骨髓间充质干细胞复合温敏水凝胶支架的制备

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.42.015

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (42): 7435-7441.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.42.015

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骨髓间充质干细胞复合温敏水凝胶支架的制备

李艺楠^{1, 2}，李广峰²，冯新民¹，黄成²，肖海祥²，杨建东¹

1苏北人民医院脊柱外科，江苏省扬州市 225009
2扬州大学医学院，江苏省扬州市 225001

收稿日期:2013-07-13 修回日期:2013-08-07 出版日期:2013-10-15 发布日期:2013-10-31
通讯作者: 杨建东，博士，硕士生导师，主任医师，副教授。苏北人民医院脊柱外科，江苏省扬州市225009 yangjiandong69@sohu.com
作者简介:李艺楠★，男，1987年生，江苏省徐州市人，汉族，扬州大学医学院在读硕士。主要从事经GDNF神经营养因子诱导干细胞复合细胞支架修复脊髓损伤研究。 poplicj@163.com
基金资助:
国家自然科学基金(81071466/H0605)*

Preparation of a thermosensitive hydrogel scaffold combined with bone marrow mesenchymal stem cells

Li Yi-nan^{1, 2}, Li Guang-feng², Feng Xin-min¹, Huang Cheng², Xiao Hai-xiang², Yang Jian-dong¹

1Department of Spinal Surgery, Northern Jiangsu People’s Hospital, Yangzhou 225009, Jiangsu Province, China
2School of Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China

Received:2013-07-13 Revised:2013-08-07 Online:2013-10-15 Published:2013-10-31
Contact: Yang Jian-dong, M.D., Master’s supervisor, Chief physician, Associate professor, Department of Spinal Surgery, Northern Jiangsu People’s Hospital, Yangzhou 225009, Jiangsu Province, China yangjiandong69@sohu.com
About author:Li Yi-nan★, Studying for master’s degree, Department of Spinal Surgery, Northern Jiangsu People’s Hospital, Yangzhou 225009, Jiangsu Province, China; School of Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China poplicj@163.com
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81071466/H0605*

摘要/Abstract

摘要：

背景：壳聚糖及其衍生物制备的支架对细胞迁移和神经轴突再生有重要作用。壳聚糖及其衍生物的组织相容性好，易使干细胞在其表面附着生长，在神经组织工程具有较为广阔的应用前景。
目的：制备适宜骨髓间充质干细胞生长的壳聚糖/壳聚糖季铵盐/甘油磷酸钠温敏性水凝胶细胞支架，观察骨髓间充质干细胞在细胞支架中的生长情况。
方法：将壳聚糖进行季铵盐化改性处理，通过傅里叶变换红外光谱分析谱检测确定其生成。实验以壳聚糖与壳聚糖季铵盐配比为8∶1成功制备出较为稳定的壳聚糖/壳聚糖季铵盐/甘油磷酸钠温敏性温敏水凝胶细胞支架，观察成胶情况，并进行生物安全性检测。
结果与结论：实验在傅里叶变换红外光图谱上发现了季铵基基团的特征峰。细胞毒性实验显示，水凝胶浸提液干预的大鼠骨髓间充质干细胞无毒性。急性全身毒性实验显示，浸提液对大鼠体质量增加无明显影响，支架生物安全性较好。扫描电镜观察显示，骨髓间充质干细胞在细胞支架中能正常的生长和增殖。结果证实，实验成功制备了壳聚糖/壳聚糖季铵盐/甘油磷酸钠温敏性水凝胶细胞支架，适合骨髓间充质干细胞生长和增殖。

关键词: 生物材料, 生物材料基础实验, 药物控释材料, 壳聚糖季铵盐, 细胞支架, 生物安全性, 骨髓间充质干细胞, 组织修复, 温敏水凝胶, 甘油磷酸钠, 体外培养, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Scaffolds made of chitosan and its derivatives play an important role in cell migration and axonal regeneration. Chitosan and its derivatives have good histocompatibility, which is easy to make stem cells grow on the surface, thereby having a more broad application prospect in the nerve tissue engineering.
OBJECTIVE: To fabricate a thermosensitive hydrogel scaffold using chitosan/hydroxypropyltrimethyl ammonium chloride chitosan/sodium glycerophosphate (CS/HACC/GP), which is suitable for cell growth, and then, to observe the growth and proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells on the scaffold.
METHODS: Chitosan was modified using quaternary ammonium salt and confirmed by Fourier transform infrared spectroscopy. The chitosan and quaternary ammonium salt of chitosan was mixed at a ratio of 8:1 to successfully prepare stable CS/HACC/GP thermosensitive hydrogel scaffold. Then, the gelling was observed, and biosafety test was conducted.
RESULTS AND CONCLUSION: Fourier transform infrared spectroscopy showed the characteristic peak of quaternary ammonium groups. Cytotoxicity test showed that rat bone marrow mesenchymal stem cells cultured in hydrogel extracts had no toxicity. 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide test showed that hydrogel extracts exerted no significant effect on the increase in body weight, and the biological safety of the scaffold was good. Under the scanning electron microscopy, bone marrow-derived mesenchymal stem cells grew and proliferated normally in the scaffold. The results confirmed that the CS/HACC/GP thermosensitive hydrogel scaffold was successfully prepared in the experiment, which is suitable for the growth and proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells.

Key words: hydrogel, mesenchymal stem cells, bone marrow, tissue engineering, chitosan

中图分类号:

R318

李艺楠，李广峰，冯新民，黄成，肖海祥，杨建东 . 骨髓间充质干细胞复合温敏水凝胶支架的制备[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(42): 7435-7441.

Li Yi-nan, Li Guang-feng, Feng Xin-min, Huang Cheng, Xiao Hai-xiang, Yang Jian-dong . Preparation of a thermosensitive hydrogel scaffold combined with bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(42): 7435-7441.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析 大鼠15只均进入结果分析，无死亡和感染，无脱失值。

2.2 壳聚糖季铵盐的傅里叶红外线检测结果 壳聚糖和壳聚糖季铵盐红外光谱图典型差别在壳聚糖季铵盐波长1 599.0 cm^-1处的吸收峰消失了，表明壳聚糖分子中亲核中心-NH₂上的H已经被-CH₂CH(OH)CH₂N+ (CH₃)Cl-部分取代并生成了2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖。而且在3 400 cm^-1处壳聚糖季铵盐的吸收峰变宽，说明-OH的吸收变强，同时也说明了阳离子醚化剂与壳聚糖的氨基上发生取代，基本不与苯环上的羟基反应。

2.3 壳聚糖/壳聚糖季铵盐/甘油磷酸钠水凝胶的成胶情况 见图1，2。

实验制备的壳聚糖/壳聚糖季铵盐/甘油磷酸钠温敏水凝胶在温度低于35 ℃时保持液体流动状态，当温度高于35 ℃时则转变成凝胶状态。温敏性水凝胶在37 ℃水浴中10 min成胶。成胶前为透明、流动性液体，成胶后为固态、乳白色凝胶成胶前溶液可用注射针头注射。成胶后则不可注射具有一定黏性和弹性，可任意塑型，水凝胶内部结构均为三维多孔网状结构。

2.4 壳聚糖/壳聚糖季铵盐/甘油磷酸钠水凝胶支架的降解率 此支架的降解率随着时间的迁移，逐渐增加。前8周支架降解较缓慢，大约在第8周后降解速度增加，第12周时降解率大约为38%。可见支架可为种植于其中的细胞及时为细胞生长、组织生成听过适当的空间。材料降解液的pH值在12周以内基本平稳，保持在pH 7.2左右，无明显变化。见图3。

2.5 骨髓间充质干细胞形态及细胞毒性 培养1周的骨髓间充质干细胞在倒置显微镜下观察到，细胞在6孔板上生长和增殖，伸展良好，呈梭形、多边形或不规则形，见细胞圆缩及悬浮细胞。观察骨髓间充质干细胞在支架浸润液中可见细胞绝大部分贴壁，细胞伸展生长良好，细胞呈梭形、多边形或不规则形，无明显的细胞结构损伤，细胞在支架浸提液中培养未见明显毒性反应。图4中所示，材料浸提液注射后24 h后，所有组间平均吸光度值均差异无显著性意义(P > 0.05)，表明材料浸提液对细胞与培养液对细胞毒性无差异，即无毒性。根据方法中的公式计算细胞相对增值率，再根据RGR 值进行细胞毒性分级，得MTT法检测材料浸提液的细胞增力的毒性评级为0或1级，说明壳聚糖水凝胶具有良好的细胞相容性，壳聚糖水凝胶可作为细胞培养的支架材料。

2.6 壳聚糖/壳聚糖季铵盐/甘油磷酸钠水凝胶支架对大鼠体内环境的全身毒性反应及体质量的影响 生理盐水组及浸提液组注射后一般状态良好，未见毒性反应及死亡。注射苯酚组注射后出现寒战，发抖，眼睛略有水汪汪表现，数分钟后逐渐好转，一般状态好，无死亡。

注射后24，48，72 h，生理盐水组及浸提液组的大鼠平均体质量与苯酚组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

2.7 骨髓间充质干细胞在壳聚糖凝胶中的形态 此支架内部结构为三维疏松网状结构，其空隙大于细胞直径，完全满足细胞正常生长、增殖及物质交换的需要。骨髓间充质干细胞与支架材料复合培养10 d时，细胞牢固茹附于支架材料内表面，呈铺展式生长，17 d时，多数骨髓间充质干细胞在支架上呈多角形生长，并生出多条小突起，支架材料及材料多通道内表面己基本被细胞覆盖，无细胞毒性，见图5。结果表明，细胞在细胞支架中可以正常吸附贴壁、生长与增殖，细胞与支架具有良好的生物相容性。

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引言

神经组织损伤后早期治疗的目的是解除对组织的机械压迫，减轻或消除继发性病理反应，从链式反应的环节上终止损伤反应，最大限度的恢复组织结构与功能，减少继发性损伤对组织的破坏，降低患者致残率与死亡率，减轻患者痛苦，提高其生活质量，减轻社会负担。目前临床治疗方法主要有手术治疗、药物治疗，理疗等方法。

随着纳米技术、基因工程、细胞组织工程研究的发展，基因治疗、神经组织工程、干细胞移植修复组织损伤成为目前研究热点^[1-2]。细胞的选择类型种类繁多，实验选择骨髓间充质干细胞作为移植细胞，骨髓间充质干细胞作为移植种子细胞具有多种优点。但是单纯移植细胞，存在一些弊端，在缺乏有效支撑的情况下，周围组织易塌陷，对细胞造成挤压，导致轴突不能充分延伸和周围正常组织形成突触。组织工程是构建仿生组织工程支架材料，并将体外分离培养的种子细胞种植到具有一定结构的生物材料支架上，构成具有生物活性的细胞-支架复合物，种植于组织损伤部位，恢复其解剖学的结构和功能^[3-4]。目前复合支架根据材料来源可分为以下几种：①天然-天然材料复合支架，如胶原-壳聚糖、明胶- 壳聚糖、胶原-硫酸软骨素等。②天然-人工材料复合支架，如聚乙烯醇-壳聚糖、透明质酸-戊二醛等。③人工-人工材料复合支架，如聚乳酸-聚羟基乙酸聚合物、甲基丙烯酸羟乙酯-甲基丙烯酸甲酯复合物等，以及3种或3种以上来源的如天然-人工-天然材料、人工-天然-人工材料等复合支架。而实验选用的壳聚糖及其衍生物制备的支架对细胞迁移和神经轴突再生有重要作用。壳聚糖及其衍生物组织相容性好，物理性状接近脑组织，力学特性和损伤组织相似，具有一定的黏弹性和抗压性能^[5]，易使细胞在其表面附着生长、在神经组织工程具有较为广阔的应用前景^[6-8]。

水凝胶作为组织工程材料的一个重要分支，是一种亲水性极强但不溶于水的一种高分子聚合物网络，属于复合支架中的一种。水凝胶作为组织工程支架应符合生物相容性、生物降解性、高含水量和力学强度等方面的要求。壳聚糖/甘油磷酸盐作为温敏性的凝胶，是一个较新的领域，在新型细胞支架的应用中具有较大的潜力。

实验将现行较为普遍的壳聚糖支架季铵盐化，通过测试其生物相容性及细胞毒性，以期证实其作为细胞支架的可行性，并通过实验分析验证季铵盐壳聚糖相比传统细胞支架的优势所在。

材料方法

设计：细胞学体外实验。

时间及地点：于2012年4月至2013年2月在扬州大学医学院生化实验室及化学化工学院生物材料实验室完成。

材料：

动物：健康雌性SD大鼠15只，体质量220-250 g，由扬州大学动物科学学院提供，动物许可证号：SYXK(苏)2012-0029。

细胞：骨髓间充质干细胞由本课题组提供，利用梯度离心法从上述同批大鼠股骨骨髓中分离提取原代骨髓间充质干细胞，经复苏后选取第4代骨髓间充质干细胞作为实验细胞。

大鼠骨髓间充质干细胞复合壳聚糖/壳聚糖季铵盐/甘油磷酸钠温敏水凝胶的制备主要试剂及仪器：

实验方法：

季铵盐壳聚糖的制备：将壳聚糖溶于体积分数1%的乙酸溶液，用氢氧化钠调节壳聚糖溶液pH 7，抽干水分在白色沉淀物中加入异丙醇，滴入2，3-环氧丙基三甲基氯化铵异丙醇溶液，反应结束后加入无水乙醇沉淀，黏稠物颜色变浅，抽滤，将干燥后的壳聚糖季铵盐溶于水，砂芯漏斗过滤，滤液用丙酮沉淀得到淡黄色精制产物。

季铵盐壳聚糖的物理检测：傅里叶变换红外光谱分析：将季铵盐壳聚糖配制成过饱和溶液，溶解24 h后离心，去除上清夜，干燥，通过考察溶解前后质量差计算季铵盐壳聚糖溶解度(S)。

其中，m₁(mg)指季铵盐壳聚糖质量，m₂(mg)指离心干燥后剩余季铵盐壳聚糖的质量，V(mL)为蒸馏水的体积。

壳聚糖/壳聚糖季铵盐/甘油磷酸钠温敏水凝胶的制备：配制体积分数50%的α，β-甘油磷酸钠溶液及0.1 mmol/L的乙酸，将0.16 g壳聚糖与0.02 g季铵盐壳聚糖的混合物和0.18 g壳聚糖分别溶解于7 mL的0.1 mol/L的乙酸溶液中，再加入H₂O 2 mL稀释溶液，将上述溶液冰浴15 min，冰浴搅拌中分别将α，β-甘油磷酸钠逐滴加入壳聚糖及季铵盐壳聚糖混合溶液中，即得温敏水凝胶壳聚糖/季铵盐壳聚糖/甘油磷酸钠及壳聚糖/甘油磷酸钠。

细胞支架降解率及降解液pH值的测定：将壳聚糖/季铵盐壳聚糖/甘油磷酸钠支架剪成规则的条状，准确称质量m₀，37 ℃下浸泡于10 mL pH 7.2的PBS中，每周换液。定期取样，冲洗后干燥称质量，第n次质量记为m_n。质量损失通过公式计算。每周取其降解液用pH-3BC精密数显酸度计测定其pH值。

大鼠骨髓间充质干细胞培养及形态观察：在6孔细胞培养板中每孔接种生长良好的第4代大鼠骨髓间充质干细胞悬液(1×10⁹ L^-1)0.5 mL，加入含有双抗的培养液DMEM，放入无菌适温环境内生长，每隔两三天使用无菌PBS清洗，更换培养基。培养1周后倒置显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态及生长情况。

温敏凝胶浸提液的制备：参照浸提液细胞毒性实验标准，吸取1.7 mL无菌的壳聚糖水凝胶加入6孔细胞培养板中，细胞培养箱中使之转变成凝胶状，向孔内加入 8 mL细胞培养液，得到温敏凝胶的浸提液，除菌后备用。

MTT法测定支架材料的细胞相对增殖率及细胞毒性：以不同支架材料浸提液浓度为指标分为7组：1组原液培养，2-6组：体积分数75%，50%，25%，12.5%，6.25%浸提液培养，7组普通细胞培养液培养的对照组，向已生长有骨髓间充质干细胞的96孔板中每孔加不同组别材料浸提液，每组5个样本。并加入MTT液，孵育4 h后弃上清，每孔加150 μL DMSO，振荡10 min，使结晶物充分融解。MTT液比色检测：选择490 nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各组吸光度值。计算相对增殖率，再根据计算值进行细胞毒性分级(0-5级)。

分组及急性全身毒性实验：将15只大鼠随机分为3组，浸提液组按25 mL/kg将水凝胶生理盐水浸提液原液通过尾静脉注射，生理盐水组(阴性对照组)为同批号无菌生理盐水，苯酚组(阳性对照组)为0.25%的除菌苯酚溶液。观察注射后24，48，72 h大鼠的一般状态、毒性表现及死亡情况，并称量体质量，观察体质量变化，用以检测制备的细胞支架对活体内环境的全身毒性反应。

支架的生物相容性检测：吸取1.7 mL无菌的壳聚糖水凝胶加入6孔细胞培养板中，铺匀，置37 ℃细胞培养箱中3 h，使之转变成凝胶状。每孔接种生长良好的第4代骨髓间充质干细胞悬液(1×10⁹ L^-1) 0.5 mL，观察骨髓间充质干细胞形态及生长情况。细胞形态分析标准：无毒-细胞形态正常，贴壁生长良好；轻度毒性-细胞贴壁生长好，但可见少数细胞圆缩，偶见悬浮细胞，中度毒性，细胞贴壁生长不佳，细胞圆缩达1/3以上，见悬浮死细胞，重度毒性，细胞基本不贴壁，90%以上为悬浮死细胞。

主要观察指标：观察浸提液注射后大鼠的一般状态、毒性表现、死亡、大鼠体质量变化及支架的生物相容性。

统计学分析：计量资料用x(_)±s表示，技数资料用率表示，组间均数差异的比较采用两样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

实验旨在使用骨髓间充质干细胞复合温水凝胶细胞支架治疗组织损伤。用于实验的种子细胞有很多，其中骨髓间充质干细胞骨髓间充质干细胞取材方便，可从骨髓穿刺获取，操作容易，损伤少，安全性好，可实现自体移植，具有免疫原性弱，易于培养扩增，在体内、体外均有分化为神经细胞和胶质细胞的潜能，能在多种三维支架上黏附、生长、增殖和分化，并复合三维支架材料移植修复组织缺损^[9]，迁移的骨髓间充质干细胞能对环境、细胞因子和一些信号做出反应，与周围组织发生联系，表达神经细胞特有标志蛋白、神经元烯醇化酶及神经胶质酸性蛋白等^[10]，分泌种类众多的细胞因子和生长因子，以及黏附分子和细胞外基质保护和促进损伤的神经组织功能恢复，具有广阔的应用前景。同时已有相关研究证实骨髓间充质干细胞与壳聚糖材料支架复合的可能性^[11]，实验采用从大鼠股骨内提取的原代培养的骨髓间充质干细胞作为种子细胞，用来与细胞支架复合。可观察到骨髓间充质干细胞在体外培养条件下，能在壳聚糖/壳聚糖季铵盐/甘油磷酸钠凝胶内良好的黏附、生长和增殖。

近年来，有关壳聚糖及其复合凝胶在组织工程细胞支架中的应用类文章如下(按主题排序)：

壳聚糖为提取自海洋甲壳类生物的天然高分子多聚糖，是自然界惟一存在的聚阳离子多糖。因其具抗菌性、生物可降解性、安全无毒、生物相容性、细胞黏附性等多种独特优良性能^[12]，能保护DNA免受DNase的降解等多种独特的优点，适合作为非病毒基因转运载体，逐渐受到更多学者的关注^[13]。目前壳聚糖甘油磷酸盐温敏水凝胶的研究逐渐增多。温度敏感水凝胶属于复合支架材料，能够根据外界环境温度的变化而发生溶胶-凝胶转变或者可逆体积转变，广泛应用于组织工程、药物释放系统等的研究。它的制备条件温和，在室温或低于室温下可较长时间保持液态，而温度升高到体温后发生胶凝，相变温度与人体体温接近甚至低于人的体温，没有引入化学交联剂等可能产生细胞毒性的物质，具有良好的生物相容性和生物可降解性，在组织工程和药物缓释载体等方面具有极大的应潜力。甘油磷酸盐为强碱弱酸盐，在人体内主要功能是调节水、电解质及酸碱平衡。Zhou等^[14]分别研究了两种甘油磷酸盐(β-甘油磷酸钠和α，β-甘油磷酸钠混合物)对于成胶性能的影响，研究表明α，β-较β-具有更快的成胶速度。因为α，β-中的α-为线性分子结构，其形成的空间位阻较β-的要小，体系中的壳聚糖分子间的疏水相互作用更易于形成。

壳聚糖的衍生物及其复合凝胶也是目前细胞支架的热点问题。季铵盐壳聚糖水溶性较壳聚糖增加。引起季铵化壳聚糖水溶性增强的原因主要是由于在碱性条件下壳聚糖分子结构中亲核中心C2上的-NH₂和-OH中的活泼H逐渐被位阻大、水合能力强的季铵基团取代，壳聚糖分子间的氢键作用受到削弱，取而代之的是季铵化壳聚糖分子与水分子间的水合作用得到增强，从而使其水溶性增大。有研究指出，壳聚糖溶液(酸性)加入甘油磷酸钠溶液(碱性)之后，降低了溶液的pH值，通过壳聚糖和磷酸基团之间的静电引力，壳聚糖分子之间的静电斥力，壳聚糖链之间的疏水和氢键等作用最终导致了凝胶的形成^[15-18]。同时壳聚糖季铵盐溶液与甘油磷酸钠溶液共混后的体系(壳聚糖季铵盐/甘油磷酸钠)亦有温敏特性，与壳聚糖/甘油磷酸钠水凝胶相比，壳聚糖季铵盐/甘油磷酸钠水凝胶呈现透明态，对环境的pH值更敏感。实验发现壳聚糖与壳聚糖季铵盐配比为8∶1时，成胶时间最短，约10 min，继续增加壳聚糖季铵盐的含量，壳聚糖-壳聚糖季铵盐/甘油磷酸钠体系无法成胶。季铵盐壳聚糖的，种类较多^[19-20]，亦有多种制备方法，实验采用的2，3-环氧丙基三甲基氯化铵为季铵化试剂，成功制备了水溶性更好的壳聚糖季铵盐衍生物。并通过红外、核磁谱图分析了所合成产物结构，经分析确实生成了壳聚糖季铵盐，提高了壳聚糖水溶性及正电性。但目前研究制备的壳聚糖温敏水凝胶性能方面，还有待进一步发展，如机械强度不够、低温条件下凝胶-溶胶转变速度慢甚至不具有可逆性等。因此，制备具有良好的生物力学性能、可逆性及快速响应性的壳聚糖基温敏水凝胶以满足不同需求，并最终应用到临床上，依然是今后研究的主要方向。

组织工程与细胞工程结合，还需要材料与细胞间有良好的黏附作用，其影响因素主要有生物学因素和材料因素两方面^[21-22]。生物学因素指与细胞膜的组成和性质相关的因素。材料因素指材料的表面亲疏水性、表面自由能、表面荷电特性、材料的化学结构以及材料的形态结构等因素。将组织工程细胞植入损伤部位后可随着再生的轴突迁移并包裹神经纤维，提供神经再生的微环境，减少中枢神经胶质瘢痕形成，避免其生长迁移受阻，引导细胞的正常的生长、增殖、分化、迁移、表型及凋亡，引导轴突再生到灰质和白质内，促进脊髓神经的再生^[23-25]。组织工程支架的复合型支架材料可通过选择适宜的制备工艺，设计构造出具有更适合细胞生长的力学强度、生物降解性等特点，更适合细胞培养的要求^[26]。

实验制备的支架孔隙率在85%以上，可以提供适合神经干细胞的生长及营养物质交换提供足够的空间。并通过MTT实验，急性全身毒性试验等较全面评价了水凝胶的生物安全性，表明其具有良好的生物安全性。将骨髓间充质干细胞与壳聚糖季铵盐/壳聚糖/甘油磷酸钠凝胶混合，培养观察到骨髓间充质干细胞接种于支架材料后细胞能在支架材料上良好的附着、生长和增殖，无明显细胞毒性表现。说明壳聚糖季铵盐/壳聚糖/甘油磷酸钠凝胶有良好的细胞相容性，该凝胶可作为组织工程的载体材料中细胞的良好载体。有望为将壳聚糖/壳聚糖季铵盐/甘油磷酸钠温敏水凝胶联合骨髓间充质干细胞治疗组织损伤提供理论基础，结合以往研究热点-干细胞在壳聚糖支架内定向诱导分化^[27-30]，实验为下一步组织损伤的修复带来了新的希望。

骨髓间充质干细胞复合温敏水凝胶支架的制备

Preparation of a thermosensitive hydrogel scaffold combined with bone marrow mesenchymal stem cells

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