骨科疾病中蛋白质组学的应用进展

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.02.022

摘要/Abstract

摘要：

背景：蛋白质组学是后基因组时代的新研究领域，它以组织或细胞的全部蛋白质结构与功能为研究对象，通过检测蛋白质来分析各种疾病的重要病理生理变化。
目的：就目前蛋白质组学相关技术在骨科各种疾病中的应用与展望作一综述。
方法：以“组织构建/蛋白质组学/骨科学/椎间盘退变/骨质疏松/骨性关节炎/成骨细胞/破骨细胞/综述”为中文检索词，以“proteomics/orthopedics/review/osteoblasts metabolism/osteoclasts metabolism/ intervertebraldisc degeneration/osteoporosis/osteoarthritis/serum related orthopedic diseases”为英文检索词，检索珠江三角洲数字图书馆联盟期刊全文数据库和Pubmed外文数据库2001年1月至2013年9月有关蛋白质组学在骨科各类疾病当中的基础和临床研究的相关文献。纳入有关报告蛋白质组学在椎间盘病变、骨质疏松症及骨性关节炎等方面的应用的文献。排除重复性研究和不典型报道。
结果与结论：蛋白质组学已成功应用于成骨细胞、破骨细胞代谢，椎间盘退变、骨质疏松症、骨性关节炎及骨科相关疾病的血清等方面，以上所提及的疾病均为各类人群的常见多发病，这些相关的基础临床研究无疑为人类健康带来了巨大的福音，相信蛋白质组学相关技术在基础医学和临床医学中会取得更大的突破，将展示广阔的发展前景。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 骨组织工程, 成骨细胞, 破骨细胞, 蛋白质组学, 骨科学, 椎间盘退变, 骨质疏松, 骨性关节炎

Abstract:

BACKGROUND: Proteomics is a new field of research in the post-genomic era. The research subjects of proteomics include the structure and function of entire proteins in tissues or cells. It analyses the vital changes of pathological and physiological process of diseases by examining proteins.
OBJECTIVE: To summarize the application of proteomics in orthopedic diseases and its prospect.
METHODS: Articles about the application of proteomics in orthopedic diseases and its prospect were retrieved from the Digital Library Alliance of Zhujiang River Delta and PubMed with the key words of “proteomics, orthopedics, review, osteoblasts metabolism, osteoclasts metabolism, intervertebral disc degeneration, osteoporosis, osteoarthritis, serum related orthopedic diseases” in both Chinese and English from January 2001 to September 2013. Reproductive research and atypical reports were excluded.
RESULTS AND CONCLUSION: Proteomics has been applied in the osteoblasts metabolism, osteoclasts metabolism, intervertebral disc degeneration, osteoporosis, osteoarthritis and serum related orthopedic diseases that are the most common illnesses in all types of people. These basic and clinical studies undoubtedly bring great benefit for human health, and proteomics technology will get a bigger breakthrough in basic medicine and clinical medicine, and it shows us a broad prospect.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: proteomics, intervertebral disk degeneration, osteoporosis, osteoarthritis, osteoblasts, osteoclasts

中图分类号:

R318

冯文铖，梁伟国. 骨科疾病中蛋白质组学的应用进展[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(2): 295-300.

Feng Wen-cheng, Liang Wei-guo. Proteomics and its application in orthopedic diseases[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(2): 295-300.

图/表（结果） 1

2.1 纳入文献基本情况初检得到109篇文献，大部分为英文。阅读标题和摘要进行初筛，排除因研究目的与此文无关17篇，内容重复性的研究36篇，共保存56篇中英文文献做进一步分析。文献[1-20]研究了蛋白质组学在成骨细胞破骨细胞代谢方面的应用，文献[21-32]分析了蛋白质组学在椎间盘病变方面的应用，文献[33-40]篇研究了蛋白质组学在骨质疏松症方面的应用，[41-48]研究了蛋白质组学在骨性关节炎方面的应用，[49-56]研究了蛋白质组学在骨科其他疾病方面的应用。

2.2 成骨细胞、破骨细胞代谢骨质疏松症是中老年，特别是在绝经期后妇女中常见的疾病。蛋白质组学被积极应用于骨质疏松症的基础研究当中。目前的蛋白质组学研究主要是在成骨细胞和破骨细胞的功能与其多向分化及自我更新上，因为两者的活性不均以及骨形成障碍是导致诸多骨疾病的重要原因^[2]。成骨细胞来自于可以合成骨基质的骨髓基质细胞，它具有多向分化潜能；而破骨细胞来自于单核细胞，主要作用是骨吸收^[3]。在最近对骨髓基质细胞的成骨性、以及其自我更新和多向分化方面的研究中，得到一个重要结论，确实了骨髓基质细胞的多向分化潜能和自我更新能力^[4-5]。应用新的分子和细胞技术对骨髓基质细胞进行定量和生物标记，包括STR0-1、CD29、CD44、 CD90、CDl05、CDl66和MHC-l^[6]。但是以上的这些生物标记并没有呈现出特异性的表达，也即是说，骨髓基质细胞能够自我更新和多向分化的分子机制目前还未知晓。

相关研究表明，通过双向电泳分离蛋白，在接下来的质谱分析中可以得出以下结论：骨髓基质干细胞克隆的蛋白质组在分化阶段时，低扩增情况下，其差异蛋白分为以下几个功能类：代谢、信号转导、细胞黏附、细胞生长、细胞骨架、细胞问作用、细胞周期、蛋白降解和铁代谢。而高扩增，也就是少分化情况下，钙调蛋白、T-complex protein 1 d-亚基和原肌球蛋白上调，而钙调合素蛋白和minraloconicoidreceptor下调^[7-9]。这些蛋白与细胞周期和增殖有关^[8]，对于骨代谢是也有一定作用^[10]。

Sun等^[11-12]应用相同方法研究骨髓基质干细胞向成骨细胞分化，发现了一些具有特异性的差异蛋白，包括chlorideintraceⅡ和ular channell，通过实验得出结论，以上两种蛋白对成骨细胞分化起到了一定作用。而Uitterlinden 等^[13]做的相关实验结果发现了2 400个差异点，发现的这些差异蛋白按功能分类，可以分为：细胞结构/活力，蛋白降解，能量产生和抗氧化保护。其中显著上调的有两个：①Cathepsin D：考虑此蛋白上调的原因可能与其在转化生长因子B以及胰岛素样生长因子II(IGF)的细胞外加工作用有关系。②UCH-L1：硫氨基水解酶(thiol-hydrolase)，属于泛肽依赖蛋白水解系统。这两者都被认为是促进成骨细胞有丝分裂的重要因子，且后者对于振和生物的生长及分化都有举足轻重的作用。值得一提的是，此项研究是目前第一项报道硫氨基水解酶在成骨细胞分化中上调的。在另一项目的在于找出潜在成骨标记的研究中，Salasznyk等^[14]应用蛋白质组学相关技术找出了成骨细胞与骨髓基质细胞之间的727个不同的蛋白点，其中证明有65%的蛋白仅在成骨细胞中发现。这个实验表明分化成熟的成骨细胞与未分化的骨髓基质细胞在蛋白质组学层面具有显著的差异。Myung等^[15]比较了10种肿瘤细胞系，发现有一种蛋白仅在Sa0S-2细胞中表达，即脂皮质蛋白1，值得注意的是这种蛋白是与肿瘤排斥抗原相类似的，所以它在Sa0S-2中表达下降的现象是与肿瘤细胞的生物学特性一致的。

在破骨细胞方面的研究，目前Kubota等^[16]通过2-DE联合MALDI/MS方法发现了破骨细胞差异表达的蛋白，包括组织蛋白酶、骨桥蛋白、豆荚蛋白以及炎症蛋白等。

骨质疏松症是骨科常见病多发病，蛋白质组学技术不断成熟，已被应用于骨质疏松症治疗^[17]。就目前的研究成果可以看出，成骨细胞与破骨细胞在蛋白质成分上确实存在较大差异。苏友新等^[18]建立去卵巢大鼠骨质疏松症模型，设立假手术组、模型组及中药组，双相电泳技术展示腰椎松质骨蛋白质组图谱，比较各组间差异蛋白点并进行质谱分析及初步鉴定，结果证明角蛋白、果糖二磷酸醛缩酶、肌动蛋白、ATP舍酶a-亚单位、a-烯醇化酶、蛋白二硫键异构酶表达改变可能与骨质疏松发病有关，血清白蛋白、ATP合酶β-亚单位、碳酸酐酶、晶体蛋白β-链、过氧化还原酶6、β-烯醇化酶、肌动蛋白表达改变可能与中药干预效应有关。这为之后结合临床奠定了基础，可以推测在不久的将来，通过转录翻译合成与成骨细胞特异相关的蛋白质组，不失为治疗骨质疏松症的新思路。蛋白质组学在成骨细胞代谢、破骨细胞代谢以及骨质疏松症动物模型的研究中取得较大进展，从而在探讨骨质疏松症的发生机制，提供其早期诊断标志物的筛选以及寻找其治疗药物靶标等方面发挥了重要作用^[19]。

2.3 椎间盘病变在临床研究方面，由于腰椎间盘突出征、退行性腰椎间盘病都是导致腰腿痛的主要致病因素。所以找出退变椎间盘与正常椎间盘之间的差异蛋白成为了蛋白质组学在这方面的主要应用。

谢沛根等^[20]所做的临床试验，样本量20例，应用蛋白质组学相关技术，在患者及正常人血清里找到了6组差异表达最显著的蛋白质，其中载脂蛋白L1以及两个白蛋白前体表达升高，载脂蛋白M、四连接素、免疫球蛋白轻链表达降低，而酶联免疫吸附试验证实其中的4种在患者血清中高表达，与正常人有差异。Liu等^[21]运用同样方法分析鉴定了椎间盘突出症患者与正常人的脑脊液中的蛋白质，该实验发现了15种差异蛋白，其中包括表达升高的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、载脂蛋白A、维生素D结合蛋白及神经微丝的3种L蛋白(免疫球蛋白G、连接素和血红蛋白)，以及表达降低的血清淀粉样蛋白、前列腺素D2合酶、肌酸激酶B及超氧化剂物歧化酶1。冯皓宇等^[22]运用MAIDI-TOF-MS仪对萃取的细胞外基质蛋白质进行鉴定，发现了正常椎间盘中的19种蛋白质，这项研究为下一步实验夯实了基础。以上研究都说明蛋白质组学技术在椎间盘病变的应用可以为临床提供更科学、更明确的发病机制，找到准确的治疗靶点，为椎间盘疾病的诊治给予了大力的帮助。作者近年也在从事正常与退变髓核细胞差异蛋白的逆转髓核细胞退变的相关研究，前期应用蛋白质组学相关技术发现了包括血管生成素在内的退变性椎间盘和正常椎间盘的22个差异蛋白，目前正待下一步鉴定阶段。

2.4 骨质疏松症正如前面所说，骨质疏松症的主要原因在于成骨细胞与破骨细胞活性的不均衡以及骨生成的障碍^[2]。此外，妇女绝境后出现的骨密度降低也是临床一大难题，目前来说雌激素在骨代谢中发挥何等作用，仍尚未得知。蛋白质组学为我们提供了新的研究方向，可喜的是，蛋白质组学目前在研究骨质疏松症方面已经取得了很多成果^[23]，之前提到了发现了与成骨细胞与破骨细胞分化有关的新蛋白质便是^[24]。

此外，在研究雌激素与骨代谢关系方面，Fan等^[25]应用蛋白质组学技术，在雌激素缺失的大鼠中，成功发现了3种明显差异的蛋白质：即硫氧还蛋白过氧化酶1、阻凝蛋白轻链肽2和泛素化酶 E 2-17 000，其中泛素化酶E 2-17 000已报道为雌激素相关蛋白。值得一提的是，这是硫氧还蛋白过氧化酶1、阻凝蛋白轻链肽2首次报道为骨质疏松相关蛋白。该实验也设立中药治疗组，初步认为这3种蛋白质在绝经后骨质疏松症发病及中药治疗过程中发挥着重要的调控作用^[26]。这些重要的研究成果为将来阐明雌激素在骨代谢当中发挥的作用，提供了实验性证据。

2.5 骨性关节炎近年来，骨性关节炎的发病率日趋增高，特别是在重体力以及长期体位不正的人群当中尤为明显，长期的磨损导致的软骨破坏、滑膜增生以致关节间隙变窄是骨性关节炎发病的重要原因。在这方面，抽取关节液，包括风湿性关节炎、类风湿性关节炎等，应用蛋白质组学技术研究其病因的实验也取得了进展。将蛋白质组学技术应用于类风湿关节炎的研究，多项研究均证实钙连蛋白A等蛋白质与类风湿关节炎滑膜局部炎性反应有关，可能参与类风湿关节炎发病^[27]。

其中，Sinz等^[28]用2-D和质谱测定法研究类风湿性关节炎、急性关节炎、骨性关节炎患者的滑膜液和血浆，结果显示：钙粒蛋白B、血清淀粉酶蛋白A只在类风湿性关节炎患者的滑膜液中发现。此外，Matsuo等^[29]的实验也在骨性关节炎患者血清中鉴定出了特异性的fibulin-4蛋白。Drynda等^[30]的研究发现的类风湿性关节炎患者和骨性关节炎患者血浆和滑膜液中的小钙结合蛋白S100A9，特异性很高。同时发现Sl00A8/A9杂络物只存在于类风湿性关节炎患者的血浆和滑膜液中，因此提出，可以用此蛋白来区别类风湿性关节炎和其他关节炎。杨波等^[31]应用蛋白质组学技术，建立大鼠原诱导性关节炎标本，实验结果发现了35个差异蛋白点，功能涉及物质代谢、能量产生、物质转运、抗氧化、信号转导及细胞骨架蛋白。并用 Western blot方法证实了其中的膜联蛋白I、醛缩酶A可能与胶原诱导性关节炎的滑膜病变有关。Xiang等^[32]所做的的临床试验鉴别了骨性关节炎和类风湿性关节炎患者，结果发现了19种差异蛋白，同时证实了其中的磷酸丙糖异构酶(TPI)的自身抗体有可能作为诊断的标志物。陈疆等^[33]观察6例无关节滑膜损伤患者及6例活动期类风湿性关节炎患者行关节镜手术得到的滑膜组织提取总蛋白质后进行鉴定，实验建立了类风湿性关节炎组及对照组滑膜组织双向凝胶电泳图谱，获得130个差异在2倍以上的蛋白质点数，选取其中分辨清楚的39个点进行鉴定，初步鉴定出29个蛋白质，其中21个蛋白质点在类风湿性关节炎组中表达上调，8个表达下调，其功能涉及功能代谢、细胞信号传导、抗氧化、分子伴侣等。结果表明类风湿关节炎滑膜病变是一个多种蛋白质参与的复杂过程，这些表达差异蛋白质可能是类风湿性关节炎发病的内在因素。

据相关文献报道，通过蛋白质组学技术发现的鉴定了的骨性关节炎相关蛋白已有100多个^[34]，包括最近被证实为骨性关节炎的生物标志物的血清软骨寡聚基质蛋白、基质金属蛋白酶，而其余的蛋白还需进一步的实验鉴定^[35]。值得庆幸的是，新技术新思路的不断提出使骨性关节炎方面的蛋白质组学研究的发展相当迅速，所以有理由相信，要鉴定出与骨性关节炎相关的全部特异蛋白只是时间问题。

2.6 骨折创伤方面骨折愈合是多因素综合作用的结果，参与骨折愈合的蛋白质和生长因子一直是骨折愈合研究的热点，如骨形态生成蛋白、骨源性生长因子等。

何肖丞等^[36]观察骨折愈合早期骨痂中的蛋白质含量、种类与正常骨质的差别，寻找影响骨折愈合过程的差异蛋白分子，选取10只家兔建立右上肢桡骨骨折模型(实验组)以对侧正常骨组织对照(对照组)。结果找出差异蛋白点15个，初步鉴定出差异表达蛋白质点8个，包括巨噬细胞移动抑制因子、泛素/核糖体蛋白$27A融合蛋白、原肌球蛋白β-异构体2、磷脂结合蛋白1、谷胱甘肽孓转移酶、磷酸丙酮异构酶1、果糖二磷酸醛缩酶A、肽基脯氨酰顺反异构酶A。实验认为骨痂组织与正常骨组织的蛋白质表达存在明显差异，这些差异蛋白可能在骨折愈合的发生发展中发挥作用。田妮等^[37]实验发现重组人骨形态发生蛋白2修饰的组织工程化骨具有较强的传导成骨和诱导成骨活性，生物相容性好，材料可完全降解，为骨组织取代，对眼眶骨折缺损具有较好的修复效果。骨形态发生蛋白自身可以诱导骨生成，对于骨的发育、创伤的修复以及癌症的发生等过程也起着重要的作用。吴永祥等^[38]观察骨痂中蛋白质含量、种类与正常骨质相比的变化，寻找表达差异的蛋白质条带，实验结果证明骨折愈合过程中，骨痂的蛋白质含量、种类均比正常骨质增加，以骨折早期含量增加最为明显，分子量约为30 ku附近的明显差异条带可选择作为后续研究中鉴定的对象。

2.7 骨科其他疾病除上面所陈述，蛋白质组学相关技术在骨科其他疾病发面同时也有较为广泛的运用。包括脊髓外伤、骨质坏死性疾病以及骨肿瘤等方面都取得了一定进展。

在景爱红等^[39]发现了正常大鼠的脊髓蛋白组学信息之后，Kang等^[40]应用蛋白组学技术，在损伤的脊髓组织中发现了区别于正常组织的270个蛋白，证实在脊髓外伤24 h后，有超过39个蛋白表达上调，21个下调。其中包括神经原纤维链、膜联蛋白5、热休克蛋白、微管蛋白B、外周蛋白、胶质纤维酸性蛋白和载脂蛋白A；功能分类分析显示蛋白变化主要归属13个功能类别，其中损伤组织神经功能类最可能与损伤愈合反应过程中的神经再生和胶原再生相关。

此外，贾林芝等^[41]所做的研究针对失神经支配而萎缩的肱二头肌、小鱼际肌及其健侧胸锁乳突肌肌纤维组织中的蛋白质，实验鉴定了32个差异蛋白。李潇^[42]认为老年人、饥饿的人、运动员、癌症等所有人都在经历肌肉萎缩，即肌肉纤维的丢失。研究者现已揭示了驱动肌肉萎缩的生物化学信号的详情，生化信号是一类蛋白质，它们启动肌肉萎缩过程，这些蛋白质是“主要开关”，如果能利用这些蛋白质开关作为靶子来开发药物，则可阻断肌肉萎缩过程，或者是至少减少肌肉萎缩。

在研究股骨头坏死方面，Tan等^[43]应用蛋白质组学技术分析坏死股骨头和正常股骨头之间蛋白质的变化，发现了7种差异蛋白，包括其中下调的纤溶酶原活化因子 (t-PA)、骨源性谷氨酸蛋白(BGP)、c-sis基因和一未知蛋白，以及上调的纤溶酶原激活物抑制剂 (PAI-1)、交联蛋白(crosslaps)和抗p53抗体。同时证实纤溶酶原活化因子、纤溶酶原激活物抑制剂、交联蛋白和抗p53抗体在股骨头坏死患者中的表达明显高于类风湿性关节炎、骨关节炎和骨折患者。刘建仁等^[44]的对大鼠激素性骨坏死的研究发现了3个差异蛋白，分别为磷脂谷胱甘肽过氧化酶、阻凝蛋白重链ⅡB及泛素化酶E2(MW：17 000)，初步认为这3种蛋白质在激素性骨坏死的发病及中药治疗过程中发挥着重要调控作用。最后，在骨肿瘤领域。孙庆等^[45]通过蛋白质组学相关技术建立了适合于骨肉瘤蛋白质组研究的优化双向凝胶电泳图像。

卿海辉等^[46]分别提取5例骨肉瘤肿瘤标本和5例良性骨肿瘤总蛋白，比较骨肉瘤与良性骨肿瘤蛋白质组学差异，所获得的双向电泳银染图谱重复性较好，骨肉瘤组织蛋白质点数显著高于骨良性肿瘤组织蛋白质点数，明显差异的蛋白质点38个，其中12个被成功鉴定，7个蛋白质在骨肉瘤中表达上调，其中热休克蛋白60、应激诱导磷酸化蛋白1在骨良性肿瘤中表达缺失；5个蛋白质在骨肉瘤中表达下降，以锚定蛋白下降最明显。说明蛋白质组学的分析能成功的发现骨肉瘤与骨良性肿瘤的差异蛋白质，为寻找骨肉瘤特异标记物提供依据。综上所述，蛋白质组学相关技术已经广域化的应用于骨科各种疾病的研究当中^[47-51]。作者认为，以人体整个系统活动的核心大分子-蛋白质为目标的研究前景是极为开阔的。除上述方方面面之外，还有很大的发展空间，随着与疾病相关的各种差异蛋白的一一证实，这项技术将成为未来医学的主导方向。

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