Cdx2反转录病毒载体的构建及转染膀胱上皮细胞的研究

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.46.008

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (46): 8024-8029.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.46.008

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

Cdx2反转录病毒载体的构建及转染膀胱上皮细胞的研究

林明恩¹，邓毕华²，吕夷松²，荣禄²，姚友生²

¹汕头大学医学院第一附属医院泌尿外科，广东省汕头市 515041；²中山大学附属第二医院泌尿外科，广东省广州市 510120

出版日期:2013-11-12 发布日期:2013-11-30
通讯作者: 姚友生，博士，教授，中山大学附属第二医院泌尿外科，广东省广州市 510120 yao2146@yeah.com
作者简介:林明恩☆，男，1980年生，广东省揭阳市人，汉族，2012年中山大学毕业，博士，主治医师，主要从事下尿路疾病和泌尿系肿瘤的研究。 me_lin20@163.com
基金资助:
广东省医学科研基金立项课题(B2013267)*

Construction of human caudal type homeobox transcription factor 2 retrovoral vector and transfection of urothelium cells

Lin Ming-en¹, Deng Bi-hua², Lü Yi-song², Rong Lu², Yao You-sheng²

¹Department of Urology, the First Affiliated Hospital of Shantou University Medical College, Shantou 515041, Guangdong Province, China; ²Department of Urology, the Second Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China

Online:2013-11-12 Published:2013-11-30
Contact: Yao You-sheng, M.D., Professor, Department of Urology, the Second Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China yao2146@yeah.com
About author:Lin Ming-en☆, M.D., Attending physician, Department of Urology, the First Affiliated Hospital of Shantou University Medical College, Shantou 515041, Guangdong Province, China me_lin20@163.com
Supported by:
the Medical Science Research Foundation of Guangdong Province, No. B2013267*

摘要/Abstract

摘要：

背景：尾侧型同源转录因子2在消化道尤其是小肠与结肠上皮的发育中起到关键作用。
目的：构建尾侧型同源转录因子2反转录病毒表达载体pLNCX2- Cdx2，观察pLNCX2- Cdx2体外转染对人膀胱上皮细胞发生肠上皮化生的作用。
方法：应用基因重组技术将人尾侧型同源转录因子2cDNA克隆到反转录病毒载体pLXSN2,酶切鉴定，包装到PA317细胞中。转染人膀胱尿路上皮细胞，应用荧光PCR及Western blot检测尾侧型同源转录因子2以及绒毛蛋白、LI-cadherin的表达情况。
结果与结论：pLNCX2 -Cdx2成功构建；细胞转染后尾侧型同源转录因子2的mRNA及蛋白水平表达明显增加；尾侧型同源转录因子2的过表达明显激活了绒毛蛋白与LI-cadherin的表达；转染后细胞可出现肠细胞样特征改变。结果提示体外尾侧型同源转录因子2过表达可使膀胱上皮细胞发生尾侧型同源转录因子2激活并产生肠上皮分化，从而诱导腺性膀胱炎发生。

关键词: 组织构建, 组织构建细胞学实验, 尾侧型同源转录因子2, 绒毛蛋白, 肝肠钙粘连蛋白, 肠上皮化生, 膀胱上皮细胞, LI-cadherin, 尿路上皮, 腺性膀胱炎, 省级基金

Abstract:

BACKGROUND: Caudal type homeobox transcription factor 2 plays an important role in the development of epithelium in digestive tract, especially the small intestine and colon.
OBJECTIVE: To construct the retroviral expression vector of pLNCX2-caudal type homeobox transcription factor 2, and to observe the effect of in vitro transfection of pLNCX2-caudal type homeobox transcription factor 2 in intestinal metaplasia.
METHODS: Gene recombinant technology was employed to clone human caudal type homeobox transcription factor 2 gene to the retroviral expression vector of pLNCX2, then identified with enzyme digestion and sequencing and packed to the PA317 cells. The plasmids were transfect in urothelium cells, real-time PCR and western blot were used to detect the expressions of caudal type homeobox transcription factor 2, villin and liverintestin- cadherin at the protein and mRNA levels．
RESULTS AND CONCLUSION: The retroviral vector pLNCX2-caudal type homeobox transcription factor 2 was successfully constructed. The levels of caudal type homeobox transcription factor 2 protein and mRNA expressions in bladder urothelium cell transfected with pLNCX2-caudal type homeobox transcription factor 2 were higher than that in control. And the over-expression of caudal type homeobox transcription factor 2 could up-regulate the levels of villin and liverintestin-cadherin expressions. Interestingly, specific changes of intestine-like cells were seen in the bladder urothelium cells transfected by pLNCX2-caudal type homeobox transcription factor 2. Over-expression of caudal type homeobox transcription factor 2 can activate the caudal type homeobox transcription factor 2 of urothelium cells and induce intestinal epithelial differentiation, thus inducing the development of cystitis glanduaris.

Key words: transcription factor, epithelial cells, chorionic villi, metaplasia

中图分类号:

R318

林明恩，邓毕华，吕夷松，荣禄，姚友生. Cdx2反转录病毒载体的构建及转染膀胱上皮细胞的研究[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(46): 8024-8029.

Lin Ming-en, Deng Bi-hua, Lü Yi-song, Rong Lu, Yao You-sheng. Construction of human caudal type homeobox transcription factor 2 retrovoral vector and transfection of urothelium cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(46): 8024-8029.

图/表（结果） 4

2.1 反转录病毒载体pLNCX2-Cdx2质粒的构建及鉴定 以结肠总RNA行反转录合成的cDNA为模板，使用高保真 PCR 酶对尾侧型同源转录因子2基因的ORF进行扩增，RT-PCR产物的琼脂电泳可见在1 000-900 bp之间存在一条清晰的条带，见图1，此条带就是设计带有双酶切位点的尾侧型同源转录因子2 ORF目的条带 (961 bp)。

上述RT- PCR扩增产物与空载体pLNCX2的酶切连接后，筛选出4个阳性克隆，经琼脂电泳在6 000 kb左右位置可见到4条清晰条带，经过 Hin和BglII双酶切后可见上下2个条带，5 000 bp左右条带，与载体本身长度约5.4 kb接近；双酶切目的条带在 1 000 bp左右，与设计引物的尾侧型同源转录因子2基因的ORF长度961 bp基本一致，见图2，综上所述初步证实所选的4 个克隆均为阳性克隆。dIII

将酶切正确的片段送上海Invitrogen公司测序，采用Dnassit 2.0软件中与尾侧型同源转录因子2基因的ORF 序列进行比对，结果两者吻合率100%，说明反转录病毒表达载体 pLNCX2-Cdx2构建成功。

2.2 pLNCX2-Cdx2质粒转染膀胱尿路上皮结果

转染效率测定：转染72 h后，荧光观察可见大量绿色荧光，提示转染成功，转染效率约76%。

实时荧光PCR结果：尾侧型同源转录因子2，绒毛蛋白，Ll-cadherin基因mRNA的水平在pLNCX2-Cdx2，pLNCX2-neo及未转染组各组之间比较差异有显著性意义(P < 0.01)。pLNCX2-Cdx2与后两组之间的组间比较差异均存在显著性意义(P < 0.05)。尾侧型同源转录因子2基因mRNA在pLNCX2-neo及未转染组能检测到较低的表达；而绒毛蛋白，Ll-cadherin基因在pLNCX2-neo及未转染组均未能检测到表达。见表1，图3。

Western blot结果：尾侧型同源转录因子2蛋白的Western Blot证实转染尾侧型同源转录因子2的成功转入膀胱尿路上皮细胞并有效表达。绒毛蛋白和LI-cadherin基因在尾侧型同源转录因子2基因的导入后，可出现表达。在空载体转染pLNCX2-neo组和未处理细胞组中Western blot 3种蛋白均未见表达。3组细胞的内参α-tubulin均正常表达。见图4。

细胞形态学改变结果：在倒置显微镜观察下，膀胱尿路上皮细胞转染前为多边形、多触角形态；pLNCX2-Cdx2转染后72 h镜下观察部分细胞呈现较规则的圆形或类圆形改变，并聚集成团甚至围成类似腺腔结构的同心圆圈结构形态。见图5。

参考文献

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引言

材料方法

设计：单一样本观察。

时间及地点：实验于2010年9月至2012年5月在中山大学完成。

材料：人膀胱尿路上皮细胞取自术中膀胱癌患者癌组织3 cm以外的正常组织，患者知情同意。

实验方法：

引物设计：根据NCBI数据库尾侧型同源转录因子2基因序列(NM_001265)，用Premier 6.0 软件设计并合成PCR引物(由上海生工生物公司合成)，上游引物引入HindIII酶切位点，下游引物引入BglII酶切位点序列，引物序列如下：上游引物：5'-CCC AAG CTT TCA CTG GGT GAC GGT GGG GTT TA-3'；下游引物：5'-GAA GAT CTG CCA CCA TGT ACG TGA GCT ACC TCC TGG ACA-3'；预期产物大小为965 bp。

PCR扩增目的基因及纯化回收：人结肠细胞中cDNA为模板PCR扩增尾侧型同源转录因子2目的片段，PCR扩增条件如下：94 ℃ 变性5 min；98 ℃变性12 s，68 ℃ 1 min 30 s for 35 个循环扩增；68 ℃ 10min 延长；4 ℃保存产物。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离目的条带，切胶回收，DNA凝胶回收试剂盒纯化回收尾侧型同源转录因子2目的片段。

PCR产物双酶切纯化以及和反转录病毒载体连接：用BglII和HindIII酶将尾侧型同源转录因子2的PCR片段及目的载体pLNCX2双酶切，再进行连接。T₄ DNA连接酶1 μL、T Easy载体1 μL，室温连接1 h。上述反应物转入50 μL大肠杆菌DH-5α感受态细胞中，进行转化，经蓝白筛选、氨苄青霉素筛选后挑选单克隆，摇菌。质粒抽提试剂盒抽提质粒，送测序鉴定扩增片段。DNA序列测定由上海英俊公司完成。

细胞培养：人类膀胱尿路上皮细胞HUM-CELL-0046在DMEM-F12培养基(含体积分数10%胎牛血清、 100 U/mL青霉素、100 g/mL链霉素)， 37 ℃、体积分数5% CO₂培养，每两三天换液1次。

质粒转染：HUM-CELL-0046细胞在6孔板中无血清培养，每孔2×10⁵个细胞，待细胞达到80%-90% 融合后用脂质体 Lipofectamine 2000介导质粒的转染。转染分空载体对照(pLNCX2-neo)组和重组载体(pLNCX2-Cdx2)组，未转染组细胞则继续培养。每孔转染按载体/脂质体为1 μg∶3 μL比例进行转染，转染后 12 h更换成正常培养基；转染48 h后，收取细胞，使用蛋白质免疫印迹法和实时荧光定量PCR法(real-time PCR)在蛋白及mRNA水平检测尾侧型同源转录因子2以及下游基因绒毛蛋白，LI-cadherin的表达。

real-time PCR检测：将转染后的相关细胞加入 1 mL RNA快速提取试剂Trizol，室温静置10 min，将细胞裂解物移人EP管中。其余步骤按SYBR Premix Ex Taq荧光PCR试剂盒、PrimeScriptRT reagent Kit试剂盒说明进行。内参基因为GAPDH，引物用Premier 6.0 软件设计并合成PCR引物(由上海生工生物公司合成)。

Western blot检测：将转染后的相关细胞用PBS冲洗2遍，冰上RIPA细胞裂解液提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度；10%的SDS－PAGE胶电泳分离蛋白，每孔上样30 g蛋白；转印法转移至PVDF膜，ECL显色法显色。

主要观察指标： ①反转录病毒载体pLNCX2-Cdx2质粒的构建及鉴定。②pLNCX2-Cdx2质粒转染膀胱尿路上皮转染效率。③pLNCX2-Cdx2质粒转染膀胱尿路上皮实时荧光PCR结果。④pLNCX2-Cdx2质粒转染膀胱尿路上皮Western blot结果。⑤pLNCX2-Cdx2质粒转染膀胱尿路上皮细胞形态学改变。

统计学分析：用SPSS 19.0软件计算完成，计量资料以x(_)±s表示，组间差异比较采用单因素方差分析进行，两组之间均数的比较采用t 检验；P < 0.05 为差异有显著性意义。

讨论

尾侧型同源转录因子2基因全长有22-23 kb,位于13号染色体q12-13, 含有3个外显子和2个内合子, 而其转录的蛋白包含311个单氨基酸，可通过螺旋-环-螺旋的方式结合于其他基因DNA的相应结合位点，以转录因子的形式调节下游靶基因的DNA的表达^[5-6] 。Mizoshita等^[7]研究发现尾侧型同源转录因子2的mRNA表达水平在人体正常肠道中呈梯度性特征，即从十二指肠到近端结肠为逐渐增加，然后从升结肠至直肠则为逐渐减低，在近端结肠的表达量最高。因此作者选取了尾侧型同源转录因子2表达丰度最高的升结肠黏膜组织进行克隆目的基因；同时用Kozak引物序列来保证克隆扩增效率和扩增的正确性。
正常生物体发育过程中尾侧型同源转录因子2为肠特异性转录因子，调节肠上皮细胞的增殖、分化及维持正常肠上皮形态，对消化道特别是结肠和小肠上皮的分化和发育起着关键的作用，是肠上皮细胞分化及增殖的“control gene”。尾侧型同源转录因子2可特异性地表达于人类肠道及胰腺导管和腺泡上皮等内胚层来源的上皮，但在正常食道和胃黏膜上皮中未检测到表达，除消化系统以外的其他系统的正常上皮也检测不到尾侧型同源转录因子2表达^{[5, 7-8]} 。Ishii等^[9]则认为在鸡的小肠间质细胞中存在有某种物质能够促使鸡胃黏膜上皮细胞表达与人尾侧型同源转录因子2同源的鸡尾侧型同源转录因子1A蛋白，并将胃黏膜细胞介导转化为肠型细胞而发生肠化生。Yamamichi等^[10]最新实验研究证实尾侧型同源转录因子2可调节肠绒毛蛋白的表达。
有研究利用RT-PCR检测出尾侧型同源转录因子2 mRNA在Barrett’s食管和胃黏膜肠上皮化生中有阳性表达^[11] ；尾侧型同源转录因子2蛋白在不同化生程度的胃黏膜肠化生及Barrett’s食管中的阳性率为50%-100%，同肠化生程度相关；并且尾侧型同源转录因子2的表达先于另一些肠道基因产物如碱性磷酸酶、Muc2 等的表达，它们均与肠化生密切相关，一般认为尾侧型同源转录因子2是诱导了这些下游标记物的表达,因此做出这样的推断：认为炎症可能诱导了尾侧型同源转录因子2的表达, 而尾侧型同源转录因子2又促进了肠化生。Liu等^[12]应用尾侧型同源转录因子2过表达在食道鳞状上皮细胞系中，可导致食道肠上皮化生，出现肠上皮细胞特征性形态学改变，并认为尾侧型同源转录因子2是Barrett’s食管的诊断标记物之一。Grainger等^[13]在胃黏膜体外细胞系研究中，过表达尾侧型同源转录因子2可导致胃上皮细胞发生肠上皮形态学改变，尾侧型同源转录因子2的mRNA表达增加，并出现微绒毛等肠上皮特征性改变。这些发现为探索尾侧型同源转录因子2异位表达的启动机制提供了有意义的思路。尾侧型同源转录因子2刺激下游肠道特异性靶基因的转录，启动肠上皮细胞的分化而且可指导正常肠道上皮细胞的发育^[12-13] 。上述研究表明，在体外细胞转染中尾侧型同源转录因子2可以单独诱导细胞向肠表型细胞分化和发育。
作者通过体外过表达试验研究尾侧型同源转录因子2在腺性膀胱炎肠化生中的重要作用及与绒毛蛋白、LI-cadherin的相互关系。首先进行尾侧型同源转录因子2基因克隆，构建反转录病毒载体质粒pLNCX2-Cdx2，并成功培养了膀胱尿路上皮细胞原代细胞；利用转录病毒载体质粒pLNCX2-Cdx2瞬时体外转染膀胱原代尿路上皮细胞，经对尾侧型同源转录因子2，以及肠上皮特异性标志绒毛蛋白和LI-cadherin的蛋白表达和基因检测证实，尾侧型同源转录因子2在体外成功过表达于尿路上皮细胞，并可以导致肠化生发生；并建立了膀胱尿路上皮细胞的肠化生细胞模型。
实验将成功构建的反转录病毒质粒pLNCX2-Cdx2体外转染于人膀胱尿路上皮细胞中，qPCR测定mRNA证实：尾侧型同源转录因子2成功过表达于尿路细胞中，并且激活了肠道特异性标记物绒毛蛋白与LI-cadherin的表达，三者mRNA表达水平明显升高。这一点在用Western blot研究蛋白水平上也得到验证。细胞MTT检测证实转染后尿路上皮原代细胞增殖性也明显增强。
实验发现正常的尿路上皮细胞无论mRNA或者蛋白水平均未能检测到绒毛蛋白与LI-cadherin的表达。但pLNCX2-Cdx2体外转染于膀胱尿路上皮细胞后尾侧型同源转录因子2过表达，可以明显检测到绒毛蛋白与LI-cadherin的表达。膀胱尿路细胞体外细胞过表达尾侧型同源转录因子2后，尾侧型同源转录因子2表达增加并可通过转录方式激活下游的相关肠上皮特异物及其相应转录蛋白绒毛蛋白、LI-cadherin等表达，从而共同促进肠化生的形成。
尾侧型同源转录因子2是肠上皮早期细胞分化的重要转录因子，调节诸如绒毛蛋白、LI-cadherin、MUC2等其他肠道特异性因子的转录，并共同维护肠上皮细胞形态和功能。急性的尾侧型同源转录因子2基因消除可以导致许多肠道特异性因子表达下调，如LI-cadherin、绒毛蛋白及MUC2，并引起肠上皮细胞形态发生改变^[14] 。绒毛蛋白是肠微绒毛特异性的细胞骨架蛋白，特异性的表达在正常肠上皮以及胃肠道腺癌中，在维持刷状缘的微绒毛结构中起到重要作用；肠道外其他的正常组织中不表达；在发生肠化生的Barrett’s食管和胃黏膜肠上皮化生也可以检测到绒毛蛋白表达^[15] 。绒毛蛋白可以被长期的酸性刺激而激活。Ko等^[16]利用免疫组织化学和RT-PCR的方法检测109例胃腺癌和其他的胃黏膜标本中的尾侧型同源转录因子2和LI-cadherin表达情况，表明尾侧型同源转录因子2和CDH17 (LI-cadherin的编码基因)在胃癌中高表达，尾侧型同源转录因子2与LI-cadherin蛋白的表达水平明显相关，并且在胃黏膜肠化生中尾侧型同源转录因子2和LI-cadherin蛋白呈很强的正相关性，认为CDH17基因和尾侧型同源转录因子2有显著的正相关关系。有研究利用外源性尾侧型同源转录因子2基因导入体外HT-29结肠癌细胞系，结果发现LI-cadherin能被尾侧型同源转录因子2诱导而表达增加，LI-cadherin位于尾侧型同源转录因子2下游，推测尾侧型同源转录因子2具有调节下游区LI-cadherin靶基因表达的功能^[17] 。
实验中转染后的尿路细胞形态发生改变，由移行上皮的扁平、不规则、多边形触角转变成为类似于肠上皮细胞的梭形、规则或类圆形，有的甚至还有形成腺腔状的圆圈排列。尾侧型同源转录因子2过表达诱导上皮细胞发生肠化生，出现形态学改变，这与以前的研究一致^{[12, 14-15]} 。结果表明，体外细胞中过表达尾侧型同源转录因子2可致使尿路细胞发生肠化生病理改变，诱导腺性膀胱炎的发生。
此外，作者实验中用qPCR检测到未转染的尿路上皮细胞中有尾侧型同源转录因子2的低表达(相对于GAPDH有 0.013±0.005的表达量)。造成尾侧型同源转录因子2表达的原因估计如下：标本手术切除及原代培养时的修剪造成刺激，多次更换培养基的刺激致使尾侧型同源转录因子2少量激活，表达增加。提示炎症及刺激可能引起尾侧型同源转录因子2的激活，表达增加。
结论：pLNCX2-尾侧型同源转录因子2重组载体在体外转染膀胱尿路上皮细胞后，可以激活下游基因绒毛蛋白与LI-cadherin的表达。说明尾侧型同源转录因子2可以引起膀胱尿路上皮发生肠化生，并对下游基因绒毛蛋白和LI-cadherin有重要的调节作用。尾侧型同源转录因子2是腺性膀胱炎膀胱黏膜发生肠化生的重要启动因子，其激活可能调节一系列下游基因而促进膀胱黏膜肠化生的发生。

Cdx2反转录病毒载体的构建及转染膀胱上皮细胞的研究

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