胞/骨细胞因子-45(Osteoblast/osteocyte factor 45，OF-45)，细胞外基质磷酸化糖蛋白属于小整合素结合配体N连接的糖蛋白(Small integrin-binding ligand with N-linked glycoprotein, SIBLING)的远端家族，与骨骼和牙齿的形成和发育关系密切。在牙齿组织中，细胞外基质磷酸化糖蛋白主要表达于成牙本质细胞，并与釉质发育不全、Ⅱ和Ⅲ型牙本质发育不全有关。细胞外基质磷酸化糖蛋白基因水平随着牙髓细胞的诱导分化表达上调，与牙本质涎磷蛋白、骨涎蛋白、COL-1mRNA表达具有相似的变化趋势，通过外源性细胞外基质磷酸化糖蛋白刺激牙髓细胞及基因转染模型，发现细胞外基质磷酸化糖蛋白可能通过某些信号转导途径正向调节牙髓细胞的增殖分化和牙髓-牙本质复合体的修复再生。细胞外基质磷酸化糖蛋白在细胞增殖和早期基质成熟阶段大量表达，在矿化阶段表达则受到抑制，由此推测细胞外基质磷酸化糖蛋白可能是牙髓细胞向成牙本质细胞分化的早期标记物之一^[56-58]。王文静等^[59]通过研究细胞外基质磷酸化糖蛋白基因沉默对牙髓细胞增殖和成牙本质分化能力的影响，发现细胞外基质磷酸化糖蛋白可能通过与细胞外基质胶原蛋白以及非胶原蛋白相互作用，共同调节牙髓损伤修复，但其具体作用机制仍需深入研究。

除了上述文中提到的信号通路，Notch信号通路在牙齿发育与细胞分化方面同样发挥重要作用。Zhang等^[60]研究发现过表达Notch配体Jagged-1可以激活牙髓细胞的Notch信号通路。体外实验证实Jagged-1抑制牙髓细胞成牙本质细胞分化。动物实验证实表达Jagged-1的牙髓细胞不能在体内形成矿化组织。此外，组成性激活Notch1胞内结构域(Notch-ICD)的过表达也抑制牙髓细胞向成牙本质细胞方向分化。该研究结果表明Notch信号途径可以抑制牙髓细胞成牙本质细胞分化。作为细胞间相互作用的一种主要通路，Notch-Delta信号途径是调控细胞增殖和分化最重要的保守性信号途径之一，参与调控多种干细胞分化方向。何飞等体外实验发现，Notch 配体Delta-1基因转染的牙髓细胞增殖活性显著提高，向成牙本质细胞分化的时间明显提前^[61-62]。Notch-Delta 途径与骨形态发生蛋白信号之间存在着直接的相互作用，它们或协同或拮抗，共同控制了多种干细胞的增殖和分化。Wang等^[63]通过慢病毒介导的Delta1-RNA干扰进行牙髓细胞的Notch配体Delta1基因敲除，观察到牙髓细胞生长速率显著抑制，向成牙本质细胞分化的能力显著增强。该研究表明Notch信号途径在牙髓细胞自我更新和分化的调控方面发挥关键作用。提示Delta1-RNA干扰的牙髓细胞有望作为种子细胞用于牙齿组织工程与干细胞治疗。

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