骨髓间充质干细胞联合益气养阴化瘀中药干预糖尿病下肢动脉再狭窄模型犬

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.18.015

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (18): 2872-2879.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.18.015

• 器官移植动物模型 organ transplantation and animal model • 上一篇下一篇

骨髓间充质干细胞联合益气养阴化瘀中药干预糖尿病下肢动脉再狭窄模型犬

成雪¹，王意忠¹，丁明超¹，崔晓兰²，王斌¹，王嘉¹，时翰¹，王立梅³

1北京大学航天临床医学院内分泌科，北京市 100049； 2中国中医科学院中药所药理室，北京市 100070；3北京市大兴区人民医院，北京市 102600

收稿日期:2014-03-16 出版日期:2014-04-30 发布日期:2014-04-30
作者简介:成雪，女，1986年生，河北省廊坊市人，汉族，北京大学在读硕士，主要从事干细胞治疗基础研究。
基金资助:
北京大学航天临床医学院科研基金资助项目(81273661)

Effects of bone marrow mesenchymal stem cells and benefiting-Qi nourishing-Yin and dissolving-congestion prescription on lower extremity arterial restenosis in model dogs with diabetes mellitus

Cheng Xue¹, Wang Yi-zhong¹, Ding Ming-chao¹, Cui Xiao-lan², Wang Bin¹, Wang Jia¹, Shi Han¹,Wang Li-mei³

1Department of Endocrinology, Aerospace Clinical Medical College of Peking University, Beijing 100049, China; 2Pharmacology Laboratory, Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100070, China; 3People’s Hospital of Daxing, Beijing 102600, China

Received:2014-03-16 Online:2014-04-30 Published:2014-04-30
About author:Cheng Xue, Studying for master’s degree, Department of Endocrinology, Aerospace Clinical Medical College of Peking University, Beijing 100049, China
Supported by:
the Scientific Research Project of Aerospace Clinical Medical College of Peking University, No. 81273661

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前大量研究已经证实了中药制剂、骨髓间充质干细胞在防治血管再狭窄中的有效性，但二者联合应用防治糖尿病下肢动脉介入成形后血管再狭窄的相关研究较少。
目的：观察骨髓间充质干细胞联合益气养阴化瘀中药对犬糖尿病股动脉介入成形后血管再狭窄的影响。
方法：采用四氧嘧啶静脉注射结合球囊损伤建立糖尿病下肢血管再狭窄犬模型，造模成功后将22只犬随机分为3组，即糖尿病模型组(模型组，n=6)、益气养阴化瘀方治疗组(中药组，n=8)及益气养阴化瘀方联合骨髓间充质干细胞治疗组(联合治疗组，n=8)。分别在经皮腔内血管成形前、治疗后1，2，4，8周采用ELISA法检测血清中血管内皮生长因子水平。治疗后8周取股动脉血管标本进行病理血管形态学观察及增生程度的定量分析，并取心肝肾胰腺组织标本行病理切片苏木精-伊红染色评价干细胞静脉移植安全性。
结果与结论：治疗后1周，中药组和联合治疗组血清血管内皮细胞生长因子均开始升高，模型组治疗后4周开始升高(与治疗前比较，P < 0.05)。同期各阶段，血清血管内皮细胞生长因子水平联合治疗组最高，模型组最低(P < 0.05)。血管增生程度定量分析结果显示，治疗后8周新生内膜面积、新生内膜/中膜面积及狭窄率，模型组最高，联合治疗组最低(P < 0.05)。干细胞移植安全性评价结果显示，治疗后8周心肝肾胰腺组织内部结构形态正常，未见组织坏死现象。综上，骨髓间充质干细胞联合益气养阴化瘀方比单纯中药治疗在防治糖尿病下肢动脉介入成形后再狭窄中作用更显著，是一种安全、有效的防治糖尿病下肢动脉介入成形后血管再狭窄发生的手段。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 组织构建, 骨髓间充质干细胞, 经皮动脉腔内成形, 再狭窄, 血管内皮细胞生长因子, 益气养阴化瘀方

Abstract:

BACKGROUND: At present, a great quantity of research has shown the effectiveness of traditional Chinese medicine and bone marrow mesenchymal stem cells for vascular restenosis. However, studies concerning their combined application to restenosis after percutaneous transluminal angioplasty with diabetes mellitus are presently lacking.
OBJECTIVE: To observe the effects of combined application of bone marrow mesenchymal stem cells and benefiting-Qi nourishing-Yin and dissolving-congestion prescription on restenosis after percutaneous transluminal angioplasty in dogs with diabetes mellitus.
METHODS: A dog model of vascular restenosis with diabetes mellitus was established by balloon injury of femoral artery and intravenous injection of alloxan. After successful model induction, 22 dog models were randomly divided into three groups: model group (n=6), treatment with Chinese medicine (n=8), and combined treatment with bone marrow mesenchymal stem cells and Chinese medicine (n=8). Serum vascular endothelial growth factor levels were measured using enzyme-linked immunosorbent assay preoperatively and at 1, 2, 4 and 8 weeks postoperation. Samples of vessels were taken to conduct pathomorphological observation and quantitative analysis of proliferation degree. Tissues, including heart, liver, kidney and pancreatic gland, were collected to evaluate the safety of stem cell transplantation using hematoxylin-eosin staining at 8 weeks postoperation.
RESULTS AND CONCLUSION: Serum vascular endothelial growth factor levels began to increase at 1 week postoperation in the Chinese medicine group and combined treatment group, at 4 weeks postoperation in the model group compared with preoperation (P < 0.05). At all time points, serum vascular endothelial growth factor levels were highest in the combined treatment group, but lowest in the model group (P < 0.05). Quantitative analysis of vascular proliferation demonstrated that at 8 weeks postoperation, new intimal area, new intimal/medial areas and stenosis rate were highest in the model group, but lowest in the combined treatment group at 8 weeks postoperation (P < 0.05). Safety assessment of stem cell transplantation showed morphological structures of the heart, liver, kidneys and pancreas were normal, no necrosis. In a word, the effects of the combined application of bone marrow mesenchymal stem cells and benefiting-Qi nourishing-Yin and dissolving-congestion prescription were much pronounced in preventing restenosis after percutaneous transluminal angioplasty in dogs with diabetes mellitus rather than single therapy of Chinese medicine. It is a safe and effective treatment to prevent vascular restenosis after percutaneous transluminal angioplasty in dogs with diabetes mellitus.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, vascular endothelial growth factors, drugs, Chinese herbal

中图分类号:

R318

成雪，王意忠，丁明超，崔晓兰，王斌，王嘉，时翰，王立梅. 骨髓间充质干细胞联合益气养阴化瘀中药干预糖尿病下肢动脉再狭窄模型犬[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(18): 2872-2879.

Cheng Xue, Wang Yi-zhong, Ding Ming-chao, Cui Xiao-lan, Wang Bin, Wang Jia, Shi Han,. Effects of bone marrow mesenchymal stem cells and benefiting-Qi nourishing-Yin and dissolving-congestion prescription on lower extremity arterial restenosis in model dogs with diabetes mellitus[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(18): 2872-2879.

图/表（结果） 4

2.1 骨髓间充质干细胞的鉴定流式细胞仪检测结果显示，CD45抗原的表达率是0.52%(图2A)；CD34抗原的表达率是2.02%(图2B)；CD105抗原的表达率是98.26%(图2C)，CD44抗原表达率是99.85%(图2D)，CD73抗原表达率是99.44%(图2E)，证实这些细胞是非造血系细胞。骨髓间充质干细胞CD44、CD105、CD73阳性和CD34、CD45阴性，纯度达95%以上。2.2 经皮腔内血管成形前后血清血管内皮细胞生长因子水平变化经皮腔内血管成形前各组血清血管内皮细胞生长因子水平相当，差异无显著性意义。治疗后1周开始，中药组和联合治疗组血清血管内皮细胞生长因子水平即开始升高(与治疗前比较，P < 0.05)，模型组血管内皮细胞生长因子水平治疗后1，2周与治疗前水平相当，差异无显著性意义；治疗后4周开始升高(与治疗前相比较，P < 0.05)。且同期各时间点血清中血管内皮细胞生长因子水平联合治疗组最高，中药组次之，模型组水平最低，三者之间比较，差异有显著性意义(P < 0.05，见表1、图3。

2.3 病理血管形态学观察光镜下，正常犬股动脉可见内膜层、中膜层和外膜层3层结构完整，界限分明。内膜光滑，内覆一薄层内皮细胞；中膜由平滑肌细胞围绕管腔环形排列构成；外膜层主要由结缔组织组成。内膜与中膜之间以内弹力板为界，呈波浪状；中膜与外膜间以外弹力板为界，内外弹力板完整(图4A)。模型组可见内皮大片缺损，动脉管壁内膜全周明显增厚，管腔严重狭窄，内弹力板断裂消失(图4B)；中药组可见内皮细胞部分缺损，内膜部分增厚，管腔略狭窄，内弹力板部分缺失(图4C)；联合治疗组镜下可见内皮细胞少量缺失，管壁局部区域轻度增厚，管腔轻度狭窄，内弹力板少量缺失(图4D)。各组新生内膜增生成分基本一致，以平滑肌细胞、成纤维细胞及基质增生为主。

2.4 血管增生程度定量分析经皮腔内血管成形后8周，新生内膜面积、新生内膜与中膜面积比值及狭窄率，模型组最高，中药组次之，联合治疗组最低，3组之间差异有显著性意义(P < 0.05)。原管腔面积及中膜面积，3组之间比较，数据经统计学分析，差异无显著性意义(表2)。

2.5 骨髓间充质干细胞静脉移植后各组织器官病理形态骨髓间充质干细胞静脉移植后第8周苏木精-伊红染色组织病理切片显示，糖尿病犬进行自体骨髓间充质干细胞移植后，心、肝、肾及胰腺器官中各组织结构清晰可见，形态结构正常，均未发生坏死、纤维化(图5)。

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引言

糖尿病下肢血管病变是糖尿病常见的严重的慢性并发症之一，目前已经成为非创伤性截肢的首要原因，严重影响了糖尿病患者生活质量。经皮腔内血管成形因其具有操作简便、有效、创伤小、恢复快等优势^[1]，目前已经广泛用于糖尿病下肢血管病变的治疗。但是经皮腔内血管成形后血管再狭窄率可高达70%^[2]。传统用于防治糖尿病下肢血管病变血管介入成形后远期再狭窄的手段主要包括药物治疗、基因治疗、血管内治疗(药物支架、血管内放射)等^[3]。但是这些方法均具有一定的局限性，均未在临床中证实能够有效抑制远期血管再狭窄^[4-8]。经皮腔内血管成形作为一种腔内操作手段，不可避免的损伤血管内皮，引发后期严重的血管内皮功能障碍及新生内膜增生等病理损伤修复反应，从而促进血管再狭窄^[9]。虽然内皮细胞本身也可激活损伤部位血管发生再内皮化，但这种修复作用启动晚，效果弱，不足以阻断后期血管再狭窄发生。因此如何尽可能恢复损伤血管内皮的结构和功能，延缓或者阻断内皮损伤后血管再狭窄发生的病理过程，促进有益的内皮再生，是治疗上亟待解决的难题。

干细胞技术是21世纪最先进的技术之一，干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，并在一定条件下，可以分化成多种功能细胞，例如血管细胞、血管内皮细胞、心肌细胞等。作为干细胞家族重要成员之一的骨髓间充质干细胞，其具有强大增殖能力和多向分化潜能；通过细胞间相互作用产生细胞因子发挥免疫调节作用；并且具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥，不涉及伦理问题等优势^[10-11]。近年研究表明，骨髓间充质干细胞具有促进损伤内皮快速修复和抑制新生内膜增生的作用^{[9, 12]}。因此，骨髓间充质干细胞近年来已经成为细胞移植修复损伤组织器官的最佳来源之一。大量实验及临床研究已经证实单药(丹参、川芎嗪等)及复方中药制剂(益气活血解毒方、血府逐瘀胶囊、益气养阴化瘀方等)在维持内皮细胞完整性、调节血管内皮细胞功能方面同样有益^[13-16]。

课题组前期研究已经完成中药益气养阴化瘀方在防治糖尿病下肢血管病变介入成形后远期血管再狭窄方面的研究，并证实重要复方制剂益气养阴化瘀方在防治血管远期再狭窄方面的有效性。因此文章建立犬糖尿病下肢血管损伤模型，静脉移植骨髓间充质干细胞联合益气养阴化瘀方，旨在探讨骨髓间充质干细胞联合中药益气养阴化瘀方在促进损伤血管内皮功能恢复及抑制内膜增生方面的作用及可能机制，并评价其可行性和安全性，为临床糖尿病下肢动脉介入成形后再狭窄干预治疗策略的制定提供动物实验依据。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2012年12月至2013年9月在北京大学航天临床医学院完成。

材料：

实验动物：18-20个月健康成年雄性Beagle犬22只，体质量(13.0±0.9) kg，由北京芳元缘养殖场提供，动物合格证：SCXK(京)2009-0014。实验过程中对动物处置符合2006年科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》的规定^[17]。

主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
胎牛血清、L-DMEM培养基	Gibco公司
胰蛋白酶、四氧嘧啶	Sigma公司
戊巴比妥钠粉末	北京华夏远洋生物科技有限公司
血管内皮细胞生长因子、内皮素、一氧化氮、ELISA试剂盒	上海Bluegene公司
犬PE-CD34、FITC-CD44、FITC-CD45、PE-CD73、APC-CD105、流式细胞仪	美国BD公司
Leica Qwin病理图像分析系统	德国Leica公司
酶联免疫检测仪	美国BioTek公司
球囊导管和手推式压力泵	美国Cordis公司

实验用药：益气养阴化瘀方由黄芪60 g、当归10 g、赤芍10 g、川芎10 g、地龙12 g、桃仁10 g、红花10 g、丹参30 g、水蛭9 g组成，全方共计191 g。由北京康仁堂药业有限公司制成颗粒，每袋25.7 g。

方法：

动物分组：将22只健康成年雄性Beagle犬按随机数字表法分为3组，即糖尿病模型组(模型组，n=6)、益气养阴化瘀方治疗组(中药组，n=8)及益气养阴化瘀方联合骨髓间充质干细胞治疗组(联合治疗组，n=8)。

糖尿病犬模型的制备：犬适应性喂养1周，禁食12 h，自由饮水。新鲜配制的200 g/L的四氧嘧啶溶液以50 mg/kg经下肢浅静脉注射^[18-19]。连续48 h监测随机血糖≥ 11.1 mmol/L，且血糖持续2周维持在此水平表明糖尿病犬造模成功^[20-21]。48 h后开始给予胰岛素进行治疗，定时监测血糖并根据血糖变化调整胰岛素用量。

下肢血管狭窄犬模型的制备：糖尿病犬模型血糖稳定2周，3%戊巴比妥钠溶液以1 mg/kg静脉麻醉后，5%硫化钠脱毛清洁消毒皮肤，选取右侧股动脉穿刺，置入导管鞘，送入0.035超滑导丝，选择适合球囊(血管直径/球囊直径为1∶1.2)，沿导丝送球囊至左侧股动脉处，充盈球囊后反复缓慢拖动3次，每次持续1 min，使左侧股动脉损伤长度大约为3 cm，术后穿刺点缝合加压包扎^[22-24]。

给药方法：模型组术前1周20 mL温生理盐水分2次灌胃。中药组术前1周益气养阴化瘀方颗粒25.7 g温盐水溶解至20 mL，分2次灌胃。联合治疗组术前1周益气养阴化瘀方颗粒25.7 g温盐水溶解至20 mL，分2次灌胃；骨髓间充质干细胞静脉移植时，以10 mL骨髓间充质干细胞悬液静脉注射^[25]。

骨髓间充质干细胞的分离与培养：无菌操作从Beagle犬髂骨抽取自体骨髓10 mL，与等体积PBS混合稀释后，缓慢平铺于10 mL淋巴细胞分离液上，通过密度梯度离心法(2 000 r/min，25 min)收集单个核细胞层，接种于含体积分数20%胎牛血清的L-DMEM培养基中，置于细胞培养瓶中，在体积分数5%CO₂饱和湿度和37 ℃的培养箱中静止培养。24 h后更换培养液，随后每周换液2次。当细胞相互汇合达90%的生长表面时，用0.25%的胰蛋白酶室内消化5-10 min，按1∶2比例传代培养^[26-30]。

骨髓间充质干细胞的鉴定：收集第4代犬骨髓间充质干细胞，PBS洗涤3次，调节细胞浓度至1×10⁷ L^-¹，分装至1.5 mL eppendorf管中，每管500 μL，分别加入犬PE-CD34、FITC-CD44、FITC-CD45、PE-CD73、APC-CD105单克隆抗体，工作浓度为1∶100、室温下孵育15 min，PBS洗涤3次后使用流式细胞仪进行检测^[31-34]。

骨髓间充质干细胞的移植：下肢动脉介入球囊成形损伤后即刻将骨髓间充质干细胞的细胞悬液10 mL(细胞数1×10⁷ L^-¹)经Beagle犬下肢浅静脉注射至联合治疗组犬体内，模型组及中药治疗组静脉注射等体积PBS培养液^{[21, 25]}。

血清学指标检测：于经皮腔内血管成形前及成形后1，2，4，8周分别采集各组犬清晨空腹外周血标本，3 000 r/min，离心10 min后，将血清分装到1.5 mL eppendorf 管中， -20 ℃冰箱中冻存。采用ELISA方法检测血清中血管内皮细胞生长因子水平，按照试剂盒说明书进行操作。

血管病理组织形态学观察及增生程度定量分析：经皮腔内血管成形后8周处死动物，取左侧损伤侧及对侧长度约3 cm股动脉血管标本，40 g/L多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋。石蜡块制成5 μm组织切片经苏木精-伊红染色后光学显微镜下进行血管病理形态学观察，并使用Leica Qwin图像分析系统定量分析测定下列指标：新生内膜面积、中膜面积、管腔面积、计算内膜/中膜面积比、狭窄率(图1)^{[15, 35]}。内膜面积为血管腔表面与内弹力板之间的截面积；中膜面积为内弹力板与外弹力板之间的截面积；内膜/中膜面积比即增生内膜面积/中膜面积；原管腔面积为内弹力板围绕面积；狭窄率为增生内膜面积/原管腔面积。

各组织器官病理形态观察：经皮腔内血管成形后8周，取心肝肾胰腺组织标本行病理切片苏木精-伊红染色，评价干细胞静脉移植在各组织器官的安全性。

主要观察指标：分别在经皮腔内血管成形前、术后 1，2，4，8周采用ELISA法检测血清中血管内皮生长因子水平。术后8周取股动脉血管标本进行病理血管形态学观察及增生程度的定量分析，并取心肝肾胰腺组织标本行病理切片苏木精-伊红染色评价干细胞静脉移植安全性。

统计学分析：采用SPSS 13.0 for windows软件进行统计学分析，实验数据经正态分布检验后以x(_)±s表示，均数间的比较经方差齐性检验后以单因素方差分析统计结果，P < 0.05为差异有显著性意义。

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3.1 骨髓间充质干细胞在防治糖尿病下肢动脉介入成形后再狭窄中的作用球囊介入治疗在糖尿病下肢血管病变中的应用，会导致不同程度血管内皮细胞损伤。由于内皮细胞损伤是远期血管发生再狭窄的始动因素，一旦发生可以引发后期血管基质暴露，平滑肌细胞活化、迁移及增殖，促进内膜增生及血管再狭窄等一系列恶性循环。因此采用有效手段促进血管内皮细胞功能尽快恢复至关重要。血管内皮细胞生长因子是一种重要的促进内皮细胞生长的关键因子，其促进损伤血管内皮加速修复，从而延缓或者阻断损伤内皮介导的平滑肌细胞的增殖、迁移及新生内膜的增生。Folkman等^[36]的研究显示血管内皮细胞生长因子特异性强，仅作用于内皮细胞，促进损伤内皮细胞快速修复，而不促进平滑肌细胞的增殖。其作用机制可能通过增加内皮细胞血管舒张因子一氧化氮的释放，调节血管正常舒缩功能^[37]。本文中行血管内皮细胞生长因子定量测定，结果显示中药组与联合治疗组均可以通过升高血清中血管内皮细胞生长因子水平在防治经皮腔内血管成形后再狭窄中起效。但是中药组血管内皮细胞生长因子术后1周水平与模型组基本相当，差异无显著性意义；而联合治疗组在术后1周血管内皮细胞生长因子水平即检测到显著升高(与术前、中药组、模型组相比较，P < 0.05)。本实验采用图像分析仪对血管增生面积定量分析结果显示，模型组、益气养阴化瘀方中药组和骨髓间充质干细胞联合益气养阴化瘀方中药组血管内膜增生面积、内膜/中膜面积比值及狭窄率，模型组最高，中药组次之，联合治疗组最低(3组之间比较， P < 0.05)。本课题组前期研究已经证实中药益气养阴化瘀方能够通过降低球囊介入成形后急性期血清血小板源生长因子水平，抑制血管再狭窄发生机制中“动脉内皮损伤”启动诱发的血管内膜增生；降低强效缩血管因子内皮素水平，明显改善血管内皮细胞功能；抑制诱导型一氧化氮合酶介导的细胞毒性一氧化氮的释放，促进远期内皮型一氧化氮合酶诱导的生理性一氧化氮水平升高等机制抑制损伤血管内膜的增生。本实验进一步证实中药益气养阴化瘀方还可通过上调球囊介入成形后血清中血管内皮细胞生长因子水平，改善血管内皮功能，促进损伤血管内皮尽快修复，从而在防治糖尿病下肢血管远期再狭窄中起效。本实验在前期研究基础上，鉴于骨髓间充质干细胞的特征及优势，增加骨髓间充质干细胞联合中药组，实验证实联合治疗组反应血管内膜增生的各项指标均显著低于单纯中药治疗组(P < 0.05)。联合治疗组球囊介入成形后血清血管内皮细胞生长因子上调速度较之单纯中药组速度更快，血清血管内皮细胞生长因子水平更高(P < 0.05)。

综上，即骨髓间充质干细胞也可通过干预血清球囊介入成形后血清血管内皮细胞生长因子水平及血管再狭窄中相关机制，在防治糖尿病下肢血管再狭窄中同样有益。同时结合其他体内外实验结果作者推测骨髓间充质干细胞干预血管再狭窄的机制可能为：①静脉移植的骨髓间充质干细胞归巢至球囊损伤部位，在特定微环境中直接分化为内皮细胞，以补充血管毁损内皮，抑制内膜增殖。目前大量基础研究在体外实验中已经证实，骨髓间充质干细胞经血管内皮细胞生长因子等多种因子诱导刺激，能够在定向诱导分化为血管内皮细胞^[38-40]。同时Silva等^[41]的体内试验研究证实骨髓间充质干细胞在心肌缺血组织中能够定向分化为内皮细胞。本文由于未将静脉移植骨髓间充质干细胞进行示踪标记，进一步确定骨髓间充质干细胞归巢至损伤血管内皮部位，并分化为血管内皮细胞，因此尚有不足之处。②骨髓间充质干细胞分泌细胞因子和生长因子，促进损伤部位附近正常内皮细胞向损伤部位迁移及增殖能力，促进损伤内皮细胞结构和功能的恢复，快速补充毁损内皮细胞，延缓或阻断内皮细胞损伤激发的平滑肌细胞增殖、迁移和新生内膜的增生，进而降低血管再狭窄的发生。③间充质干细胞具有旁分泌作用，能够分泌促进损伤血管内皮快速修复及生长的关键因子血管内皮细胞生长因子，有效快速修复毁损内皮，延缓损伤血管内皮介导的平滑肌细胞增殖，阻断血管内膜增殖，从而防止远期血管再狭窄。综上可见，在中药治疗基础上联合骨髓间充质干细胞，能够通过多种机制更快的促进血管内皮细胞功能的恢复。

综上所述，本文采用球囊介入成形治疗构建糖尿病犬下肢血管再狭窄模型，通过对治疗前后血清血管内皮细胞生长因子水平及血管内膜增生程度的测定，对比单纯中药治疗组及联合治疗组防治血管再狭窄的有效性，证实骨髓间充质干细胞静脉移植治疗，在一定程度上可促进损伤内皮快速修复，延缓损伤内皮介导的平滑肌细胞增殖、迁移，从而抑制血管内膜增生，在防治糖尿病下肢动脉介入成形后血管再狭窄中有效。骨髓间充质干细胞可能通过归巢至损伤血管内皮，定向分化为血管内皮细胞或促进外周正常内皮向损伤部位迁移和增殖，还可通过旁分泌效应上调血管内皮细胞生长因子水平这些机制促进血管内皮快速修复，抑制血管内膜增生。此研究结果为临床上血管成形后防治血管再狭窄提供了重要的动物学实验数据。本文尚有不足之处，如未将静脉移植的骨髓间充质干细胞进行有效标记和体内示踪，进一步证实骨髓间充质干细胞归巢至动脉损伤部位并分化为血管内皮细胞。

3.2 骨髓间充质干细胞静脉移植安全性评价本实验联合治疗组在经皮腔内血管成形后即刻静脉移植骨髓间充质干细胞，术后8周，心、肝、肾及胰腺组织病理形态学光镜下观察内部组织形态正常，未见坏死现象。提示骨髓间充质干细胞联合中药治疗是一种安全、有效的防治糖尿病下肢动脉介入成形后血管再狭窄发生的良好手段。

骨髓间充质干细胞联合益气养阴化瘀中药干预糖尿病下肢动脉再狭窄模型犬

Effects of bone marrow mesenchymal stem cells and benefiting-Qi nourishing-Yin and dissolving-congestion prescription on lower extremity arterial restenosis in model dogs with diabetes mellitus

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