以交联透明质酸钠为支架体外构建组织工程软骨

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.08.008

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (8): 1191-1197.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.08.008

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以交联透明质酸钠为支架体外构建组织工程软骨

刘少英¹，陈建英¹，陈倩倩¹，刘飞¹，刘霞¹，朱希强¹，凌沛学^1，2

1山东省生物药物研究院，山东省生物药物重点实验室，山东省济南市 250101；2山东福瑞达医药集团公司，山东省黏膜与皮肤给药技术重点实验室，山东省济南市 250101

收稿日期:2013-12-05 出版日期:2014-02-19 发布日期:2014-02-19
通讯作者: 凌沛学，研究员，山东省生物药物研究院，山东省济南市 250101；山东福瑞达医药集团公司，山东省济南市 250101
作者简介:刘少英，女，1986年生，河南省安阳市人，汉族，2011年山东大学生命科学学院毕业，硕士，现在就职于山东省生物药物研究院，助理工程师，主要从事细胞培养，组织工程研究。
基金资助:
山东省优秀中青年科学家科研奖励基金(BS2011YY050)；济南市高校院所自主创新计划(201202038)

Construction of tissue-engineered cartilage with cross-linked sodium hyaluronate as scaffold materials in vitro

Liu Shao-ying¹, Chen Jian-ying¹, Chen Qian-qian¹, Liu Fei¹, Liu Xia¹, Zhu Xi-qiang¹, Ling Pei-xue^{1, 2}

1Institute of Biopharmaceuticals of Shandong Province, Shandong Provincial Key Laboratory of Biology and Pharmacology, Jinan 250101, Shandong Province, China; 2Shandong Freda Pharmaceutical Group Company, Shandong Provincial Key Laboratory of Mucosal and Transdermal Drug Delivery Technologies, Jinan 250101, Shandong Province, China

Received:2013-12-05 Online:2014-02-19 Published:2014-02-19
Contact: Ling Pei-xue, Investigator, Institute of Biopharmaceuticals of Shandong Province, Jinan 250101, Shandong Province, China; Shandong Freda Pharmaceutical Group Company, Shandong Provincial Key Laboratory of Mucosal and Transdermal Drug Delivery Technologies, Jinan 250101, Shandong Province, China
About author:Liu Shao-ying, Master, Assistant engineer, Institute of Biopharmaceuticals of Shandong Province, Shandong Provincial Key Laboratory of Biology and Pharmacology, Jinan 250101, Shandong Province, China
Supported by:
Promotional Research Fund for Excellent Young and Middle-Aged Scientists of Shandong Province, No. BS2011YY050; the Independent Innovation Plan in Universities of Shandong Province, No. 201202038

摘要/Abstract

摘要：

背景：采用组织工程技术再生和重建软骨是目前修复软骨组织缺损效果最好、最有应用前景的方法。
目的：以体外培养的软骨细胞和交联透明质酸钠为支架材料，开发一套体外构建组织工程软骨的完整方案。
方法：分离新西兰兔膝关节软骨细胞，制成细胞悬液滴加于交联透明质酸钠支架上，体外复合培养21 d，提取RNA进行RT-PCR检测，制备冰冻切片进行显微观察和免疫组织化学观察。
结果与结论：软骨细胞接种于交联透明质酸钠支架材料后，可贴附于支架上生长，并且大量细胞聚集成团，在支架材料的纤维间隙中生长或呈单层细胞附着于支架材料纤维。细胞-支架复合物表达软骨组织特异性蛋白聚糖基因和Ⅱ型胶原α1基因，以及软骨组织特异性蛋白Ⅱ型胶原蛋白，可维持软骨细胞表型。表明培养的细胞-支架复合物在体外培养可形成软骨细胞外基质，有望获得组织工程软骨组织。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 软骨生物材料, 组织工程, 关节软骨, 支架材料, 软骨细胞, 分离培养, 免疫细胞化学, RT-PCR, 形态学观察, 交联透明质酸钠, 体外

Abstract:

BACKGROUND: Tissue engineering provides new ideas and approaches for repair of cartilage defects.
OBJECTIVE: To develop a complete set of solutions for construction of tissue engineered cartilage in vitro, with chondrocytes as seed cells and cross-linked sodium hyaluronate as scaffold materials.
METHODS: New Zealand rabbit articular chondrocytes were isolated, counted, and then cultured and passaged to prepare cell suspension. Toluidine blue staining, RT-PCR and immunocytochemistry were exerted to evaluate the cultured cells. Chondrocytes were seeded and co-cultured with cross-linked sodium hyaluronate scaffold for 21 days. Then, RNA was isolated for RT-PCR, and frozen sections were prepared for morphological observation and immunohistochemistry study.
RESULTS AND CONCLUSION: The chondrocytes could adhere to the cross-linked sodium hyaluronate scaffold and aggregate, growing between fibers or adhering to the scaffold in a monolayer manner. The transcripts of cartilage specific aggrecan gene and collagen type II alpha 1 gene and cartilage specific protein collagen type II were expressed in cell-scaffold complexes to maintain the phenotype of chondrocytes. Cell-scaffold complexes co-cultured in vitro can form cartilage extracellular matrix, by which tissue engineered cartilage is expected to be obtained.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: biocompatible materials, chondrocytes, hyaluronic acid, cross-linking reagents

中图分类号:

R318

刘少英，陈建英，陈倩倩，刘飞，刘霞，朱希强，凌沛学. 以交联透明质酸钠为支架体外构建组织工程软骨[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(8): 1191-1197.

Liu Shao-ying, Chen Jian-ying, Chen Qian-qian, Liu Fei, Liu Xia, Zhu Xi-qiang, Ling Pei-xue. Construction of tissue-engineered cartilage with cross-linked sodium hyaluronate as scaffold materials in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(8): 1191-1197.

图/表（结果） 4

2.1 软骨细胞的分离培养血球计数板统计细胞得率，每只兔子收获1.5×10⁷个软骨细胞。锥虫蓝染色2 min统计细胞存活率，能被染成蓝色的细胞，即死亡细胞的比例为2%，计算可知分离到的软骨细胞的存活率为98%。分离的软骨细胞接种培养7 d，细胞丰度达到90%，按照1∶3比例传代，此后每3 d传代1次。以上结果显示，胰酶-胶原酶分步消化得到的兔膝关节软骨细胞存活率高，体外培养的生长速度快，具有良好的细胞活性。

2.2 软骨细胞的鉴定

细胞形态观察：分离获得的软骨细胞体外培养48 h，细胞贴壁良好(图1A1)。体外传代3次后，细胞形态维持不变，胞体呈梭形或多角形，形状饱满，局部呈聚簇生长，胞外基质丰富(图1A2)。

甲苯胺蓝染色：软骨细胞体外传代3次，甲苯胺蓝染色结果(图1B)，细胞整体染成蓝色，细胞核着色较深，细胞内外均有蓝紫色异染颗粒。

RT-PCR检测蛋白聚糖基因与Ⅱ型胶原α1基因的mRNA：同步提取体外培养软骨细胞与阴性对照Balb/3T3细胞的RNA，进行RT-PCR检测(图2)，Balb/3T3细胞中，出现内参基因gapdh的mRNA，而未出现软骨组织特异性基因蛋白聚糖基因与Ⅱ型胶原α1基因相应的mRNA；体外培养传代二三次的软骨细胞中，这两种软骨组织特异性基因的mRNA能够维持表达，且表达水平基本维持不变。

免疫细胞化学检测Ⅱ型胶原蛋白的表达：空白对照组细胞表现免疫反应的DAB显色呈阴性结果，在苏木精染液的作用下，细胞核呈蓝紫色，细胞质与胞外基质着色较浅(图3A)。经DAB显色的实验组细胞大部分区域显示褐色 (图3B)，信号较强的区域呈鲜红色，在低倍显微镜下大部

分区域呈现艳红色(图3C)，说明被检测细胞能够大量表达软骨组织特异性蛋白Ⅱ型胶原蛋白。

2.3 组织工程软骨组织的构建与鉴定

大体观察：细胞-支架复合培养物体外培养21 d，支架材料的结构基本保持完整，局部区域形成乳白色、半透明的组织块，质地细腻，表面光滑，呈现出典型的透明软骨组织的表观特征(图4A)。

冰冻切片观察：冰冻切片显微图像(图5)显示，种子细胞能够帖附在支架上生长，大量细胞聚集成团，在支架材料的纤维间隙中生长，或者呈单层细胞附着于支架材料纤维。

软骨组织特异性基因的转录：细胞-支架复合培养物的检测结果见图4B1、B2，阴性对照Balb/3T3细胞中可见内参基因gapdh的转录，未见软骨组织特异基因蛋白聚糖基因与Ⅱ型胶原α1的转录；细胞-支架复合培养物中可见软骨组织特异性基因蛋白聚糖基因与Ⅱ型胶原α1的转录。

软骨组织特异性蛋白的表达：支架-细胞复合培养物的冰冻切片免疫组织化学检测结果见图6，由图可见体外

培养的复合物能维持表达软骨组织特异性蛋白Ⅱ型胶原蛋白。

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引言

先天畸形、外伤、风湿等引起的各类软骨损伤在临床上十分常见，给患者造成了巨大的痛苦。由于正常的关节软骨没有神经及血管组织，其营养主要依靠弥散机制，从滑膜分泌的滑液中摄取。关节软骨细胞代谢缓慢，软骨组织再生能力极低，关节软骨损伤后的修复主要依靠细胞的反应性增殖，这种修复难以恢复正常关节软骨的功能，而且，随着年龄增长，这种自身修复能力逐渐下降。因此，软骨组织一旦发生损伤，即可成为永久性病变^[1-2]。

近年来，关节软骨修复与重建一直是骨科研究领域的热点。目前，软骨缺损的修复方法主要有4种：第1种，自体或异体软骨组织块移植，该法效果较好，但缺陷在于供体来源有限，此外还存在移植软骨与在体软骨难以弥合的问题；第2种，自体软骨细胞移植，该法目前已实现临床应用^[3]，1997年通过了FDA认证，将自体软骨细胞悬液直接注射于软骨组织缺损处，用于修复股骨髁负重面局部创伤性损伤^[4]，该法的缺陷在于细胞容易从损伤处逃逸而流失，且容易引起关节纤维化等并发症^[5]；第3种，生物支架植入^[6]，在组织缺损位置植入支架材料，诱导缺损处增生的细胞保持软骨细胞特性，该法技术尚不成熟，其修复效果还需要长期随访研究；第4种，组织工程修复，采用组织工程技术再生和重建软骨是目前修复软骨组织缺损效果最好、最有应用前景的方法。将种子细胞接种于合适的支架，在体外共同培养，形成具有软骨生成能力的细胞-支架复合物，经过塑形之后植入体内组织缺损部位，随着支架材料的降解，种子细胞不断增殖和分泌细胞外基质，逐渐形成新生软骨组织，与机体组织整合在一起，使软骨缺损得到修复。该法有效避免了前3种方法的缺陷，已成为近年来治疗软骨损伤的发展方向^[7]。

组织工程软骨技术的关键在于两个问题：种子细胞的开发和关节软骨支架材料的选择。目前应用于构建组织工程软骨组织的种子细胞主要有3类，软骨细胞、成纤维细胞和干细胞^[8]。由于异体软骨细胞存在免疫排斥的问题，考虑临床安全性和构建组织工程软骨的高效性，自体软骨细胞是软骨组织工程种子细胞的最佳选择。因此自体软骨细胞是当前组织工程研究中最常用的种子细胞来源。其局限性在于软骨细胞来源有限，且在体外培养传代过程中会逐渐发生去分化现象，可能的原因有多种，例如体外培养难以模拟天然软骨组织的立体结构，压力效应，缺少必须的细胞因子等^[9]。一般认为体外培养4代以内可保持软骨细胞特性^[9]。成纤维细胞来源充足，便于采集，但是植入软骨缺损区域后生成的纤维组织不同于软骨组织，无法完全恢复软骨功能^[10]。有研究报道，在种子细胞培养培养过程中加入特定的细胞因子，可诱导其向软骨细胞方向转变^[8]。干细胞体外培养技术成熟，且可多次传代大量扩增，但同样需要特定细胞因子诱导其形成软骨细胞^[8,11]。3类种子细胞各有优缺点，何种来源的细胞作为软骨组织工程的首选种子细胞目前仍有争议。

组织工程软骨的性能优劣与支架材料的性质紧密相关。合格的支架应该具备以下特征：良好的生物相容性、可降解性，疏松多孔的三维结构，能够支持细胞黏附与增殖^[12]。支架材料分为天然生物材料、人工合成高分子材料和复合材料3类^[9]。透明质酸是软骨基质成分之一，为多糖类生物大分子，是天然生物材料的一种，具有优良的生物相容性和生物可降解性。作者所在单位对透明质酸及其衍生物的应用研究有一定基础^[13-15]，所制备交联透明质酸钠材料的理化性质符合组织工程支架的一般要求。实验期望通过建立相对简单的技术流程，为获得质量可靠的组织工程软骨奠定基础。

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材料方法

设计：原代细胞培养、种子细胞与支架材料复合培养、组织工程软骨的鉴定。

时间及地点：于2011年10月至2012年9月在山东省生物药物研究院完成。

材料：

实验动物：4周龄新西兰白兔，体质量500-600 g，雌雄不拘，来源于济南西岭角养殖繁育中心。

构建组织工程软骨实验的主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
胶原蛋白酶Ⅱ	SIGMA-C6885, Sigma-Aldrich® Corporation
胎牛血清、DMEM/F12培养基	Hyclone, Thermo Fisher Scientific
CO₂培养箱	Heracell 240i, Thermo Fisher Scientific Inc.
多聚甲醛溶液、甲苯胺蓝染色液	上海生工生物工程股份有限公司
光学显微镜	Nikon Corporation
Balb/3T3细胞	中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心
Trizol	北京天根生化科技有限公司
反转录试剂盒	TAKARA，大连宝生物工程有限公司
免疫组织化学试剂盒、蛋白Collagen Ⅱ的单克隆抗体、山羊抗兔单克隆抗体	上海碧云天生物技术研究所
DAB显色试剂盒	北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司
切片机	MICROM HM550，德国

支架：采用1，4-丁二醇二缩水甘油醚为交联剂，使用二次冷冻干燥法制备交联透明质酸支架，第1次冷冻干燥将混有交联剂的透明质酸钠凝胶成型，第2次冷冻干燥将反应、溶胀、纯化后的凝胶再次成型。通过调节透明质酸钠的浓度、交联剂投入量、冷冻干燥的温度、交联反应的温度和时间，控制所得支架的孔径、孔隙率和交联程度，实验采用的支架平均孔径为145 μm，孔隙率为94.8%，交联程度以体外抗酶降解性表示(底物5 mg，透明质酸酶浓度 48 U/mL，温度37 ℃，降解时间2 h，剩余支架占支架总量的百分数为32.75%)。

实验方法：

关节软骨细胞的分离和体外培养：空气栓塞法处死新西兰白兔，截取膝关节，无菌刮取关节表面的软骨层，剪碎至约1 mm³大小的颗粒。加入0.25%胰酶5 mL，37 ℃振荡消化20 min，弃上清后加入0.4%胶原蛋白酶Ⅱ 5 mL，37 ℃消化300 min，用150目细胞筛收集游离出的软骨细胞^[16]。

将收集到的软骨细胞重悬于含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，用血球计数板计数，锥虫蓝染色统计细胞存活率。按照3×10⁸ L^-1的细胞浓度接种，置于CO₂培养箱中，于37 ℃，体积分数5%CO₂的条件下培养，待细胞生长至80%融合时，按照1∶3比例传代。体外传代3次。

种子细胞的鉴定：

甲苯胺蓝染色^[17]：将软骨细胞接种于24孔板中，培养至80%融合时弃培养液，加入40 g/L多聚甲醛溶液固定2 h，用甲苯胺蓝染色液染色3 min，吸出染色液，光学显微镜下观察。甲苯胺蓝为碱性染料，易结合酸性物质而着色，蓝紫色异染颗粒的存在，显示细胞能够合成并分泌酸性多糖为软骨细胞的特征之一。

RT-PCR检测：参考文献[18]方法，选择甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(gapdh)作为内参，检测培养细胞中软骨组织特异基因蛋白聚糖基因和Ⅱ型胶原α1基因的mRNA。

用Primer Premier软件，对每个基因分别设计一对引物，使每对引物都不在同一个外显子上，以便排除DNA污染造成的假阳性结果。引物序列由上海生工生物有限公司合成。

RT-PCR检测用到的基因与各自的引物：
基因名称	NCBI序列号	引物名称与序列	产物长度
gapdh	NM_001195671.1	GAPDH-455F：CAT GTT TGT GAT GGG CGT GAPDH-954R：GAA GGT AGA GGA GTG GGG	500 bp
蛋白聚糖基因	XM_002723376.1	AGAN-1945F：GCC TGC GGT GGG GAT AAA AGAN-2430R：GTC GGG GGG CAC AGA TGT	486 pb
Ⅱ型胶原α1基因	NM_001195671.1	COL2A1-187F：CTG TGC GAC GAC ATA ATC OL2A1-603R：GCC TTG CAT CAC TCC CAT	417 bp

设置Balb/3T3细胞为阴性对照，收集正常培养的细胞，每组约1×10⁷个细胞，弃去培养液，加入RNA提取剂Trizol，提取细胞总RNA，用反转录试剂盒制备cDNA。以cDNA为模板，用上述3对引物，分别PCR扩增以上3个基因的片段，琼脂糖凝胶电泳检测结果。

免疫细胞化学：参考文献[18]方法，检测培养细胞中软骨组织特异性蛋白Ⅱ型胶原蛋白的表达情况。将细胞接种于24孔板，培养至铺满皿底。PBS冲洗2次，95%丙酮固定30 min，按照免疫组织化学试剂盒的说明书操作，设置空白对照孔，对照孔不加一抗，实验孔使用的一抗为蛋白Collagen Ⅱ的单克隆抗体，二抗为山羊抗兔单克隆抗体，DAB显色试剂盒显色，用苏木精复染，在光学显微镜下观察染色结果。

细胞与支架材料复合培养：

制备种子细胞悬液：0.25%胰酶消化并收集体外培养的软骨细胞重悬于胎牛血清中，调整细胞浓度至6×10¹⁰ L^-1。

种子细胞与支架的复合培养：将无菌的交联透明质酸钠支架材料剪成10 mm×5 mm×2 mm的小块，分别置于直径10 cm的细胞培养皿中。将种子细胞悬液滴加于支架上，直至饱和。37 ℃正常培养180 min。加入10 mL含体积分数20%胎牛血清的DMEM/F12培养基，置于CO₂培养箱中，每天更换培养液，培养21 d^[19]。

组织工程软骨的鉴定：

制备冰冻切片：将细胞-支架复合培养物加入OCT冰冻切片包埋剂中，置-20 ℃切片机中包埋10 min后进行切片，切片厚度10 μm，将切片固定到多聚赖氨酸处理过的载玻片上。

光学显微镜观察：苏木精染色，观察种子细胞在支架上的贴附生长情况。

检测蛋白Ⅱ型胶原蛋白的表达：以未接种细胞的支架材料为阴性对照，做冰冻切片，用40 g/L多聚甲醛固定2 h，按照免疫组织化学试剂盒说明书操作，进行免疫杂交实验，在光学显微镜下观察染色结果。

检测蛋白聚糖基因与Ⅱ型胶原α1基因的转录：在细胞-支架复合培养物中加入RNA提取剂，磨碎，提取总RNA，按前述RT-PCR方法进行，琼脂糖凝胶电泳检测结果。

主要观察指标：细胞支架复合物的显微观察和免疫组织化学观察及RT-PCR检测结果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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讨论

以关节软骨细胞作为组织工程软骨的种子细胞，具有操作便捷，可行性强的优点。实验结果显示：在原代软骨细胞分离步骤中采用胰酶-胶原酶分步酶消化法，操作过程简单，所得细胞生命力好，存活率达98%以上；在细胞传代培养步骤中，用DMEM/F12培养液常规培养即可，不需要添加特殊的生长因子或促分化因子，细胞增殖快，传代3次细胞增殖数量即可满足接种要求；对传代细胞的表型鉴定结果显示，分离的软骨细胞传代3次，细胞表观形态未见明显变化，能够转录软骨组织特异性基因蛋白聚糖基因与Ⅱ型胶原α1的mRNA和软骨组织特异性蛋白Ⅱ型胶原蛋白，表明原代软骨细胞体外培养传代3次之后仍具有软骨细胞的特征，类似研究结果与Chua等^[20]报道一致。

但软骨细胞体外传代3次之后，随着传代次数增多，是否发生去分化现象，采取何种措施可以预防软骨细胞的去分化，保持其软骨形成能力；以及去分化的细胞能否再次诱导分化作为组织工程软骨的种子细胞等问题，公开文献报道尚无定论，是下一步工作的方向和重点。

交联透明质酸钠材料作为组织工程软骨细胞支架，临床应用潜力较大。交联透明质酸钠支架材料的主要成分为透明质酸，是一种软骨基质中的固有成分，已有研究证明透明质酸具有保护、润滑关节和促进软骨细胞增殖的作用^[21-22]。目前，透明质酸钠注射液已作为临床治疗骨性关节炎的常规药物，其有效性和安全性已获公认^[23-24]，采用 1，4-丁二醇二缩水甘油醚交联的透明质酸钠也已被开发为皮肤填充材料和关节腔注射剂应用于临床^[25-26]。例如有研究观察透明质酸钠关节腔内注射治疗膝骨性关节炎的临床效果及治疗前后关节液中自由基和炎性递质含量的变化，试验选择92例(111膝)膝骨性关节炎患者，分轻度组51膝，中度组35膝，重度组25膝；关节内每周注射透明质酸钠 20 mg/次，共5次，按Lysholm膝关节功能评分比较治疗前后关节症状和功能的改善情况，并测定透明质酸钠注射前第1，2，5周和注射后3个月关节液中NO、超氧化物歧化酶、丙二醛和白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α的含量。结果显示随访3个月，病情越轻治疗见效越早，疗效越好，透明质酸钠治疗后轻、中度组患者关节液中氧自由基含量和白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α含量明显下降(P < 0.05)，重度组变化不显著(P > 0.05)；透明质酸钠对NO含量影响较小，只有轻度组治疗后3个月较治疗前明显减少 (P < 0.05)，中、重度组变化不大(P > 0.05)，说明透明质酸钠关节腔内注射治疗膝骨性关节炎可缓解临床症状，改善关节功能，其作用可能是通过降低关节液中自由基和白细胞介素1、肿瘤坏死因子α等炎性递质的水平而实现的。适度的化学交联改变了材料在水溶液中的溶解性，提高了材料的抗酶降解性，延长其在体内滞留时间，采用特殊的制备工艺赋予材料多孔结构和一定的机械强度，以适应细胞附着生长的需求。

实验结果显示：交联透明质酸钠支架材料亲水性好，支架与种子细胞经过复合培养，局部区域呈现出典型的透明软骨组织表观特征。种子细胞能够贴附在支架材料上生长，软骨组织特异性基因蛋白聚糖基因与Ⅱ型胶原α1能够维持转录，软骨组织特异性蛋白Ⅱ型胶原能够维持表达。表明交联透明质酸钠能够支持种子细胞生长并形成软骨组织的细胞外基质，适合作为组织工程软骨的支架材料。

与目前临床应用的胶原支架材料相比，商品透明质酸钠现已实现发酵法大规模生产^[27]，交联透明质酸钠支架材料的原料方便易得，成本较低，不含免疫原性杂质和其他动物来源的病原体。因此，交联透明质酸钠作为组织工程软骨支架材料具有良好应用的前景。

实验建立了一套完整、简洁的方案，从种子细胞的获取、支架材料的制备到组织工程软骨的构建，该方案不仅可用于组织工程软骨的制备，为其临床应用于软骨缺损修复奠定基础；而且可作为一个平台，用于评价和筛选适用于软骨组织工程的种子细胞和支架材料。在下一步的工作中将继续改进种子细胞的接种和培养条件，使细胞在支架材料上均匀贴附和生长，加快培养细胞外基质的分泌，提高组织工程软骨在表观和功能上与自体软骨的一致性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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以交联透明质酸钠为支架体外构建组织工程软骨

Construction of tissue-engineered cartilage with cross-linked sodium hyaluronate as scaffold materials in vitro

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