热缺血损伤对大鼠心脏死亡供肝线粒体形态和功能的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.05.005

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (5): 681-686.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.05.005

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热缺血损伤对大鼠心脏死亡供肝线粒体形态和功能的影响

刘树荣¹，余斌²，焦保平¹，刘永锋¹

¹中国医科大学附属第一医院普通外科教研室，器官移植科，辽宁省沈阳市 110001；²沈阳市第一人民医院外二科，辽宁省沈阳市 110041

修回日期:2013-11-04 出版日期:2014-01-29 发布日期:2014-01-29
作者简介:刘树荣，女，1962年生，辽宁省沈阳市人，汉族，1986年中国医科大学毕业，硕士，副教授，主要从事肝胆外科、器官移植方面的研究。
基金资助:
辽宁省教育厅创新团队项目(2009T104)；卫生部行业专项基金资助项目(201002004)

Impact of warm ischemia injury on mitochondrial morphology and function of rat donor liver after cardiac death

Liu Shu-rong¹, Yu Bin², Jiao Bao-ping¹, Liu Yong-feng¹

¹Department of General Surgery, the First Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China; ²Second Department of General Surgery, the First People’s Hospital of Shenyang City, Shenyang 110044, Liaoning Province, China

Revised:2013-11-04 Online:2014-01-29 Published:2014-01-29
About author:Liu Shu-rong, Master, Associate professor, Department of General Surgery, the First Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China
Supported by:
Innovation Team Project Program of Education Department of Liaoning Province, No. 2009T104; Special Fund for Health Sector Scientific Research of the Ministry of Health, No. 201002004

摘要/Abstract

摘要：

背景：如何才能很好的把握控制心脏死亡后捐献器官的功能活性，使移植物达到最佳功能状态是器官移植领域研究的重点方向之一。

目的：初步探讨热缺血损伤对大鼠心脏死亡供肝功能的影响。

方法：建立SD大鼠心脏死亡动物模型，将大鼠随机分为6组，分别为对照组(热缺血0 min组)，热缺血10 min组，热缺血20 min组，热缺血30 min组，热缺血40 min组和热缺血50 min组。取各组大鼠肝脏标本制备超薄切片，透射电镜观察肝细胞结构改变并行Flameng评分。提取肝脏线粒体，用分光光度法测定细胞色素C氧化酶的活性。

结果与结论：透射电镜下见热缺血30 min内肝细胞无明显改变，核膜尚完整，线粒体轻度肿胀，线粒体嵴未发生断裂，Flameng评分在2分以下。随着热缺血时间的延长，细胞核固缩，部分肝细胞自溶，可见凋亡小体，线粒体基质凝固，线粒体逐渐呈空泡状，Flameng评分3至4分。线粒体细胞色素C氧化酶活性在热缺血30 min内无明显改变，热缺血40 min组和热缺血50 min组发生明显降低。从线粒体形态和细胞色素C氧化酶活性两方面来看，热缺血时间在30 min内对肝脏功能影响较小，热缺血时间在40 min以上时肝脏呈不可逆性损伤。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

全文链接：

关键词: 实验动物, 组织构建, 器官捐献, 心脏死亡, 热缺血, 供肝, 线粒体, 细胞色素C氧化酶, 透射电子显微镜, SD大鼠

Abstract:

BACKGROUND: How to control functional activity of donor liver after cardiac death and maintain the optimal function of grafts are the key issues in organ transplantation study.

OBJECTIVE: To preliminarily explore the effect of warm ischemia injury on the morphology and function of rat donor liver after cardiac death.

METHODS: Cardiac death model was established in Sprague-Dawley rats and the successful models were divided into six groups: control group (warm ischemia for 0 minute), warm ischemia 10 group (warm ischemia for 10 minutes), warm ischemia 20 group (warm ischemia for 20 minutes), warm ischemia 30 group (warm ischemia for 30 minutes), warm ischemia 40 group (warm ischemia for 40 minutes) and warm ischemia 50 group (warm ischemia for 50 minutes). The rat liver specimens in each group were cut into ultrathin sections. The structure of liver cells was observed and photographed by electron microscopy. Flameng score was applied to analyze the degree of mitochondrial damage. Liver mitochondria were extracted and then spectrophotometry was used to assess the viability of cytochrome C oxidase.

RESULTS AND CONCLUSION: Under electron microscopy, there were no significant changes in liver cells within 30 minutes of warm ischemia, nuclear membrane was intact, mitochondria mildly swelled, no mitochondrial crista ruptured, and Flameng score was < 2 points. With the extension of warm ischemia time, the cells became swelling, nuclear chromatin condensated, apoptotic body was clearly visible, mitochondrial matrix coagulated, mitochondria exhibited vacuolation, and Flameng score was 3-4 points. The viability of cytochrome C oxidase showed no significant difference within 30 minutes of warm ischemia, but began to significantly decrease at 40 and 50 minutes. The mitochondrial structure and function after liver injury is not obviously affected by 30 minutes of warm ischemia, and significant changes appear after 40 minutes.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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Key words: tissue donors, warm ischemia, rats, Sprague-Dawley, hepatocytes, mitochondria, electron transport complex IV, microscopy, electron, transmission

中图分类号:

R318

刘树荣，余斌，焦保平，刘永锋. 热缺血损伤对大鼠心脏死亡供肝线粒体形态和功能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(5): 681-686.

Liu Shu-rong, Yu Bin, Jiao Bao-ping, Liu Yong-feng. Impact of warm ischemia injury on mitochondrial morphology and function of rat donor liver after cardiac death[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(5): 681-686.

图/表（结果） 3

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2010年7月至2011年3月在中国医科大学普通外科实验室完成。

材料：

实验动物：雄性SD大鼠60只，4周龄，体质量250-300 g，购于中国医科大学动物实验中心。

实验方法：

热缺血模型的建立和分组：动物术前禁食12 h，自由进水，大鼠称质量后以10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，取仰卧位，腹部横切口进腹，经阴茎背静脉注入肝素20 IU，剪断镰状韧带及左右三角韧带，游离门静脉及肝固有动脉，剪开膈肌，阻断胸主动脉，制成大鼠DCD模型。随机将大鼠分为6组，分别为对照组(热缺血0 min组)、热缺血10 min组、热缺血20 min组、热缺血30 min组、热缺血40 min组和热缺血50 min组，每组10只。达到热缺血时间后，经门静脉灌注 0-4 ℃乳酸钠林格氏液冲洗肝脏残留血液。对照组夹闭胸主动脉后立即松开，其余操作与实验组相同。所有实验均在相关动物保护条例下进行。

检测样本的获得：各组大鼠均在肝右叶同一部位取材进行下一步检测。

透射电镜观察肝脏线粒体并行Flameng评分：于肝右叶近肝右静脉处剪取一小块肝组织1 mm³，立即投入预冷的4%戊二醛固定，经0.1 mol/L PBS漂洗3次，1%饿酸固定3 h后，同样方法漂洗3次，以上实验在4 ℃下操作。用不同浓度的乙醇梯度脱水，再用不同浓度的丙酮逐级脱水，环氧树脂EPson包埋加温聚合，定位修块，LKB-v型超薄切片机切片，经醋酸铀-硝酸铅双重染色，应用透射电镜观察细胞超微结构的变化。相同放大倍数下随机选择5个视野照相，每个视野中随机选取约10个线粒体进行分析。按照线粒体的受损程度，逐个线粒体进行0-4级记分，最后计算样本的平均得分，即得到该样本的Flameng评分^[14]。

肝脏线粒体的提取：

线粒体的提取：①样本处理：称取100-200 mg新鲜肝组织，PBS冲洗，洗净血水，滤纸吸干，用剪刀剪成碎块放入小容量玻璃匀浆器内。加入1.5 mL冷的Lysis Buffer1， 0 ℃冰浴上下研磨组织20次。②将组织匀浆物转移到离心管，4 ℃，800×g离心5 min。细胞核、大的膜碎片、未裂解细胞等在管底。③在另一个新的预冷的离心管中预先加入0.5 mL Medium Buffer，将匀浆后的上清液0.5 mL (Medium Buffer∶上清液体积=1∶1)沿管壁小心地加入该离心管中，覆盖于Medium Buffer的上层。④4 ℃，15 000×g 离心10 min。离心后的上清含胞浆成分，将上清转移到新离心管，线粒体沉淀在管底。⑤在线粒体沉淀中加入0.2 mL Wash Buffer重悬线粒体沉淀，4 ℃，15 000×g离心10 min，弃上清。

蛋白的提取：①在每1 mL冷Lysis Buffer2加入5 μL磷酸酶抑制剂，1 μL蛋白酶抑制剂和5 μL 100 mmol/L PMSF，混匀。冰上保存数分钟待用。②每20 μL线粒体压积中，加入200 μL上述配制好的冷Lysis Buffer2。③置于 4 ℃摇床平台上，温和振荡15 min。④14 000 r/min，4 ℃离心15 min，取上清为全蛋白提取物，用缓冲液调整制备的大鼠肝线粒体浓度，含线粒体蛋白0.5 g/L。用考马氏亮蓝法测定线粒体蛋白浓度。

线粒体细胞色素C氧化酶活性测定：使用分光光度计法^[15]，具体过程为组织匀浆，离心，取上清，在沉淀中加入Wash Buffer重悬线粒体沉淀，离心，弃上清；加入磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂混合物，加入冷Lysis Buffer2；离心，取上清，用考马氏亮蓝法测定线粒体蛋白浓度。离心收集的线粒体蛋白，反复冻融3次，使之成为线粒体膜片段以进行细胞色素C氧化酶活性测定。启动反应后，用分光光度计测定1 min内550 nm处还原型细胞色素C吸光度值，即细胞色素C氧化酶的活性。

主要观察指标：①肝组织透射电镜下的结构改变及Flameng评分。②不同热缺血条件下大鼠肝细胞线粒体细胞色素C氧化酶活性。

统计学分析：用 SPSS 17.0软件包，所有数据以x(_)±s 表示，组间比较单因素方差分析(ANOVA)采用Games-Howell(A)检验。以P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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讨论

全球首例肝移植成功施行以来，肝移植手术成为目前终末期肝病的有效治疗手段^[16-17]。在过去的10年中，等待移植的患者数量稳步增长，而用于移植的器官数量却没有得到相应增加^[18-20]。由于供者的短缺，限制了器官移植手术的大量开展，同时也使相当一部分患者由于无法及时施救而在等待移植期间死亡^[21-22]。成熟的肝移植技术背后日益凸显出供肝的巨大短缺^[23]，活体肝移植、劈离式肝移植及辅助肝移植等随之应运而生^[24-25]。尽管肝移植初期的供肝均来自于DCD，但鉴于DCD经历了较长的热缺血时间，可能对供肝本身及肝移植受者近远期存活率造成不可忽视的影响^[26]，自1968年脑死亡概念引入后，DCD的应用逐渐减少，并被脑死亡器官捐献(donation after brain death，DBD)所取代^[27]。国内目前尚未为脑死亡立法，DBD面临诸多法律难题，故DCD仍是中国主要的供移植器官来源^[28]。美国2012年OPTN/UNOS的年度报告指出，2011年DCD供者占尸体移植的13%(1 053例)，是2000年的9倍(117例，1.95%)^[29]。实际上，DCD供者已经成为各国重要的供器官来源。2010年3月，中华人民共和国卫生部与中国红十字总会共同启动了人体器官捐献试点工作，截至2012年11月15日，全国共完成器官捐献482例，共捐献大器官1 300个。两年多来，DCD的数量稳定增长，临床实践证明心脏死亡器官捐献是符合中国国情的，是切实可行的^[1^，^30-31]。

由于心脏死亡的供器官要经历热缺血、冷灌注及缺血再灌注损伤^[32]，DCD供肝在肝移植后，出现移植肝原发性无功能^[33]、肝动脉血栓形成、早期胆汁淤积、缺血性胆管狭窄和排斥反应等的概率远远大于脑死亡供肝^[34-39]。目前，在器官保存和获取过程中尚无可以有效评估移植物活力的标记物^[40-41]，用来预测术后移植物功能，临床医生判断移植物是否适合移植主要通过观察器官质地与灌注时的效果来评估，在移植物表面出现斑点或灌注不均匀时，则通常舍弃不用^[42]。对于DCD器官移植来说，由于移植物术后发生功能障碍和原发性无功能的风险较大，更应准确评估，在保证移植效果的前提下提高器官利用率^[43]。DCD作为主要的器官来源，如何才能很好的把握控制供者器官的功能活性，使移植物达到最佳功能状态是器官移植目前研究的重点方向之一^[44]，用于评估DCD器官功能的定性指标，对于判断DCD器官的可利用性非常重要^[45-46]。

电子显微镜是观察线粒体膜电位，ATP生成以及微环境改变的良好技术^[47-48]。本研究显示，随着热缺血时间延长，肝细胞核肿胀程度加重，核膜破裂逐渐加重，线粒体逐渐肿胀。热缺血30 min内核膜比较完整，无细胞自溶，线粒体基质透明，线粒体嵴未断裂，大部分线粒体Flameng评分为2分，细胞是处于可复性阶段。热缺血40 min组部分肝细胞发生不可逆变化，如染色质边集、核碎裂和核溶解，部分肝细胞发生凋亡，线粒体肿胀程度加重，线粒体基质凝固，嵴断裂，大部分线粒体Flameng评分为3分。热缺血50 min时，肝细胞染色体边集，出现凋亡小体，线粒体内外膜消失，呈空泡状，大部分线粒体Flameng评分为4分。从肝脏线粒体形态可见，30 min以上的热缺血损伤对供肝影响较大。细胞色素C氧化酶是线粒体内的关键酶^[49-50]，是细胞活力状态和损伤程度的指示剂^[51-52]。本研究显示，随着热缺血时间延长，细胞色素C氧化酶活性下降，在30 min热缺血时间内，细胞色素C氧化酶活性差异无显著性意义，30 min以后细胞色素C氧化酶活性明显下降，与对照组相比，差异有显著性意义。因此，从线粒体功能来看，30 min以内热缺血损伤对大鼠心脏死亡供肝功能影响较小。

研究表明，细胞色素C从线粒体释放至细胞质是引发凋亡的重要途径^[53-55]。细胞色素氧化酶除了与肝脏能量代谢有关外，还通过凋亡途径影响肝脏活性^[56-57]。本研究表明，热缺血损伤可以改变线粒体外膜通透性，使线粒体肿胀，促进凋亡小体形成，加重肝脏细胞凋亡。研究表明，热缺血短时间内胞质细胞色素C水平的升高，早于DNA片段化的达峰时间^[58-60]。因此，细胞色素C从线粒体至胞质的移位是与暂时性缺血细胞凋亡的引发相对应的^[61-62]。在局部缺血啮齿类动物中检测细胞色素C氧化酶与细胞凋亡的生化及形态特征如胞质皱缩，染色质固缩和DNA片段化相关^[63]。

DCD肝移植热缺血再灌注损伤是一个连续发展的病理生理过程^[64-67]，单纯热缺血损伤是这一过程的基础和始动环节，冷保存期间^[68-69]、手术缺血期及再灌注过程还会进一步损伤供肝活性^[70-73]。能够显示供肝在冷保存期间及再灌注过程中功能损伤程度的活性指标，以及这些指标综合利用来更好地反映DCD供肝质量等问题仍需要进一步研究^[74-76]。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
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热缺血损伤对大鼠心脏死亡供肝线粒体形态和功能的影响

Impact of warm ischemia injury on mitochondrial morphology and function of rat donor liver after cardiac death

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