椎间盘突出患者椎间盘Fas基因的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.43.014

中国组织工程研究

• 脊柱损伤基础实验 basic experiments of spinal injury • 上一篇下一篇

椎间盘突出患者椎间盘Fas基因的表达

吕浩然，杨进顺，黄彦，赵玉，冯善伟

广州医科大学附属第二医院骨外科，广东省广州市 510260

收稿日期:2013-06-27 修回日期:2013-07-09 出版日期:2013-10-22 发布日期:2013-11-02
通讯作者: 杨进顺，教授，广州医科大学附属第二医院骨外科，广东省广州市 510260
作者简介:吕浩然☆，男，1971年生，辽宁省朝阳市人，汉族，2006年中山大学毕业，博士，主任医师，主要从事脊柱脊髓损伤方面的研究。 lvhaoran2006@sina.com
基金资助:
广东省人口计生委科研基金项目(20110325)*，腰椎间盘退变Fas基因突变的筛查及其相关研究；广东省医学科研基金项目(A2011264)*，三维导航下脊椎微创技术及相关工具的研制；广东省科技厅基金项目(2011B031800251)*，实时术中三维导航在骨科颈椎内固定微创技术中的应用研究。

Fas gene expression of intervertebral disc in the patients with intervertebral disc herniation

Lü Hao-ran, Yang Jin-shun, Huang Yan, Zhao Yu, Feng Shan-wei

Department of Orthopedics, Second Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University, Guangzhou 510260, Guangdong Province, China

Received:2013-06-27 Revised:2013-07-09 Online:2013-10-22 Published:2013-11-02
Contact: Yang Jin-shun, Professor, Department of Orthopedics, Second Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University, Guangzhou 510260, Guangdong Province, China
About author:Lü Hao-ran☆, M.D., Chief physician, Department of Orthopedics, Second Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University, Guangzhou 510260, Guangdong Province, China lvhaoran2006@sina.com
Supported by:
Scientific Research Fund Project of Guangdong Provincial Population and Family Planning Commission, No. 20110325*; Guangdong Medical Research Foundation, No. A2011264*; Project of Guangdong Provincial Science and Technology Department, No. 2011B031800251*

摘要/Abstract

摘要：

背景：临床中发现腰椎间盘突出症常在一个家族中多人甚至全部发病，而且发病的部位、原因、症状基本一致，这表明基因在该种病症中扮演着重要的角色。
目的：分析家族性腰椎椎间盘突出症患者椎间盘内Fas凋亡基因表达的特点。
方法：用半定量RT-PCR方法检测15例家族性腰椎椎间盘突出患者、21例普通椎间盘突出患者、5例新鲜尸体椎间盘的软骨终板和髓核组织中Fas基因的表达情况。
结果与结论：家族性椎间盘突出与普通椎间盘突出患者终板内Fas基因的表达均高于新鲜尸体椎间盘终板内Fas基因的表达，差异有显著性意义(P < 0.05)，家族性椎间盘突出与普通椎间盘突出患者终板内Fas基因的表达差异无显著性意义(P > 0.05)。家族性椎间盘突出患者髓核内Fas基因表达与普通椎间盘突出患者、新鲜尸体髓核内Fas基因表达相比较，差异无显著性意义(P > 0.05)。结果可见家族性椎间盘终板中Fas基因的表达增加可能是继发性的，可以通过阻止终板退变来达到阻止椎间盘退变的目的。

关键词: 骨关节植入物, 脊柱损伤基础实验, 腰椎, 椎间盘, 椎间盘突出, Fas, 基因, 表达, 终板, 髓核, 省级基金

Abstract:

BACKGROUND: The clinical research have found that the interbervebral disc herniation often occurs in several members or even all the members of a family, and the location, reason and symptom are basically the same, indicating that genes play an important role in this kind of disease.
OBJECTIVE: To analyze the apoptosis Fas gene expression characteristics of lumbar disc in the familial patients with intervertebral disc herniation.
METHODS: Semi-quantitative reverse transcription-PCR was used to test Fas gene expression of vertebral pulp and cartilage endplate in the intervertebral disc among 15 familial patients, 21 ordinary patients and five fresh cadavers.
RESULTS AND CONCLUSION: Fas gene expression level of endplate of familial and ordinary patients with intervertebral disc herniation was higher than that of fresh cadavers, and there was no significant difference (P <0.05); there was no significant difference in Fas gene expression in endplates between familial patients and ordinary patients with intervertebral disc herniation (P > 0.05). Compared with the vertebral pulps of ordinary patients with intervertebral disc herniation and fresh cadavers, there was no significant difference in the Fas expression of vertebral pulps of familial patients with intervertebral disc herniation (P > 0.05). The increasing Fas gene expression may be secondary in the endplates of familial patients with intervertebral disc herniation, which can prevent intervertebral disc degeneration through preventing the endplate degeneration.

Key words:

lumbar vertebrae, intervertebral disk, imtervertebral disk displacement, antigens, CD95, gene expression, reverse transcriptase polymerase chain reaction

中图分类号:

R318

吕浩然，杨进顺，黄彦，赵玉，冯善伟. 椎间盘突出患者椎间盘Fas基因的表达[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.43.014.

Lü Hao-ran, Yang Jin-shun, Huang Yan, Zhao Yu, Feng Shan-wei. Fas gene expression of intervertebral disc in the patients with intervertebral disc herniation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.43.014.

图/表（结果） 1

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引言

材料方法

设计：前瞻性研究。

时间及地点：实验于2009年2月至2013年1月在广州医科大学附属第二医院实验中心完成。

对象：

家族性椎间盘突出患者的标本：于2009年2月至2013年1月在广州医科大学附属第二医院骨科收集15例家族性椎间盘突出症患者，其中男8例，女7例，平均年龄42岁，均有明显的腰腿痛症状，MRI等诊断明确为腰椎间盘突出症，L_4/5、L₅/S₁为主，术前检查均排除了糖尿病，高血压等其他内科系统疾病。按照Frankel分级：运动功能、损伤平面、感觉功能、脊髓、括约肌功能、功能检查等项目评判，均为D级损伤。从脊柱后路手术中获取椎间盘突出患者椎间盘的髓核和软骨终板。

普通椎间盘突出患者的标本：于2010年2月至2013年1月在广州医科大学附属第二医院骨科收集21例普通椎间盘突出症患者，其中男13例，女8例，平均年龄39岁，术前均向患者讲明取椎间盘组织实验用途并征得同意，经伦理委员会同意，符合医学伦理学要求，均从脊柱后路手术中获取椎间盘突出患者椎间盘的髓核和软骨终板。

新鲜尸体标本：新鲜尸体由广州医科大学解剖教研室提供，经腰椎磁共振检查各尸体均为正常健康的腰椎间盘组织，标本获取经伦理委员会同意，符合医学伦理学要求，女2例，男3例，平均年龄45岁，取标本为L_4/5、L₅/S₁腰椎间盘组织。

所有取得的标本均保存于液氮中。

检测软骨终板及髓核中Fas基因表达所用主要试剂和仪器：

方法：

RNA的提取和检测：采用TRIS法从人的椎间盘髓核和软骨终板中提取总RNA。采用1.2%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。取5 μL RNA以1∶20的比例用10 mmol/L Tris(pH 7.5)溶液稀释后，用紫外分光光度仪测量其230，260，280 nm处吸光度值(A)，计算A₂₆₀/A₂₈₀，A₂₆₀/A₂₃₀的比值。A₂₆₀/A₂₈₀的比值在1.7-2.0之间，表明蛋白污染少；A₂₆₀/A₂₃₀的比值在2.0以上，表明没有异硫氰酸胍的污染。

PCR扩增：

PCR引物：上游引物：5’CGA GAA TCA AAT GGA GCC G 3’，下游引物：5’CAC AAC ACC TTT CAC CAC GAC 3’。由上述两条引物所扩增的DNA片断理论长度为251 bp。

反应体系组成：10×反应缓冲液5.0 μL，dNTP mix (10 mmol/L each) 5.0 μL，50 mmol/L MgCl₂ 10 μL，RNase inhibitor 0.7 μL，上游引物0.7 μL，下游引物 1.0 μL，AMV 反转录酶1.0 μL，模板RNA 3.0 μL，DNA 聚合酶20 μL，灭菌去离子水(DEPC处理) 0.5 μL，总反应体积50 μL。

热循环参数：cDNA合成、AMV反转录酶灭活50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min 1个循环，PCR扩增：变性 94 ℃ 30 s，退火 50 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 30 s 35个循环，72 ℃ 7 min，4 ℃保存。

PCR产物的琼脂糖凝胶电泳：将扩增产物在1.5%的琼脂糖中凝胶电泳40 min，在紫外光透射下经Polaroid凝胶成像摄片系统摄片，计算Fas的吸光度值与内参ß-actin的吸光度值的比值。

主要观察指标：家族性椎间盘突出症患者软骨终板及髓核、普通椎间盘突出症患者软骨终板及髓核、新鲜尸体的软骨终板及髓核中Fas基因的表达。

统计学分析：半定量结果用x(_)±s表示，采用SPSS 11.0软件进行单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

退变性椎间盘疾病是以椎间盘退变为基本病理基础而引起的，包括颈椎病、椎间盘突出症、椎间盘源性疼痛、椎管狭窄症、脊柱节段不稳、退变性脊柱侧弯症及脊柱滑脱症等一系列临床脊柱疾患^[1-2]。下腰痛是脊柱外科的常见病、多发病，人一生中发生下腰痛的概率为60%-80%，不仅造成个体劳动力丧失，而且消耗大量的医疗资源和费用。在成人丧失劳动能力的原因中，下腰痛位居第3位，腰椎间盘突出为下腰痛的主要病因^[3-4]。对椎间盘病变的病因和病理学研究一直在不断地进行，但迄今为止对椎间盘病变的根本病因及病理机制并不完全清楚。通常认为椎间盘的正常生理退变是引发椎间盘病变的根本因素，椎间盘损伤、长期从事引起脊柱震动的工作、脊柱过度负荷、吸烟和过高的身高是椎间盘疾病的诱发因素^[5-6]。现今临床上对于椎间盘退变引起的下腰痛多先采用保守治疗，对于通过正规保守治疗症状不能缓解的患者，采用手术治疗。应用最广泛的手术是椎间盘切除和脊柱融合术，近年来，这两类手术技术取得了长足的进步，微创外科技术的应用使创伤越来越小且确实、有效地缓解了症状。但是，减压后必然导致椎间关节结构、形态、功能异常和不稳定，融合后亦加速邻近节段的退变，远期优良率在70%左右，疗效并不理想。为提供更好地治疗方法就必须清楚椎间盘退变的病因和确切发病机制，目前为止，椎间盘退变的发病机制仍不明了^[7-9]。

20世纪90年代就已经在国外的文献中报道临床调查发现了椎间盘退行性病变可能具有家族倾向性，因文献报道样本量较小，相似报道较少等原因使得研究工作对基因遗传在椎间盘退变发生发展的作用机制的认识和研究主要停留在临床调查报道层面，并无基础研究的深入探讨^[10-11]。20世纪曾经有国内文章报道，国内的一家医院在十几年临床中陆续检查发现了有父母兄弟姐妹等直系血缘关系的亲属中有超过2人以上的亲属被发现发生了腰椎退行性病变引起的相关脊椎疾病患者，总共有20个家庭总数达到41例患者，家族性发病人数达到该医院同期此类疾病的总数1.1%；报道同时发现家族性发病病例之中又以女性发病患者居多^[12-14]。

国外有学者针对出现越来越多的家族性腰椎病变患者作了相关的病史访问调查，结果显示已经确诊椎间盘突出症的患者其直系亲属曾经有腰椎间盘突出症阳性症状出现的阳性率达到32%；而与椎间盘突出患者年龄、性别相同但没有腰椎病变发生的正常人群，其家庭成员也被作为对照组作为研究，结果显示只有不足7%的阳性家族病史；椎间盘突出症患者的家族阳性的相对危险性明显高于普通人群。此报道只限于临床资料数据的总结分析对照研究，缺乏分子生物学基础实验研究对其佐证^[15-16]，并不能直接证明遗传因素在椎间盘病变发生、发展过程中的必然作用。但是，基因变异或缺陷可能是椎间盘退变的重要因素已经引起了临床及及基础研究的极大兴趣^[17]。

近年来，应用各种先进手段对椎间盘结构、生化成分、致病因素、相关因子、基质酶类等进行方兴未艾的研究，尤其是椎间盘退变的遗传学作用是国内外的众多基础及临床学者的兴趣所在^[18-20]。随着逐渐深入的相关遗传基因的分子生物学水平研究，研究人员陆续筛查发现了一些与椎间盘病变相关的具有遗传特性的特异性基因，越来越多的基础实验结果表明，特异性的遗传因素在椎间盘退变的过程中发挥了大家没有想到的重要关键作用。研究发现，一些与腰椎退变相关遗传基因的变异和椎间盘病变有密切的关系，携带某些特异变异基因的成年人发生椎间盘退变、椎间盘突出的年龄明显早于健康人群的对照组；同时，国外有学者发现，家族中携带某些特异变异基因的家族成员的椎间盘突出发生率几乎为100%^[21-22]。而且，近年的研究表明这些变异的基因大多具有明确的子代继承与外显等遗传特性。已经研究发现的遗传因素中与腰椎间盘退变相关的基因位点按照其特点主要有如下：与椎间盘结构整体稳定性相关的遗传基因；与疼痛发生有关的疼痛信号通路相关基因；腰椎间盘突出周围区域的炎症相关基因。目前的研究还不能确定是哪类基因在腰椎间盘的退变中最终起到了关键作用^[23-25]。

椎间盘结构的整体稳定性对椎间盘的退变发生作用重要，近年发现了一些与此相关的椎间盘结构基因如：包括蛋白聚糖(AGC-1)、Ⅰ型胶原(COL1A1)、Ⅸ型胶原(COL9A2 和COL9A3)、Ⅺ型胶原(COL11A1、COL11A2)和软骨中间层蛋白(CILP)相关基因^[26-27]。椎间盘退变的合成及分解代谢相关基因包括：编码生长分化因子5(GDF-5)、基质金属蛋白酶1和3(MMP-1和MMP-3)、维生素D受体(VDR)、胰岛素样生长因子１(IGF-1)、金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP1)及凝血酶敏感蛋白2(THBS2)。已经有学者开始关注疼痛信号通路相关基因的多态性与椎间盘退变的相关性。有作者对儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)基因突变与椎间盘突出患者手术治疗后效果之间的关系进行了研究，通过单标志物分析得出，含COMT SNPs rs4633 的术后功能障碍指数(ODI)分值能够得到更好的改善。单倍型分析也得出常见的单倍型“ATCA”与功能障碍指数分值能够得到更好的改善有关。含“ATCA”COMT 单倍型者在研究人群中功能障碍指数得到最大改善。研究结果表明，与炎性疼痛和周围神经痛相关的GTP环化水解酶(GCH1)的一个单倍型可显著降低因持续放射性腰痛进行椎间盘切除术患者的疼痛。编码四氢生物蝶呤合成过程中的限速酶基因-GTP环化水解酶基因中的SNP与腰椎间盘退行性疾病患者手术治疗效果存在相关性，GTP环化水解酶的一个单倍型“CACTTGTTTGAC”可显著降低因持续放射性腰痛行椎间盘切除术患者的疼痛。炎症相关基因在椎间盘疾病的发生、发展过程中发挥着重要作用^[28-30]。白细胞介素1、白细胞介素6等炎性因子具有促进椎间盘蛋白多糖降解、抑制其合成、参与椎间盘炎症反应等作用，其被认为在椎间盘退变及椎间盘源性腰腿痛的发生发展中起重要的作用。此外，其他包括黑素皮质素受体1、瞬时受体电位通道蛋白A1、脂肪酸酰胺水解酶和μ阿片受体以及镇痛剂药物代谢酶CYP2D6等，目前被发现的与腰椎退变引起相关临床症状如：疼痛、麻痹、无力等可能发挥作用的相关基因的遗传多态性的相关性尚未见相关报道。

与椎间盘退变有相关性的Fas，又称APO-1或CD95，是肿瘤坏死因子或神经生长因子受体超家族成员，是一种凋亡信号受体^[31]。一般情况下Fas表达稳定，广泛存在于多种组织细胞(尤其是免疫细胞表面)，而FasL在T细胞活化后短暂表达。人的Fas包含335个氨基酸，属Ⅰ类跨膜蛋白，分子质量为45 ku。Fas的细胞浆区氨基酸顺序中约有70个氨基酸为传递细胞凋亡所必需，称为“死亡区段”。人的Fas基因位于人染色体IOq24.1，由9个外显子和8个内含子组成。已有报道指出，在启动子区有两个多态性位点：①fl1A-670G。它是一种常见的错义突变，即670位腺嘌呤fadeniHe，A1被鸟嘌呤(guanine，G)取代。②G-1377A，该位点位于“静区”。Fas基因位点G-1377A多态性和Fas基因位点A-670G多态性，分别位于SP-1共有序列、信号转导和转录激活因子1(fsignal transducers andactivators of transcription 1，STAT1)中，可影响Fas蛋白的表达，使凋亡信号传导失调，在滋养细胞凋亡过程中起重要作用，FasL为Ⅱ型跨膜蛋白，含279个氨基酸，属肿瘤坏死因子超家族成员，分子质量为31-40 ku。人FasL基因，位于人染色体lq23，由4个外显子组成。已有报道指出：在启动子区有一个多态性位点，C-844T该位点位于CAAT盒增强子结合蛋白13转录因子的假定结合的基础上。研究已经揭示了FasL基因位点C-844T多态性可影响FasL蛋白的表达和FasL介导的凋亡过程。目前，关于Fas基因与腰椎间盘退变的作用关系，国内报道尚很少见^[32-33]。

有学者对Fas基因在不同类型的遗传疾病中的作用进行了研究，如系统性红斑狼疮患者一直被认为是遗传基因的变异或缺失导致患者成年后发病，经过患者外周血的Fas分子生物学DNA的测序检查发现了Fas基因的表达异常，从而验证了基因的异常表达在系统性红斑狼疮患者发挥作用；同时有研究发现，活动期溃疡性结肠炎患者血清Fas水平较正常正常健康人群显著降低，而其他几种免疫性疾病的研究也陆续报道家族遗传患者血清Fas水平较正常人增高，也提示了Fas的基因多态性与遗传疾病的发生有密切关系，国内外相继出现一系列关于Fas-670位点多态性与自身免疫性疾病相关性研究的报道较多，尚未有统一定论^[34-35]。关于椎间盘退变确切发病原因目前仍然不清楚。近年来的研究认为，细胞凋亡的增加是椎间盘退变、椎间盘突出发生和发展的重要因素^[36]。

实验研究发现家族性椎间盘突出症患者髓核内的Fas表达为1.10±0.18，与普通椎间盘突出症患者1.22±0.21及新鲜尸体的Fas表达结果0.89±0.16相比均数值较为接近，统计结果差异无显著性意义(P > 0.05)，提示整个椎间盘退变过程中，参与启动凋亡程序的髓核组织内的Fas在腰椎间盘退变过程中并不起主要的作用，椎间盘退变过程中髓核的脱水及变性只是一个被动的并发损伤结果。家族性椎间盘突出症患者终板Fas表达为2.65±0.32，与普通椎间盘突出症患者的终板软骨(2.79±0.24)和新鲜尸体组(1.28±0.10)相比较均明显高表达，与新鲜尸体组对比差异均有显著性意义(P < 0.05)，提示Fas作为凋亡的信号受体，更多地在椎间盘组织的终板内表达，随着椎间盘终板软骨的退变凋亡细胞急剧增加，Fas的表达也随之增高，Fas的表达增高可能是终板软骨损伤的继发结果^[37-38]，与国内的部分研究报道相符合。作者初步推断在椎间盘退变过程中，是终板软骨的凋亡损伤，使得髓核的营养供应及代谢出现障碍，继而髓核组织出现损伤，髓核组织的损伤使得整个腰椎间盘系统在脊柱的承重及运动过程中更容易加重损伤，一个损伤的负循环启动使得椎间盘最终退变、突出。家族性椎间盘突出症患者与普通椎间盘突出症患者的终板软骨内Fas基因表达比较没有显著性差异，提示了Fas基因与椎间盘突出症遗传无显著性相关。考虑可能原因，由于研究椎间盘突出患者Fas基因表达变化的病例数较少，且病例采集多集中在南方广东地区人群，这一结果有待进一步扩大样本量后证实。Fas在髓核组织内低表达也许涉及缺失的其他机制，比如Fas启动子有突变或甲基化使基因不能转录，也可能DNA- mRNA-蛋白质并非完全对应关系，存在翻译后修饰，蛋白降解等。

无法确定椎间盘退变病因的主要原因在于对椎间盘退变的机制仍然不是完全明了^[39]。近年来有学者推测是由于某种原因导致腰椎间盘内的某种变化，从而启动上述的炎症递质、细胞因子和酶系统，引发了不可逆转的病理生理过程，从而导致了腰椎间盘退变的发生^[40]。作者推测年龄、遗传、损伤等因素在腰椎间退变中都发挥了一定的作用，在他们综合作用下使腰椎间盘内病理生理机制的发生达到临界点而启动，这与某些学者的假设有相似之处，不同在于作者认为遗传因素在其中可能是重要的病因，年龄和损伤均为一种辅助因素^[41-42]。正确的发病机制是有遗传基因变异的缺陷人群在某种程度上改变了腰椎间盘的正常的组织结构，脊柱结构存在的椎间盘退变趋势明显高于普通人群，由此显著增加了椎间盘损伤发生的概率，年龄和损失等因素使腰椎间盘退变的发生更加容易，它们较小的外力均有可能导致椎间盘的损伤，从而启动退变机制，导致临床症状^[43-45]。终板中Fas基因的表达增高，可能是椎间盘的Fas表达增高的最重要原因，基因治疗可以通过阻止终板凋亡退变来达到阻止整个椎间盘退变的目的。

从遗传学角度对退变性椎间盘疾病的致病基因和易感基因进行定位、鉴定和遗传流行病学研究，有着很大的发展前景，但同时也有一定的局限性^[46]，因进行基因多态性与疾病关联性分析涉及的标本数量少，会影响结果的准确性和真实性。遗传学的研究加深和提高了医生对退变性椎间盘疾病的认识和了解，为退变性椎间盘疾病的治疗开创新的手段和方法提供了线索。制定明确可靠的术前诊断及入选标准，在不同人群中开展长期、大样本病例对照研究非常必要，这些工作将有助于揭示腰椎间盘退变遗传学机制，从而为个性化预防和治疗椎间盘退变开辟新的道路^[47-48]。

总之，Fas基因的研究为进一步证实探讨椎间盘退变相关基因以及研究Fas在不同疾病遗传中的作用提供新的线索，进一步认识、预防、治疗椎间盘疾病的研究还需要不断深入。目前，尚需开展相关研究确定Fas基因多态性在预测椎间盘退变突出时的有效性，临床妇女可在妊娠前进行该基因的筛选。对椎间盘退变的相关突变基因型的妇女进行早期干预，可能会纠正细胞凋亡，降低椎间盘退变突出的发病风险，并有助于指导治疗。

椎间盘突出患者椎间盘Fas基因的表达

Fas gene expression of intervertebral disc in the patients with intervertebral disc herniation

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