比较3种形态学方法观察成骨细胞矿化结节的应用价值

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.33.003

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (33): 5266-5270.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.33.003

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比较3种形态学方法观察成骨细胞矿化结节的应用价值

廖乃顺^1，2，3，李钻芳^1，2，3，林如辉^1，2，3，陈文列^1，2，3，黄云梅^1，2，3，黄美雅^1，2，3

福建中医药大学，¹福建中西医结合研究院，²福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，³国家中医药三级科研实验室-中药药理(细胞结构与功能)实验室，福建省福州市 350122

出版日期:2014-08-13 发布日期:2014-08-13
通讯作者: 陈文列，研究员，硕士生导师，福建中医药大学，福建中西医结合研究院，福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，国家中医药三级科研实验室-中药药理(细胞结构与功能)实验室，福建省福州市 350122
作者简介:廖乃顺，男，1988年生，汉族，福建省大田县人，2013年福建中医药大学毕业，硕士，研究实习员，主要从事中西医结合基础研究。
基金资助:
基金资助：
福建省科技重大项目(2012Y4006)；福建省自然科学基金(2014J01356)；陈可冀中西医结合发展基金(CKJ2011004)；国家自然科学基金(81202712)

Comparison of three morphology methods for observing mineralization nodules of osteoblasts

Liao Nai-shun^{1, 2, 3}, Li Zuan-fang ^{1, 2, 3}, Lin Ru-hui ^{1, 2, 3}, Chen Wen-lie^{1, 2, 3}, Huang Yun-mei ^{1, 2, 3},Huang Mei-ya ^{1, 2, 3}

¹ Fujian Academy of Integrative Medicine,²Fujian Key Laboratory of Integrative Medicine on Geriatrics,³ National Laboratory of Traditional Chinese Medicine-Pharmacology (Cell Structure and Function), Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China

Online:2014-08-13 Published:2014-08-13
Contact: Chen Wen-lie, Research, Master’s supervisor, 1Fujian Academy of Integrative Medicine, 2Fujian Key Laboratory of Integrative Medicine on Geriatrics, 3National Laboratory of Traditional Chinese Medicine- Pharmacology (Cell Structure and Function), Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China
About author:Liao Nai-shun, Master, Research interns, 1Fujian Academy of Integrative Medicine, 2Fujian Key Laboratory of Integrative Medicine on Geriatrics, 3National Laboratory of Traditional Chinese Medicine- Pharmacology (Cell Structure and Function), Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China
Supported by:
Chen Keji Development Fund for Integrative Medicine, No. CKJ2011004; the Natural Science Foundation of Fujian Province, No. 2014J01356; the National Natural Science Foundation of China, No. 81202712; Key Project of Fujian Province Department of Science and Technology, No. 2012Y4006

摘要/Abstract

摘要：

背景：矿化结节是成骨细胞分化成熟的标志，以往观察方法多采用茜素红等特殊染色法。
目的：比较茜素红染色-光镜、四环素荧光标记-激光扫描共聚焦显微镜、扫描电镜3种形态学观察成骨细胞矿化结节的方法，分析各自的特点及在骨病研究中的应用价值。
方法：将大鼠成骨细胞株UMR-106正常培养、每天换液，连续培养14 d，分别采用茜素红染色-光镜、四环素荧光标记-激光扫描共聚焦显微镜、扫描电镜观察矿化结节的形态结构，并利用扫描电镜结合能谱仪原位定量分析钙元素；此外，在培养中加入可抑制成骨细胞增殖、分化的肿瘤坏死因子α作为对照实验。
结果与结论：3种观察方法均可观察到正常成骨细胞矿化结节的形态结构。对于肿瘤坏死因子α抑制成骨细胞产生矿化结节的情况，经茜素红染色-光镜观察法，未见明显的矿化结节；而四环素荧光染色-激光扫描共聚焦显微镜观察法，可见清晰、稀少的矿化结节；扫描电镜观察法明显可见较少而细小的矿化结节，提示后二种方法灵敏度较高。此外，扫描电镜可将观察成骨细胞分泌钙质、形成矿化结节的亚细胞结构，与能谱元素分析结合，可实现矿化结节的定位与定量，在骨病研究中值得推广应用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 成骨细胞, 矿化结节, 扫描电镜术, 能谱分析, 激光扫描共聚焦显微镜术, 四环素染色, 茜素红染色, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Mineralized nodules are the mature marker of osteoblast differentiation, and the observation methods mainly use alizarin red staining.
OBJECTIVE: To compare the observation results of mineralized nodules by three methods, and to explore their characteristics and advantages, as well as further application in the research of bone disease.
METHODS: The rat osteoblast-like cell line UMR-106 were cultured in the fresh medium that was changed every day, for 14 days. Alizarin red staining-light microscope, tetracycline fluorescence labeling-laser confocal scanning microscopy, and scanning electron microscopy were used to observe mineralized nodules. The calcium content of mineralized nodules was quantified using scanning electron microscopy and energy dispersive spectroscopy. In addition, tumor necrosis factor alpha that could inhibit the proliferation and differentiation of osteoblasts was used as the control.
RESULTS AND CONCLUSION: The three morphology methods could be used to observe the mineralized nodules of normal osteoblasts. As for tumor necrosis factor alpha, no mineralized nodules of osteoblasts were observed by alizarin red staining-light microscopy; small mineralized nodules were observed by tetracycline staining-laser scanning confocal microscopy and scanning electron microscopy, suggesting tetracycline staining and scanning electron microscopy were more sensitive in the observation. Scanning electron microscopy could be used to observe the submicroscopic structures of mineralized nodules in the osteoblasts, and the formation of mineralized nodules, including the calcium secretion. Additionally, scanning electron microscopy combined with energy dispersive spectroscopy analysis can successfully quantify and position the mineralized nodules, indicating a potential application in the research of bone diseases.

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Key words: osteoblasts, tumor necrosis factor-alphavcalcification, physiologic

中图分类号:

R318

廖乃顺，李钻芳，林如辉，陈文列，黄云梅，黄美雅. 比较3种形态学方法观察成骨细胞矿化结节的应用价值[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(33): 5266-5270.

Liao Nai-shun, Li Zuan-fang, Lin Ru-hui, Chen Wen-lie, Huang Yun-mei. Comparison of three morphology methods for observing mineralization nodules of osteoblasts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(33): 5266-5270.

图/表（结果） 5

参考文献

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引言

骨代谢是破骨细胞骨吸收与成骨细胞骨形成的动态平衡过程。成骨细胞负责骨基质的合成、分泌、矿化，是骨重建激活或终止的控制者^[1]，它在骨组织的创伤修复、骨组织的生长发育、骨量平衡中起着重要作用，是骨质疏松、骨折等骨病研究的主要焦点^[2-4]。在生物医学材料研究中(如生物材料与成骨细胞的相互作用^[5-7])，成骨细胞是目前骨组织工程研究的热点。此外，由于成骨细胞起源于中胚层的间充质干细胞，成骨细胞也是目前干细胞(如胚胎干细胞、间充质干细胞等)多向分化性(向成骨细胞分化)研究的主要对象^[8-12]。成骨细胞分化是其主导骨形成的前提与基础。在成骨分化过程中，其最基本的生物学特征是骨基质合成、分泌、矿化及成熟，而矿化结节是成骨细胞分化的成熟标志，同时也是成骨细胞行使成骨功能的主要形态学表现^[13-14]。为此，观察成骨细胞的矿化结节是研究成骨细胞分化的常用手段之一。

茜素红染色法是目成骨细胞前矿化结节染色主要方法，它可使矿化结节染成深红色物质，这是由于矿化结节中含有大量的钙盐，可与茜素红发生显色反应，产生一种深红色的化合物。四环素亦是成骨细胞矿化结节的特殊染色方法之一，它主要是利用四环素与矿化结节中得钙盐形成可发出荧光的磷酸复合物，并采用荧光显微镜观察。目前，扫描电镜主要被用于观察骨的胶原结构^[15]、松质骨^[16]、骨小梁等^[17]，而将扫描电镜用于观察成骨细胞矿化结节的亚显微结构尚未详细报道。本实验采用肿瘤坏死因子α作为抑制成骨细胞分化的对照^[18-21]，拟通过茜素红染色、四环素染色激光扫描共聚焦显微镜术与扫描电镜术等观察成骨细胞的矿化结节，并进一步进行矿化结节的钙元素定量分析，比较这3种形态学观察方法，探讨各自的特色及优势。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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材料方法

设计：肿瘤坏死因子α对照，细胞实验。

时间及地点：实验于2012年3月至2013年3月在福建中医药大学中西医结合研究院医学实验中心完成。

材料：

细胞：大鼠成骨样细胞株UMR-106购自中科院上海细胞库。

方法：

细胞培养：成骨细胞株UMR-106用含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养基在37 ℃，体积分数5%CO₂恒温培养箱培养。细胞长满后，经0.25%胰蛋白酶消化，按1传4比例接种培养。

茜素红染色-光镜观察矿化结节实验：细胞接种于6孔板中，每孔为1×10⁵个细胞。分成正常对照组与肿瘤坏死因子α组(肿瘤坏死因子α的质量浓度为10 μg/L)；细胞每天观察、换液，连续培养14 d；小心吸去培养液，加入体积分数95%乙醇固定15 min，PBS洗涤；加入0.1%茜素红染液，染色30 min，水洗；光镜下观察拍照。

四环素染色-激光共聚焦显微镜观察矿化结节实验：细胞接种于6孔板中，每孔为1×10⁵个细胞。分成正常对照组与肿瘤坏死因子α组(肿瘤坏死因子α的浓度为10 μg/L)，各组加入50 mg/L四环素荧光染色，细胞每天观察、换液，连续培养14 d后，小心吸去培养液，PBS洗涤；加入40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤，然后加入DAPI进行核衬染5 min；荧光镜快速观察，发现荧光后，立刻用激光扫描共聚焦显微镜观察、拍照。

扫描电镜观察矿化结节实验：细胞接种于6孔板中，每孔为1×10⁵个细胞。分成正常对照组与肿瘤坏死因子α组(肿瘤坏死因子α的质量浓度为10 μg/L)，细胞每天观察、换液，连续培养14 d；小心吸去培养液，加入不含血清的α-MEM培养基继续培养30 min后，将上清吸去，加入双蒸水30 s后，立即吸去双蒸水，加入2.5%戊二醛固定液4 ℃、固定24 h；进行PBS漂洗，1%锇酸后固定4 ℃，1 h；PBS洗涤，双蒸水漂洗30 s，然后经30%，50%，70%，90%，100%叔丁醇梯度脱水，抽真空干燥，喷金镀膜，扫描电镜上机观察、拍照。结合能谱分析仪对单个细胞及其周围进行Ca元素的定量分析。

主要观察指标：成骨细胞矿化结节。

统计学分析：所有实验数据用x(_)±s表示，采用SPSS 16.0进行配对t 检验分析比较。P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

实验采用的3种形态学观察方法均可见到正常的成骨细胞矿化结节的显微形态结构，这说明在矿化结节形成较明显的情况下，均可采用这3种方法观察其形态。肿瘤坏死因子α可抑制成骨细胞的增值、分化作用^[22]，实验采用了肿瘤坏死因子α作为对照，在矿化结节常规染色方法-茜素红染色中，未见明显的矿化结节；而用四环素荧光染色-激光扫描共聚焦显微镜，或用扫描电镜均观察到了矿化结节的显微形态，说明荧光染色-激光扫描共聚焦显微镜法、扫描电镜，在观察成骨细胞矿化结节的灵敏性上更好。通常荧光染色-荧光显微镜观察，要比生物色素染色-普通光镜观察的敏感度高，而在矿化结节的四环素荧光染色观察中，采用了比荧光显微镜灵敏度更高的激光共聚焦显微镜观察，并利用大面积扫描的软硬件，进行3×3大面积扫描(相当于普通单幅图的9倍)，能较为宏观地显示矿化结节形成情况，与同等倍数的普通单幅图相比，其实验统计的结果更可靠、客观。成骨细胞在分化过程中会分泌大量钙质^[23-25]，钙质中含大量磷酸钙沉淀，利用扫描电镜的附件能谱分析仪可进行原位测定矿化结节Ca的含量。通过比较各组单细胞及其周围分泌的Ca含量，可进一步证实肿瘤坏死因子α对成骨细胞分化成熟的抑制作用，该结果与茜素红染色与四环素染色的结果吻合，提示采用扫描电镜与能谱分析可实现钙元素的定量，且该法与先前采用茜素红染色-图像分析软件半定量相比，更有参考价值。

在观察矿化结节显微及亚显微形态中，实验利用扫描电镜的景深较大、成像立体感强等优点，在低能量电子束照射下发现矿化结节上可见细胞表面不平整，有脊状突起，边沿伸出伪足，细胞聚集，形成细胞团，进而形成矿化结节，部分细胞分泌钙质等矿化结节的显微及亚显微形态。扫描电镜观察-元素原位定量法与矿化结节传统的显微形态观察相比，可更加细微、形象地显示矿化结节的形态结构、形成过程以及钙元素的变化，在矿化结节的观察方法上具有新颖性，值得推广应用。

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