内质网应激介导成骨细胞凋亡在骨溶解骨组织中的作用及机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.33.002

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (33): 5257-5265.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.33.002

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内质网应激介导成骨细胞凋亡在骨溶解骨组织中的作用及机制

刘国印¹，王瑞¹，董磊²，张俊峰²，赵建宁¹

¹南京大学医学院附属南京军区南京总医院，江苏省南京市 210002；²南京大学生命科学院国家医药生物技术重点实验室，江苏省南京市 210093

出版日期:2014-08-13 发布日期:2014-08-13
通讯作者: 赵建宁，硕士，主任医师，教授，博士生导师，解放军南京军区南京总医院，江苏省南京市 210002
作者简介:刘国印，男，1987年生，江苏省徐州市人，南京大学在读硕士，主要从事关节外科的研究。
基金资助:
国家自然基金青年科学基金项目(81000792)

Endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis of osteoblasts within the osteolytic craniums

Liu Guo-yin¹, Wang Rui¹, Dong Lei², Zhang Jun-feng², Zhao Jian-ning¹

¹ Nanjing General Hospital of Nanjing Military Area Command of PLA, School of Medicine of Nanjing University, Nanjing 210002, Jiangsu Province, China; ²State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, School of Life Sciences, Nanjing University, Nanjing 210093, Jiangsu Province, China

Online:2014-08-13 Published:2014-08-13
Contact: Zhao Jian-ning, Master, Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Nanjing General Hospital of Nanjing Military Area Command of PLA, School of Medicine of Nanjing University, Nanjing 210002, Jiangsu Province, China
About author:Liu Guo-yin, Studying for master’s degree, Nanjing General Hospital of Nanjing Military Area Command of PLA, School of Medicine of Nanjing University, Nanjing 210002, Jiangsu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China for Youths, No. 81000792

摘要/Abstract

摘要：

背景：磨损微粒能够在体外诱导成骨细胞凋亡，但是发生骨溶解的骨组织中是否也存在成骨细胞的凋亡以及骨组织中的成骨细胞凋亡信号通过何种途径进行传导目前尚不清楚。
目的：分析内质网应激反应在骨溶解骨组织中成骨细胞凋亡和骨溶解发生发展中的作用。
方法：制备磨损微粒诱导骨溶解动物模型。实验分为4组：空白对照组只接受PBS的刺激；磨损微粒组只接受纳米合金粉末悬液的刺激；内质网应激阳性对照组接受纳米合金粉末+毒胡萝卜素的刺激；内质网应激抑制组接受纳米合金粉末悬液及造模后当时、造模后1，2，3和5 d分别腹腔注射4-苯基丁酸。通过甲苯胺蓝染色、苏木精-伊红染色和碱性磷酸酶染色观察骨溶解的病理变化；分析骨溶解颅骨组织中成骨细胞分化成熟情况；Western Blot方法检测骨溶解颅骨组织内内质网应激反应标志蛋白的表达变化；TUNEL和Caspase-3免疫组织化学方法检测骨溶解颅骨组织内成骨细胞的凋亡情况。
结果与结论：磨损微粒能够在体外诱导小鼠颅骨骨溶解的发生、加重炎症细胞的浸润以及抑制成骨细胞分化成熟，同时磨损微粒还可以上调成骨细胞内质网应激反应标志蛋白以及促进骨溶解骨组织中成骨细胞的凋亡。经内质网应激抑制剂(4-苯基丁酸)的治疗后，骨溶解症状明显缓解，骨侵蚀和炎症浸润显著降低，成骨细胞的分化成熟得到改善，凋亡的成骨细胞急剧减少，内质网应激标志蛋白的表达逐渐减弱。表明内质网应激反应参与骨溶解的形成并在骨溶解的发生发展中发挥重要作用。提示内质网应激可作为一种新的治疗靶点，为临床逆转或治疗骨溶解和无菌性松动提供新的思路和方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 骨组织工程, 磨损微粒, 成骨细胞, 内质网应激反应, 细胞凋亡, 骨溶解, 无菌性松动, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Wear particles-induced osteoblasts apoptosis in vitro has been documented in many studies. However, the apoptosis of osteoblasts in osteolytic bone tissue and the selective mechanisms involved in the pathogenesis of osteolysis have been studied rarely.
OBJECTIVE: To investigate the influence of endoplasmic reticulum (ER) stress on the apoptosis of osteoblasts in osteolytic bone tissue and osteolysis progression.
METHODS: The mouse model of osteolysis was induced with wear particles placed onto the calvaria. The experiment was divided into four groups: blank control group (PBS stimulation); wear particle group (nano-alloy powder suspension stimulation); ER stress positive control group (nano-alloy powder + thapsin stimulation); and ER stress inhibitor group (nano-alloy powder + sodium 4-phenylbutyrate stimulation). The histopathologic change
of osteolysis was assessed by hematoxylin-eosin, toluidine blue and alkaline phosphatase staining. Osteoblast proliferation and differentiation in osteolytic craniums were measured. The expression of ER stress markers in osteolytic craniums was examined by western blot analysis. Osteoblast apoptosis was analyzed by TUNEL staining and immunohistochemistry of Caspase-3 in osteolytic craniums.
RESULTS AND CONCLUSION: Wear particles were capable of inducing osteolysis, aggravating the infiltration of inflammatory cells, and inhibiting the differentiation of osteoblasts in osteolytic craniums. Meanwhile wear particles upregulated the ER stress markers and promote the apoptosis in osteolytic craniums. Blocking ER stress with sodium 4-phenylbutyrate dramatically reduced the severity of osteolysis, significantly reduced bone invasion and inflammatory infiltration, promoted the differentiation of osteoblasts, and dramatically reduced the apoptosis. Along with apoptosis, the expression of ER stress marker was decreased. The present study suggests that the ER stress may be crucial for osteolysis and represent a potential therapeutic target in the prevention and treatment of patients with total joint replacement who are at high risk of early aseptic loosening development.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: osteoblasts, endoplasmic reticulum, Caspases

中图分类号:

R318

刘国印，王瑞，董磊，张俊峰，赵建宁. 内质网应激介导成骨细胞凋亡在骨溶解骨组织中的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(33): 5257-5265.

Liu Guo-yin, Wang Rui, Dong Lei, Zhang Jun-feng, Zhao Jian-ning. Endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis of osteoblasts within the osteolytic craniums[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(33): 5257-5265.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析实验选用小鼠28只，分为4组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。

2.2 动物一般情况各组动物造模后送返原笼，麻醉苏醒后常规饲养。各组动物均存活至实验结束，其间动物活动、进食情况基本正常，切口愈合良好，无皮下积液及切口感染等并发症发生。

2.3 内质网应激反应介导的骨溶解结果

2.3.1 小鼠颅骨骨片经甲苯胺蓝染色后置于显微镜下观察见图1A和B。在小鼠颅骨植入磨损微粒纳米合金粉末后，可见大量圆形，椭圆形或梭形的骨吸收陷窝，陷窝深浅不等，着色浓度不一。对骨吸收陷窝面积进行积分显示：相对于空白对照组，纳米合金粉末组骨陷窝吸收率为3.3。还发现，在纳米合金粉末植入的基础上，加入内质网应激的诱导剂毒胡萝卜素后，骨吸收的陷窝最密集，骨溶解症状最严重；经内质网应激的抑制剂(4-苯基丁酸)的治疗后，陷窝的数量和大小均明显减少，骨溶解症状得到明显改善。统计学分析显示，磨损微粒纳米合金粉末组以及纳米合金粉末+毒胡萝卜素组，相对于空白对照组，差异均有显著性意义(P < 0.05)，纳米合金粉末+4-苯基丁酸组相对于纳米合金粉末组差异也有显著性意义(P < 0.05)。结果表明内质网应激参与骨溶解的形成。

2.3.2 小鼠颅骨的苏木精-伊红染色结果根据苏木精-伊红染色结果对颅骨骨溶解和炎症浸润进行评判，见图1C和1D。正常小鼠的颅骨结构清晰，黏膜和骨皮质完整，细胞构成大小、形态相同，排列整齐，极向正常，无炎症细胞浸润；而当小鼠颅骨受到纳米合金粉末的刺激后，表现出严重的浸润破坏，颅骨结构紊乱，黏膜层严重受损，骨皮质受到破坏，细胞构成大小、形态不一，排列多层，极向消失；髓腔大小不一、排列紊乱，炎症细胞浸润至颅深层甚至穿透颅骨，造成髓腔内成骨细胞丢失。经内质网应激的抑制剂(4-苯基丁酸)的治疗后，骨形态完整性得到保持，骨侵蚀和炎症浸润症状明显改善。在纳米合金粉末组中加入内质网应激的诱导剂毒胡萝卜素后，得到相反的结果。毒胡萝卜素加入后，骨形态的完好性受到进一步的破坏，骨侵蚀和炎症浸润程度也急剧加重。结果表明内质网应激在骨溶解的发生发展中起着一定的作用。

2.3.3 小鼠颅骨成骨细胞碱性磷酸酶染色结果见图1E和1F。颅骨中成骨细胞的阳性反应呈现红黑色颗粒或块状沉淀，骨形成隧道呈现深色条带。植入纳米合金粉末后，小鼠颅骨的成骨细胞数量显著减少，骨形成隧道随着磨损微粒纳米合金粉末的加入而逐渐降低。应用4-苯基丁酸后，成骨细胞的数量和骨形成较纳米合金粉末组明显增加；而加入内质网应激的诱导剂毒胡萝卜素后，成骨细胞和骨形成受到进一步损伤。

骨溶解骨组织中的碱性磷酸酶活性的趋势与碱性磷酸酶染色的实验结果一致。见图2A，在纳米合金粉末的刺激条件下，碱性磷酸酶的活性较空白对照组明显降低；加入毒胡萝卜素后，碱性磷酸酶活性进一步降低；而经4-苯基丁酸治疗后，碱性磷酸酶活性较纳米合金粉末组有较大的改善。统计学分析显示，纳米合金粉末组以及纳米合金粉末+毒胡萝卜素组，相对于空白对照组，差异均有显著性意义(P < 0.05)，纳米合金粉末+4-苯基丁酸组相对于纳米合金粉末组差异也有显著性意义(P < 0.05)。 2.4 骨溶解颅骨组织中的内质网应激反应见图2C和2D，当受到纳米合金粉末的刺激后，小鼠颅骨的内质网应激反应标志蛋白(GRP78/Bip，IRE1-α以及CHOP)的表达显著升高；在纳米合金粉末的基础上应用毒胡萝卜素后，内质网应激反应标志蛋白的表达得到进一步的提高；然而，腹腔注射4-苯基丁酸后，内质网应激反应标志蛋白的表达较纳米合金粉末组明显降低。此外还发现，这些内质网应激反应标志蛋白的变化趋势与上面提到的骨溶解结果一致。结果表明纳米合金粉末诱导的内质网应激反应参与了骨溶解的发生。

2.5 内质网应激反应介导骨溶解颅骨内成骨细胞的凋亡

2.5.1 骨溶解颅骨组织中成骨细胞的凋亡 TUNEL实验结果见图3A和3B。纳米合金粉末组的颅骨组织中有明显的成骨细胞凋亡，可以看到大量的棕黄色颗粒着色，并有细胞核碎裂等形态学表现。而正常颅骨组织仅发现少量的凋亡成骨细胞。然而，相对于纳米合金粉末组，纳米合金粉末+4-苯基丁酸组的凋亡成骨细胞明显减少，同时，纳米合金粉末+毒胡萝卜素组的凋亡细胞持续升高。

2.5.2 凋亡蛋白Caspase-3在骨溶解颅骨组织中的表达研究表明，凋亡蛋白Caspase-3的激活不仅可以促进死亡受体的活化和线粒体途径关键蛋白的释放，还与内质网应激反应紧密相连。因此，Caspase-3是凋亡级联反应中的关键蛋白酶，是多种凋亡途径的共同下游效应部分。为明确凋亡蛋白Caspase-3在骨溶解发生发展中的作用，对骨溶解颅骨组织中凋亡蛋白Caspase-3的活性和表达情况进行了检测，通过图2B，3C和3D的实验结果发现，Caspase-3在纳米合金粉末组中高表达并表现出高活性，而在正常颅骨组织中，Caspase-3的活性和表达均很低。同样，与TUNEL实验结果一致，腹腔注射4-苯基丁酸后，Caspase-3的活性和表达显著降低；而加用毒胡萝卜素后，Caspase-3的活性和表达明显升高。

参考文献

[1]Del Buono A, Denaro V, Maffulli N.Genetic susceptibility to aseptic loosening following total hip arthroplasty: a systematic review. Br Med Bull. 2012;101:39-55.
[2]Kadoya Y, Kobayashi A, Ohashi H. Wear and osteolysis in total joint replacements. Acta Orthop Scand Suppl. 1998;278:1-16.
[3]Kaddick C, Catelas I, Pennekamp PH, et al.[Implant wear and aseptic loosening. An overview]. Orthopade.2009.38(8): 690-697.
[4]Goodman SB, Gibon E, Yao Z. The basic science of periprosthetic osteolysis.Instr Course Lect. 2013;62: 201-206.
[5]Gallo J, Goodman SB, Konttinen YT, et al.Particle disease: biologic mechanisms of periprosthetic osteolysis in total hip arthroplasty. Innate Immun.2013; 19(2): 213-224.
[6]P. Edward Purdue, Panagiotis Koulouvaris, Bryan J. Nestor, et al.The central role of wear debris in periprosthetic osteolysis. HSS J.2006;2(2): 102-113.
[7]Goodman SB, Lind M, Song Y, Smith RL.et al.In vitro, in vivo, and tissue retrieval studies on particulate debris. Clin Orthop Relat Res.1998;(352): 25-34.
[8]O'Neill SC, Queally JM, Devitt BM, et al.The role of osteoblasts in peri-prosthetic osteolysis. Bone Joint J.2013. 95-B(8): 1022-1026.
[9]Vermes C, Glant TT, Hallab NJ, et al.The potential role of the osteoblast in the development of periprosthetic osteolysis: review of in vitro osteoblast responses to wear debris, corrosion products, and cytokines and growth factors. J Arthroplasty.2001;16(8 Suppl 1): 95-100.
[10]Jiang Y, Jia T, Wooley PH, et al.Current research in the pathogenesis of aseptic implant loosening associated with particulate wear debris. Acta Orthop Belg.2013;79(1):1-9.
[11]Noordin S, Masri B. Periprosthetic osteolysis: genetics, mechanisms and potential therapeutic interventions. Can J Surg.2012;55(6):408-417.
[12]Goodman SB, Trindade M, Ma T, et al.Pharmacologic modulation of periprosthetic osteolysis. Clin Orthop Relat Res.2005;(430):39-45.
[13]Lochner K, Fritsche A, Jonitz A, et al.The potential role of human osteoblasts for periprosthetic osteolysis following exposure to wear particles. Int J Mol Med.2011;28(6): 1055-1063.
[14]Gallo J, Raska M, Mrázek F,et al.Bone remodeling, particle disease and individual susceptibility to periprosthetic osteolysis. Physiol Res.2008;57(3):339-349.
[15]Jiang Y, Jia T, Gong W, et al.Titanium particle-challenged osteoblasts promote osteoclastogenesis and osteolysis in a murine model of periprosthestic osteolysis. Acta Biomater. 2013;9(7):7564-7572.
[16]Xu C, Bailly-Maitre B, Reed JC. Endoplasmic reticulum stress: cell life and death decisions. J Clin Invest.2005;115(10): p. 2656-2664.
[17]Kim I, Xu W, Reed JC. Cell death and endoplasmic reticulum stress: disease relevance and therapeutic opportunities. Nat Rev Drug Discov.2008;7(12): 1013-1030.
[18]Lai E, Teodoro T, Volchuk A.Endoplasmic reticulum stress: signaling the unfolded protein response. Physiology (Bethesda). 2007;22:193-201.
[19]Dong L, Wang R, Zhu YA, et al.Antisense oligonucleotide targeting TNF-alpha can suppress Co-Cr-Mo particle-induced osteolysis. J Orthop Res.2008;26(8):1114-1120.
[20]Purdue PE, Koulouvaris P, Potter HG, et al.The cellular and molecular biology of periprosthetic osteolysis. Clin Orthop Relat Res.2007;454:251-261.
[21]Beck RT, Illingworth KD, Saleh KJ. Review of periprosthetic osteolysis in total joint arthroplasty: an emphasis on host factors and future directions. J Orthop Res.2012;30(4): 541-546.
[22]Howie DW, Neale SD, Haynes DR,et al.Periprosthetic osteolysis after total hip replacement: molecular pathology and clinical management. Inflammopharmacology.2013;21(6): 389-396.
[23]Wu J, Wang Y, Ren H, et al.[Influence of titanium particles loading on releases of cytokines of osteoblasts]. Sheng Wu Yi Xue Gong Cheng Xue Za Zhi.2011;28(4):748-752.
[24]Wooley PH, Schwarz EM.Aseptic loosening.Gene Ther.2004；11(4): 402-407.
[25]Yang F, Wu W, Cao L, et al.Pathways of macrophage apoptosis within the interface membrane in aseptic loosening of prostheses. Biomaterials. 2011;32(35):9159-9167.
[26]Landgraeber S, von Knoch M, Löer F, et al.Extrinsic and intrinsic pathways of apoptosis in aseptic loosening after total hip replacement. Biomaterials. 2008;29(24-25):3444-3450.
[27]Yousef Abu-Amer, Isra Darwech, John C Clohisy.Aseptic loosening of total joint replacements: mechanisms underlying osteolysis and potential therapies. Arthritis Res Ther.2007;9 Suppl 1: S6.
[28]Jacobs JJ, Roebuck KA, Archibeck M, et al.Osteolysis: basic science. Clin Orthop Relat Res. 2001;(393): 71-77.
[29]Landgraeber S, Jaeckel S, Löer F,et al.Pan-caspase inhibition suppresses polyethylene particle-induced osteolysis. Apoptosis. 2009;14(2):173-181.
[30]Urano F.[Stress signaling from the endoplasmic reticulum]. Tanpakushitsu Kakusan Koso.2004;49(7 Suppl):1002-1005.
[31]Shen X, Zhang K, Kaufman RJ. The unfolded protein response--a stress signaling pathway of the endoplasmic reticulum. J Chem Neuroanat.2004;28(1-2):79-92.
[32]Wang R, Wang Z, Ma Y, et al.Particle-induced osteolysis mediated by endoplasmic reticulum stress in prosthesis loosening. Biomaterials.2013;34(11): 2611-2623.
[33]Hotamisligil GS.Endoplasmic reticulum stress and the inflammatory basis of metabolic disease. Cell.2010;140(6): 900-917.
[34]Tanaka K, Yamaguchi T, Kaji H, et al.Advanced glycation end products suppress osteoblastic differentiation of stromal cells by activating endoplasmic reticulum stress. Biochem Biophys Res Commun.2013;438(3):463-467.

引言

人工关节置换自其诞生30多年来是治疗终末期关节病损有效、可靠、经济的方法[1]，能明显缓解关节疼痛，改善关节功能，提高患者生活质量。然而随着假体植入时间的延长，假体材料磨损及机体对磨损微粒的异常生物学反应导致的假体周围骨溶解，已成为影响人工关节长期稳定性和使用寿命的主要因素[2-3]。

骨溶解的发生是复杂的网络调控系统，各因素间相互作用、相互交织在错综复杂的信号通路中。假体周围的组织细胞(巨噬细胞，破骨细胞，成纤维细胞，成骨细胞等)吞噬理化性质稳定的磨损颗粒后，这些细胞的降解功能受挫，因体内的酶不能使其降解，而磨损颗粒引起细胞自身功能活性的改变，释放白细胞介素1、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、前列腺素E2等炎性因子以及骨保护素、RANKL、GM-CSF、血管内皮生长因子等趋化因子，导致成骨细胞活性降低，破骨细胞分化增加，同时诱导细胞损伤，出现细胞凋亡甚至细胞坏死现象，结果已被吞噬的磨损颗粒再次释放到细胞外基质中，诱导新的炎性细胞来吞噬，磨损颗粒被反复吞噬后导致激活的细胞分泌更多的炎性细胞因子和蛋白酶水解酶，从而诱导、维持、甚至加剧磨损微粒诱导的慢性炎性反应和凋亡反应，导致假体周围骨量丢失[4-7]。而骨组织正常结构功能的维持是骨形成代谢(由合成骨基质的成骨细胞完成)和骨吸收代谢(由吸收骨基质的破骨细胞完成)动态平衡的结果。

任何引起骨代谢异常的因素如成骨细胞骨形成减少或破骨细胞骨吸收活动增加都会导致骨再建失衡、骨量丢失，并可导致骨溶解的发生[8-10]。大量研究人员通过调控单核巨噬细胞和破骨细胞的活性以及假体周围骨吸收，期望找到治疗骨溶解的有效措施[11-12]。然而，由于成骨细胞也存在于假体周围并且也受到磨损颗粒的影响，因此作者猜测，磨损微粒对骨组织中成骨细胞的影响很有可能是无菌性松动过程中另外一个重要因素[13-14]，但是对于骨组织中成骨细胞识别磨损微粒后参与到骨溶解和假体松动过程中的机制，目前还不清楚。国内外学者发现磨损微粒能够抑制成骨细胞增殖、促进成骨细胞分泌炎性递质、引起成骨细胞的凋亡[8- 9，13，15]，但是发生骨溶解的骨组织中是否也存在成骨细胞的凋亡以及骨组织中的成骨细胞凋亡信号通过何种途径进行传导目前尚不清楚。

细胞凋亡又称细胞程序性死亡，广泛存在于多细胞生物的各种组织中，是细胞内一个积极主动的程序性生理过程。细胞受到凋亡诱导因素作用后，经信号转导系统的传递而激活凋亡基因。死亡受体活化(外源性途径)和线粒体损伤途径(内源性途径)是细胞内两条经典的凋亡途径，内质网应激启动的凋亡途径是近年才发现的一种新的凋亡途径[16]。

内质网作为多种应激过程的共同通路，可通过内质网应激与各种凋亡通路相偶联，作为治疗靶点具有独特优越性[17]。虽然对内质网应激与骨溶解相互关系的机制缺乏足够了解，但通过维持内质网功能或抑制成骨细胞内质网应激反应，引起成骨细胞凋亡相关基因的变化进而影响骨溶解的行为都无疑是良好的治疗思路[17-18]。本实验针对这些可能，设计实验，主要研究磨损微粒诱导的成骨细胞内质网应激反应对骨组织中成骨细胞的增殖、分化和凋亡以及对骨溶解的影响，详细了解磨损微粒对成骨细胞的作用以及成骨细胞内质网应激反应在骨溶解发生发展中的重要作用，从分子水平上明确骨溶解骨组织中成骨细胞凋亡的机制，寻找有效的治疗靶点，以期为无菌性松动的预防和早期治疗提供新的思路和方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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材料方法

设计：分组对照观察。

时间及地点：实验于2012年6月至2013年12月在南京大学生命科学院国家医药生物技术重点实验室完成。

材料：

实验动物：清洁级6-8周龄的ICR雌性小鼠28只，由南京军区比较医学科动物实验中心提供。

合金粉末处理：为防止细菌及残留内毒素引发炎症，合金粉末经体积分数70%乙醇中于室温下反复超声清洗3次，30 min/次，每次均将洗涤后的乙醇弃去。将清洗完的颗粒置于体积分数70%的乙醇中浸泡48 h，以无菌PBS洗涤3遍后，采用LAL试剂盒对样品进行定量检测。根据说明书所述方法进行操作，以0.25 EU/mL为检测标准。结果为阴性后将粉末无菌条件下烘干，保存于无菌容器中，4 ℃保存备用，使用前配制成30 g/L的母悬液。如不合格，则重复上述过程，直至达标为止。

实验方法：

小鼠颅骨骨溶解模型的制作：取清洁级6-8周龄的ICR雌性小鼠28只，参考Knocha等的方法建立动物模型[19]，以氯氨酮(70-80 mg/kg)和氟哌利多(5-7 mg/kg)混合腹腔注射麻醉小鼠，麻醉成功后将其俯卧位固定于操作台上，术区备皮后，以0.5%的碘伏消毒，铺无菌巾单。取小鼠头部前正中矢状切中，上起双耳连线中点，下止于双眼连线中点，长约10 mm。切开皮肤，显露10 mm×10 mm大小的骨膜，将刺激物均匀地洒于骨膜上后，连续锁边缝合切口，造模后腹腔注射青霉素防止感染。手术由同1名外科医师于1 d内完成，实验中所用的所有溶液器械，均进行高压蒸汽灭菌，手术过程严格按照无菌操作。

实验分组与给药：随机分成4组，每组7只。

组织标本的保存与处理：造模后14 d，处死小鼠，收取小鼠颅骨组织，将颅骨沿中线修剪成两半。一半保存于预冷的PBS中，用于甲苯胺蓝染色；另一半用40 g/L多聚甲醛固定，用于碱性磷酸酶(ALP)染色。此外，搜集发生骨溶解的小鼠颅骨样本，以天平称取相同质量的组织，一部分液氮研磨、蛋白裂解后，保存在-80 ℃，用于碱性磷酸酶活性和Caspase-3活性的检测；另一部分40 g/L多聚甲醛固定24 h，EDTA脱钙三四周，常规石蜡包埋切片用于TUNEL染色和Caspase-3免疫组织化学。

甲苯胺蓝染色：将获取的小鼠颅骨样本用PBS浸泡于平皿中，直至颅骨表面发白透明；把颅骨上的残留软组织彻底清除，用PBS再次清洗干净；0.25%胰酶消化颅骨标本15 min，大量三蒸水冲洗；将冲洗后的颅骨标本在 0.25 mol/L氨水中浸泡过夜；大量的三蒸水冲洗干净后放置于空气中晾干；将晾干后的标本于0.25%的甲苯胺蓝溶液中浸润15 min，体积分数70%的乙醇分色；把标本置于载玻片上，缓冲甘油封固；显微镜下观察颅骨溶解后产生的陷窝。显微镜下观察颅骨溶解后产生的陷窝，取随机视野对吸收陷窝的总面积进行积分，计算7份样品的平均值。

苏木精-伊红染色：将切片放在染色夹上，不同体积分数乙醇依次脱蜡至水：二甲苯10 min→无水乙醇3 min→95%乙醇3 min→90%乙醇3 min→80%乙醇3 min→70%乙醇3 min→60%乙醇3 min→50%乙醇3 min→水3 min→苏木精染色3 min→自来水冲洗(四五遍至水无色)→30% 乙醇3 min→50%乙醇3 min→60%乙醇3 min→70%乙醇 3 min(可以停留)→80%乙醇3 min→90%乙醇3 min→伊红染色5 min→95%乙醇3 min→无水乙醇3 min→二甲苯 10 min→中性树胶封固→过夜晾干。使用显微镜拍照观察颅骨组织形态和炎症浸润情况，取随机视野对炎症浸润的总面积进行积分，计算7份样品的平均值。

碱性磷酸酶染色：将获取的颅骨样本用PBS浸泡于平皿中，直至颅骨表面发白透明；把颅骨上的残留软组织彻底清除，用PBS再次清洗干净；将基质液放入染色缸中 37 ℃水浴预温5 min左右，再将颅骨样本放入基质液染缸中37 ℃孵育5 min，不要水洗；立即放入显色液染缸中染色5 min，水洗30 s；放入终止液染缸中染色2 min，水洗30 s；再放入复染液染缸中染色1 s(即浸一下复染液立即取出，并立即甩掉)，水洗30 s-1 min；显微镜下观察颅骨组织中骨形成情况。取随机视野对骨形成的总面积进行积分，计算7份样品的平均值。

碱性磷酸酶活性和Caspase 3活性检测：将发生骨溶解小鼠颅骨组织用剪刀剪碎，加入组织裂解液(细胞裂解液∶蛋白酶抑制剂=100∶1)研磨，冰上裂解1 h以上，4 ℃、12 000 r/min离心5 min，取上清。按照碱性磷酸酶活性和Caspase 3活性试剂盒说明书进行操作，用酶联免疫检测仪405 nm波长，测定各孔的吸光度值，记录。同时采用BCA法确定标本中总蛋白的含量，用于标化碱性磷酸酶活性和Caspase 3活性定量的检测结果。

蛋白质免疫印迹(western blotting)：组织上清蛋白样品与5×SDS按一定比例(5∶1)混合，沸水变性5 min， 12 000 r/min离心5 min。用微量进样器上样(组织120 μg)，以浓缩胶70 V，分离胶70-120 V，电泳3 h，直至溴酚蓝电泳至凝胶底部，停止电泳。电泳后小心取下用来电转的凝胶，置于转膜缓冲液中平衡5-15 min。将PVDF膜在100%甲醇中浸泡1 min以上，放于转膜液中平衡，将膜和滤纸放入转移缓冲液中浸泡，制备转印夹层，恒流300 mA电泳120 min。将电泳后的PVDF膜置于5%的BSA室温封闭2 h。分别使用兔抗小鼠IRE1-α，Grp78/Bip， GAPDH和鼠抗小鼠CHOP的一抗进行孵育4 ℃过夜，1×PBST洗膜4×每次10 min，随后使用二抗HRP标记的羊抗兔/鼠的二抗室温孵育1 h，western blotting机器扫描观察结果。

TUNEL染色：将骨溶解颅骨组织切片放在染色夹上用二甲苯浸洗5 min×2次，梯度乙醇水化，40 g/L多聚甲醛固定15 min，Proteinase K处理组织15 min，40 g/L多聚甲醛5 min，100 μL平衡液湿盒平衡10 min，100 μL TUNEL反应混合液标记标本，2×SSC 15 min终止标记反应，体积分数0.3% H2O2 15 min封闭POD，100 μL streptavidin标记HRP，100 μL DAB混合液(50 μL DAB+50 μL DAB底物缓冲液+50 μL H2O2 20×+950 μL三蒸水)10 min避光显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明1 min×2次，中性树胶封固。加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜观察凋亡细胞(共计200-500个细胞)并拍照。可结合凋亡细胞形态特征来综合判断(未染色细胞变小，胞膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体，贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状/凋亡小体)。

免疫组织化学染色：将骨溶解颅骨组织石蜡切片，常规脱蜡至水；体积分数3% H2O2去离子水孵育10-30 min灭活内源性过氧化物酶活性；微波抗原修复；血清室温封闭15-30 min；一抗(抗Caspase-3) 4 ℃过夜；PBS冲洗后生物素标记的二抗37 ℃孵育1 h；标本PBS冲洗后滴加 SP(链霉亲和素-过氧化物酶)，37 ℃孵育1 h；PBS再次冲洗后显色剂显色；PBS洗3次后，水溶性封片剂封固。

主要观察指标： ①内质网应激反应介导的骨溶解结果。②骨溶解颅骨组织中的内质网应激反应。③内质网应激反应介导的骨溶解颅骨内成骨细胞的凋亡。

统计学分析：计量资料均采用x(_)±s表示。采用单因素方差分析对各组资料时行统计学分析。借助SAS 6.0统计软件进行分析，以P ≤ 0.05为显著性差异的指标。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

研究证实，假体磨损产生的颗粒诱发假体周围组织细胞产生一系列生物学反应(细胞凋亡，炎症和破骨细胞分化等)[4，20-22]，是关节置换后假体周围骨溶解和无菌性松动的主要原因[4]。磨损颗粒在假体周围骨溶解的发生和发展过程中起着关键性作用，无论假体采用何种材质或何种固定方式，材料与骨界面间的微动和关节摩擦，必然会产生磨损颗粒，相比未发生骨溶解的患者，骨溶解患者有着更高的假体磨损率[10, 20-21]。

人工关节置换后假体周围净骨量的维持有赖于骨形成与骨吸收间良好平衡的协同[23-24]。任何引起骨代谢异常的因素如成骨细胞骨形成减少或破骨细胞骨吸收活动增加都会导致骨再建失衡、骨量丢失，并可导致骨溶解的发生。目前普遍认为，破骨细胞前体细胞(单核巨噬细胞及其衍生细胞)是磨损微粒靶向作用最重要的细胞以及无菌性松动发生过程中的关键细胞。大量的研究表明，界膜组织中巨噬细胞的凋亡与假体周围骨溶解及无菌性松动的发生密切相关[25-27]。然而，假体周围骨溶解并非仅仅由巨噬细胞引起，而是由多种细胞参与，通过细胞因子相互联系共同作用的生物反应过程。近年来，国内外更多的学者将目光投入到磨损微粒对成骨细胞影响的研究，磨损微粒对成骨细胞的影响很有可能是无菌性松动过程中另外一个重要因素[6, 8, 15]。

成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，成骨细胞从增生活跃的细胞分化为被矿化基质包围的功能成熟的骨细胞需经历３个阶段：细胞增殖期、骨基质成熟期和骨基质矿化期[8, 13, 28- 29]。细胞增殖期主要表达细胞周期调节相关基因和Ｉ型胶原蛋白；在分化早期成骨细胞主要表达的碱性磷酸酶是成骨细胞外基质成熟的早期标志和成骨代谢的敏感而特异的指标；分化晚期成骨细胞进入矿化期，此时主要表达骨钙素、骨桥蛋白等基因，骨钙素主要出现在矿化形成期，是成骨细胞成熟的标志。

假体周围微环境中颗粒在局部的聚集严重影响成骨细胞功能，可引起成骨细胞功能受抑、增殖能力减弱、胞外基质分泌减少、碱性磷酸酶和Ｉ型胶原蛋白合成下降，进而引起邻近骨基质形成减少。虽然一般认为成骨细胞为非吞噬细胞，但体外研究证实这种细胞具备吞噬功能[9, 13]。成骨细胞吞噬磨损微粒后可引起细胞凋亡，这源于吞噬微粒引起的细胞直接毒性反应及在吞噬过程中或吞噬后，成骨细胞释放的炎性因子对其他成骨细胞的毒性反应(属间接作用)[8, 15]。

为了进一步研究磨损微粒诱导的内质网应激引起的骨溶解与成骨细胞骨形成之间的关系，接下来，实验比较了各组之间成骨细胞活性和数量间的变化规律。成骨细胞表达的碱性磷酸酶是成骨细胞外基质成熟的早期标志和成骨代谢的敏感而特异的指标，因此碱性磷酸酶的活性和表达能够有效代表成骨细胞分化情况。

在生理性骨重建过程中，破骨细胞的激活并发挥其骨吸收作用后，随之而来的是成骨细胞有序而彻底的替代，这样的过程中不会造成明显的骨量丢失。与之相反的是，在假体周围骨溶解过程中，局部的骨破坏并没有获得充分的骨形成修复，相反，却导致成骨细胞凋亡的增加，因此，骨溶解骨组织中的成骨细胞没有能力形成足够的骨基质去弥补假体周围丢失的骨量，上述所说的动态平衡关系显然已经不复存在，从而导致了持续的骨缺损，最终导致假体松动。

内质网应激启动的凋亡途径是近年才发现的一种新的凋亡途径。内质网是细胞内重要的细胞器，参与细胞内蛋白质的合成及合成后折叠、聚集，是调节细胞应激反应及钙水平的场所。作为细胞内最主要的Ca2+库，内质网还参与了各种细胞信号的处理。多种生理或病理条件如蛋白质糖基化的抑制、Ca2+的流失以及氧化还原状态的改变等会引起未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网聚集，损伤内质网的正常生理功能，称为内质网应激[16, 30]。内质网通过激活未折叠蛋白反应以保护由内质网应激所引起的细胞损伤，恢复细胞功能。但是如果损伤太过严重，内环境稳定不能及时恢复，内质网应激可引起细胞凋亡，信号由促生存向促凋亡转换[31]。这些作用既能为受损细胞提供修复机会，又能最大限度清除过度损伤的细胞，为维护机体的生理平衡和内环境的稳定起到重要作用。

细胞凋亡信号通路是一个复杂的网络调控系统，各因素间相互作用，相互交织在错综复杂的信号通路中，而内质网应激反应通过多种途径与细胞内凋亡通路相偶联[30]。已经发现内质网应激与骨溶解的发生有着千丝万缕的联系[32]。在假体周围磨损微粒的长期刺激下，细胞损伤太过严重，蓄积在内质网内的压力过大，内质网适应性反应还没来得及做出调整，就引起成骨细胞的凋亡，导致骨溶解的加重。通过对内质网应激的调节，可改变下游基因的表达，改变细胞或组织的蛋白合成，进而改变其生物学功能。因此，内质网应激可作为骨溶解治疗的一个新的靶点，为骨溶解的临床诊断和治疗提供一种新的思路。同时，由于内质网所作用的下游目的基因的不同，其发挥的作用也不尽相同，内质网与骨溶解之间复杂的调控和作用关系决定了对该领域的的深入研究具有广阔的发展前景。

最新研究发现，内质网应激反应抑制剂4-苯基丁酸和牛磺熊去氧胆酸(TUA)能够通过降低PERK和IRE1α的磷酸化来减轻内质网应激反应[33- 34]。作者的前期研究也发现，磨损微粒作用于巨噬细胞[32]，可诱导巨噬细胞产生内质网应激反应，并通过内质网应激反应促进巨噬细胞炎症因子的表达，进而引起了骨溶解的发生；应用内质网应激反应的抑制剂4-苯基丁酸后，破骨细胞的分化减少，炎症因子的表达降低，骨溶解症状得到明显改善。由于成骨细胞也存在于假体周围并且也受到磨损微粒的影响，因此猜测，磨损微粒对骨组织中成骨细胞的影响很有可能是无菌性松动过程中另外一个重要因素，但是对于成骨细胞识别磨损微粒后参与到假体松动过程中的机制，目前还不清楚。以往研究发现，成骨细胞吞噬磨损微粒后可引起成骨细胞凋亡[8, 13]。但是发生骨溶解的骨组织中是否存在成骨细胞的凋亡以及凋亡信号是否通过内质网应激反应途径进行传导目前尚不清楚，尤其是内质网应激反应对成骨细胞的影响以及对骨溶解的治疗效果更是鲜有报道。

本实验发现，磨损微粒能够在体外诱导骨溶解的发生并抑制成骨细胞的分化成熟，同时磨损微粒还可以上调成骨细胞内质网应激反应标志蛋白以及促进骨组织中成骨细胞的凋亡；加入内质网应激的抑制剂(4-苯基丁酸)后，内质网应激标志蛋白的表达逐渐减弱，骨溶解和炎症浸润症状得到明

显改善，成骨细胞的凋亡显著减少，骨形态的完整性和成骨细胞的分化也得到恢复；然而，加入内质网应激的诱导剂毒胡萝卜素后骨溶解和炎症浸润症状明显加重，成骨细胞的凋亡和内质网应激反应显著增加，成骨细胞的分化也随之减少。因此，通过以上结果，可以认为内质网应激反应参与骨溶解的形成并在骨溶解的发生发展中发挥重要作用。因此，综合以上实验结果，作者认为，磨损微粒可以通过内质网应激反应诱导成骨细胞凋亡，从而在骨溶解的发生发展中发挥重要作用；同时，内质网应激可以作为一种新的治疗靶点，为临床逆转或治疗骨溶解和无菌性松动提供一种新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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内质网应激介导成骨细胞凋亡在骨溶解骨组织中的作用及机制

Endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis of osteoblasts within the osteolytic craniums

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[1]	耿秋东, 葛海雅, 王和鸣, 李楠. 基于网络药理学探讨龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1229-1236.
[2]	李时斌, 赖渝, 周毅, 廖建钊, 章晓云, 张璇. 激素性股骨头坏死发病机制及相关信号通路的靶点效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(6): 935-941.
[3]	徐银琴, 史红美, 王光义. 通痹方热敷联合针刺治疗对退变椎间盘细胞凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2 mRNA的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 713-718.
[4]	张雯雯, 金颂峰, 赵国梁, 宮丽鸿. 复方中药稳斑汤减少同型半胱氨酸诱导大鼠心肌微血管内皮细胞凋亡的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 723-728.
[5]	刘青, 万碧江. 针刀治疗胶原诱导性关节炎大鼠滑膜组织Bcl-2/Bax的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 729-734.
[6]	吴子健, 胡昭端, 谢有琼, 王峰, 李佳, 李柏村, 蔡国伟, 彭锐. 3D打印技术与骨组织工程研究文献计量及研究热点可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 564-569.
[7]	李晓壮, 段浩, 王伟舟, 唐志宏, 王旸昊, 何飞. 骨组织工程材料治疗骨缺损疾病在体内实验中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 626-631.
[8]	王秋霏, 顾叶, 彭育沁, 薛峰, 巨荣, 朱锋, 王熠军, 耿德春, 徐耀增. 人工假体磨损颗粒作用下Wnt/β-catenin信号通路对成骨细胞的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(24): 3894-3901.
[9]	唐小凯, 李伟明. Nel样分子1型蛋白在脊柱融合术后促进骨性融合的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(24): 3914-3920.
[10]	左振魁, 韩佳瑞, 计树灵, 贺璐璐. 银杏酮酯预处理减轻辐射所致模型小鼠的急性肠损伤[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3666-3671.
[11]	张亮, 马晓燕, 王佳虹. 肾衰饮调控慢性肾功能衰竭大鼠肾脏细胞凋亡的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3672-3677.
[12]	霍花, 程余婷, 周倩, 齐昱晗, 伍超, 石前会, 杨童景, 廖健, 洪伟. 种植体表面药物涂层对骨结合的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3558-3564.
[13]	陈崧, 何远丽, 谢雯佳, 钟林娜, 王剑. 磷酸钙纳米颗粒药物递送系统在骨组织工程研究与应用中的优势[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3565-3570.
[14]	张振华, 刘姿辰, 禹宝庆. 聚己内酯及其复合材料在组织工程骨构建中的地位与问题[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3571-3577.
[15]	蒋昇源, 李丹, 姜建浩, 杨上游, 杨淑野. 假体无菌性松动过程中Co2+对成骨前体细胞的生物学反应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(21): 3292-3299.