体外构建人工仿生骨膜

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.42.002

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (42): 7349-7355.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.42.002

• 组织工程骨及软骨材料 tissue-engineered bone and cartilage materials • 上一篇下一篇

体外构建人工仿生骨膜

孙瑞¹，陈晓飞²，赵琳¹，赵建宏¹，庾佳佳¹，任广铁¹，拓振合¹

1甘肃省骨关节病重点实验室，兰州大学第二医院骨科，甘肃省兰州市 730000
2甘肃省中医院放射科，甘肃省兰州市 730000

收稿日期:2013-04-02 修回日期:2013-04-18 出版日期:2013-10-15 发布日期:2013-10-31
通讯作者: 赵琳，主任医师，硕士生导师，甘肃省骨关节病重点实验室，兰州大学第二医院骨科，甘肃省兰州市 730000 bonezl@sina.com
作者简介:孙瑞★，男，1976年生，甘肃省金昌市人，汉族，兰州大学在读硕士，主要从事创伤修复与功能重建研究。 1577064053@qq.com
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(30973064)*

In vitro constructing artificial biomimetic periosteum

Sun Rui¹, Chen Xiao-fei², Zhao Lin¹, Zhao Jian-hong¹, Yu Jia-jia¹, Ren Guang-tie¹, Tuo Zhen-he¹

1Department of Orthopedics, Second People’s Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730030, Gansu Province, China
2Department of Radiology, Chinese Traditional Medicine Hospital of Gansu Province, Lanzhou 730000, Gansu Province, China

Received:2013-04-02 Revised:2013-04-18 Online:2013-10-15 Published:2013-10-31
Contact: Zhao Lin, Chief physciain, Master’s supervisor, Department of Orthopedics, Second People’s Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730030, Gansu Province, China bonezl@sina.com
About author:Sun Rui★, Studying for master’s degree, Department of Orthopedics, Second People’s Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730030, Gansu Province, China 1577064053@qq.com
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 30973064*

摘要/Abstract

摘要：

背景：小肠黏膜下层既具有良好的生物相容性和降解性，又富含多种生长因子，能明显促进细胞的黏附、增殖及分化，在国外已被广泛应用于骨与软骨、血管、皮肤、膀胱、平滑肌及胰岛等组织的修复，且已表现出良好的组织工程化细胞支架性能。
目的：探讨兔骨髓间充质干细胞经体外诱导成成骨细胞与猪小肠黏膜下层复合构建组织工程骨膜的可行性。
方法：采用贴壁筛选法分离2周龄健康新西兰大白兔骨髓间充质干细胞，并进行体外扩增培养、诱导分化及鉴定。将经成骨诱导分化的骨髓间充质干细胞与猪小肠黏膜下层复合构建组织工程骨膜，观察细胞在生物材料上的附着、生长、增殖情况。
结果与结论：接种5 d后，细胞散在附着于小肠黏膜下层材料上，细胞形态呈圆形，细胞之间无连接；10 d后细胞之间形成桥粒连接，成骨细胞伸出突起，与小肠黏膜下层贴附；15 d后细胞增殖，分泌基质，在小肠黏膜下层表面形成多层细胞组成的复层膜样结构。表明将骨髓间充质干细胞诱导成成骨细胞后与猪小肠黏膜下层复合可构建组织工程骨膜，有可能成为理想的组织工程支架材料。

关键词: 生物材料, 组织工程骨材料, 骨髓间充质干细胞, 小肠黏膜下层, 成骨细胞, 组织工程骨膜, 诱导, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The small intestinal submucosa has good biocompatibility and biodegradability, and also contains a variety of growth factors that can significantly promote cell adhesion, proliferation and differentiation. Currently, the small intestinal submucosa has been widely used in bone and cartilage, blood vessels, skin, bladder, smooth muscle and pancreatic tissue repair, showing good performance as a tissue-engineered cell scaffold.
OBJECTIVE: To investigate the in vitro feasibility of tissue engineered periosteum constructed by porcine small intestinal submucosa and osteoblasts differentiated from bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells were harvested from 2-week-old healthy New Zealand rabbits by using adherent method, and then cells were cultured, induced, differentiated and identified in vitro. Following induced differentiation and identification, the bone marrow mesenchymal stem cells were compounded with porcine small intestinal submucosa to fabricate tissue engineered periosteum. The adhesion, growth, and proliferation of cells on the materials were observed.
RESULTS AND CONCLUSION: At 5 days after inoculation, the cells receiving osteogenic induction could quickly adhere and proliferate on the surface of porcine small intestinal submucosa and be interconnected; at 10 days, the desmosomes formed among the cells, cell processes from osteoblasts were visible and attached to the small intestine submucosa; at 15 days, cell proliferation and secretion of matrix appeared, and multi-layer membrane-like structure formed on the surface of the small intestine submucosa. These findings indicate that after osteogenic induction, the bone marrow mesenchymal stem cells can be combined with porcine small intestinal submucosa to construct a tissue engineered periosteum, which is hoped to be an ideal scaffold for tissue engineering.

Key words: tissue engineering, osteoblasts, biomimetic materials, stem cells

中图分类号:

R318

孙瑞，陈晓飞，赵琳，赵建宏，庾佳佳，任广铁，拓振合 . 体外构建人工仿生骨膜[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(42): 7349-7355.

Sun Rui, Chen Xiao-fei, Zhao Lin, Zhao Jian-hong, Yu Jia-jia, Ren Guang-tie, Tuo Zhen-he. In vitro constructing artificial biomimetic periosteum[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(42): 7349-7355.

图/表（结果） 5

2.1 第3代骨髓间充质干细胞和诱导后的成骨细胞生长曲线 两组细胞分别接种于24孔板，每天各取3孔消化计数，每孔计数3次，计算均值，连续9 d，见表1。以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，描绘细胞生长曲线，见图1。

2.2 两组细胞形态学观察 培养5 d后细胞开始形成典型集落样分布，簇状增生灶，呈长梭形，彼此不发生接触抑制现象，见图2，12-14 d细胞达90%以上融合，紧密排列类似漩涡状、辐射状，细胞形态趋于一致；原代细胞生长活力极强，增殖迅速，倍增时间平均为36 h，传至第3代细胞多为梭形，成纤维形，见图3。

成骨诱导培养后细胞生长速度放缓，形态也发生改变，以多边形、三角形等为主，还可出现复层生长或扁平无规则堆积现象，形成细胞结节甚至团块状，细胞之间伸出多个细而短的突起而相连，胞核大而清晰，细胞表面失去折光性，可见颗粒状物质，为钙盐沉积，见图4。

2.3 实验组细胞碱性磷酸酶染色 细胞以Gomori钙钴法染色后，胞质中可见灰黑色小颗粒深沉，深浅不一，镜下观察阳性反应呈现棕褐色颗粒或块状沉淀，见图5。

2.4 实验组细胞茜素红染色 成骨细胞茜素红染色呈典型的簇状分布的红色结节，类圆形或方形，为阳性表现，见图6。

2.5 实验组细胞免疫组织化学染色 诱导后的成骨细胞经BrdU标记后，在荧光显微镜下观察，被标记的细胞核呈亮色荧光，见图7。

2.6 扫描电镜观察成骨细胞在小肠黏膜下层上的附着、生长及增殖情况 接种5 d后细胞散在附着于材料上，细胞形态呈圆形，细胞之间无连接。10 d后细胞之间形成桥粒连接，成骨细胞伸出突起，与小肠黏膜下层贴附。15 d后细胞增殖，分泌基质，小肠黏膜下层表面形成多层细胞组成的复层膜样结构，见图8，9。

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引言

近年来随着医学和生命科学领域的不断拓展，基因和细胞(或组织)替代治疗成了现代医学的研究热点和前沿，为人类战胜疾病带来了新的途径^[1]。研究组织工程的基本方法是将自体或异体组织细胞经体外培养、扩增后，接种到一种组织相容性好、可降解吸收的生物材料上，形成细胞-生物材料复合物后，将细胞-生物材料植入体内组织缺损部位，生物材料逐渐被降解吸收，而细胞就形成了新的、有功能的活性组织，从而达到修复组织或器官缺损，恢复其正常功能的目的。由此种子细胞的获取培养，扩增及定向分化无疑是重要前提和关键环节^[2]。

20世纪70年代中Friedenstein发现骨髓间充质干细胞，培养后细胞可形成类似骨和软骨的小沉积物。后续实验证实骨髓间充质干细胞是一种未充分分化的类中胚层细胞，具有多向分化潜能，如可分化为成骨细胞、软骨细胞、肌细胞等^[3-4]；并且具有来源丰富，收集安全方便，免疫原性小，可自体移植和异体移植等优点，成为人们心中理想的首选种子细胞。骨髓中间充质干细胞的含量很低，占有核细胞的0.001%-0.01%，但在体外自我增殖能力极强^[5]。目前分离骨髓间充质干细胞的方法主要有密度梯度离心法、流式细胞仪分离法、免疫磁珠分离法和贴壁分离筛选法4种^[6]。由于前3种方法操作过程较为复杂，实验采用贴壁分离筛选法获取原代骨髓间充质干细胞，并且应用Satija等^[7]创建的传统方法，在体外对培养的骨髓间充质干细胞成骨诱导。分离的骨髓间充质干细胞形态均一，以成纤维形、梭形多见，可多次传代增殖，并能较好地维持细胞表型。但由于细胞表面没有特异性标记分子直接鉴别，所以通过诱导的成骨细胞鉴定来间接证明^[8]。

组织工程技术的深入研究为组织创伤修复、功能恢复提供了解决途径^[9]。支架材料和种子细胞是组织工程技术运用的两个核心构成部分。大量实验成功应用高分子合成材料、无机材料及生物源性材料作为支架，复合种子细胞构建细胞支架复合物，植入动物体内修复组织缺损^[10]。资料显示他们都有良好的组织相容性和稳定的理化性质，均可在体内降解，但降解速率与组织再生速率是否一致，却没有让人信服的证据，况且受到现有实验条件和成本的限制，阻碍了它们的应用^[11]。

实验的主旨就是探索猪小肠黏膜下层作为细胞载体与成骨细胞复合的可行性，为骨组织缺损的治疗寻求理想的支架材料。

材料方法

设计：细胞体外培养实验。

时间及地点：实验于2011年7月至2012年6月在兰州大学第二临床医院骨科研究所中心完成。

材料：

实验动物：2周龄新西兰大白兔，雌雄不拘，由兰州大学实验动物中心提供，动物合格证：兰榆110024号，实验过程对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准^[12]。

体外构建人工仿生骨膜实验的仪器和试剂：

实验方法：

骨髓间充质干细胞的培养及成骨诱导^[6,10]：无菌条件下快速完整地取2周龄新西兰大白兔下后肢，彻底剔除骨上肌肉筋膜，肝素化的DMEM冲洗髓腔，200目钢网过滤，收集冲洗液离心5 min，低糖培养液重悬后，恒温培养箱中直接贴壁培养。3 d后首次半量更换培养液，弃去未贴壁细胞，此后二三天换液1次，每天倒置显微镜下观察细胞形态。12-15 d集落相互融合，细胞单层生长并铺满整个培养瓶底，在细胞融合达80%-90%时胰酶消化，发现细胞触角回缩、间隙变大后，终止消化，轻轻吹打贴壁细胞，以1∶2或1∶3传代培养。取生长良好的第3代细胞消化后，直接加入含胎牛血清、β-甘油酸钠、维生素C、地塞米松、L-谷氨酰胺的成骨诱导培养基继续培养，每二三天换液，传代方法同前，建立实验组，同样设立空白未诱导对照组以作比较。

细胞生长曲线绘制：取第3代骨髓间充质干细胞和诱导后的成骨细胞，分别接种于24孔板，每天各取3孔消化计数，每孔计数3次，计算均值，连续培养9 d。以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，应用SigaPlot软件在计算机上绘制细胞生长曲线。

碱性磷酸酶染色(Gomori氏改良钙钴法)：将两组细胞接种于放盖玻片的6孔培养板中，采用Gomori氏改良钙钴法进行碱性磷酸酶染色，细胞爬片经PBS冲洗后，冷丙酮4 ℃固定，入碱性磷酸酶孵育液(预热37 ℃)于37 ℃恒温箱孵育，蒸馏水冲洗3次，1 min/次，2%硝酸钴水溶液作用5 min，蒸馏水冲洗3次，1 min/次，1%硫化铵水溶液处理1 min，流水冲洗5-10 min，再用蒸馏水冲洗1 min，自然干燥，甘油明胶液封固。

矿化结节的茜素红染色：成骨诱导液诱导3周后取出细胞爬片，PBS反复冲洗，体积分数95%乙醇固定10 min，蒸馏水冲洗，入2%茜素红染色3-5 min，蒸馏水冲洗，干燥，封固，矿化部分呈红色。

BrdU免疫荧光标记成骨细胞：对实验组细胞进行染色，步骤如下；①细胞爬片用40 g/L多聚甲醛固定。②体积分数3%双氧水处理，以消除内源性过氧化物酶的活性。③2 mmol/L HCl变性后滴加正常羊血清工作液封闭。④滴加兔抗人BrdU一抗，4 ℃冰箱过夜。⑤滴加生物素(FITC)结合二抗工作液，37 ℃下孵育 30 min。⑥甘油明胶封固，荧光显微镜观察。

小肠黏膜下层支架材料的制备：按照Abraham报道的方法，物理和化学方法脱细胞、脱蛋白和去除浆膜层、肌层，制备脱细胞的小肠黏膜下层，-80 ℃冻干真空包装后⁶⁰Co辐照消毒保存备用^[13]。

组织工程骨膜的制备：将小肠黏膜下层放入培养皿中，紫外线照射40 min，FBS预孵24 h，接种前PBS洗涤铺平。取第3代成骨细胞，调整细胞浓度为2×10⁸ L^-1，均匀接种于小肠黏膜下层支架表面，静置4-6 h，加入适量成骨诱导培养基，5 d后首次换液，以后每3 d换液，15 d后构建的组织工程骨膜用来制作动物模型。期间尽量避免摇晃和振荡平皿。细胞和支架复合5，10，15 d随机选取部分标本行2%戊二醛固定后扫描电镜观察。

主要观察指标：成骨诱导分化的骨髓间充质干细胞在猪小肠黏膜下层上的附着、生长及增殖情况。

统计学分析：统计学分析采用SPSS 17.0统计软件，实验数据以x(_)±s表示，组间数据使用秩和检验进行分析。检验水准为α=0.05。

讨论

支架材料理想特征具有^[14]：①良好的组织相容性。②可降解性和降解速率的可控性。③无抗原作用。④能维持生长在其上细胞的形态和表型；并增进细胞的黏附和生殖，诱导组织再生。⑤有一定孔隙率。⑥有一定机械强度。小肠黏膜下层具有以上性能，并且最近研究显示，小肠黏膜下层是一种富含生物活性因子的胶原基质，既有良好的生物相容性和降解性，还富含多种生长因子，能明显促进细胞的黏附、增殖及分化，已表现出良好的组织工程化细胞支架性能^[15-16]。因而在国外已被广泛应用于骨与软骨、血管、膀胱、平滑肌及胰岛等组织的修复研究。

实验中采取全骨髓贴壁法分离兔骨髓间充质干细胞，认为该法的优点在于尽可能避免骨髓间充质干细胞的丢失，对细胞的机械损伤较小，保留了细胞生长因子和贴壁物质，保留细胞生长的骨髓微环境。据有关文献报道，碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子对骨髓间充质干细胞有较强的促增殖作用。贴壁生长的骨髓间充质干细胞更易贴附于塑料器皿，刚接种时呈成纤维细胞样生长，扩增后出现漩涡状、辐射状、放射状排列生长，易于与造血干细胞等鉴别。骨髓间充质干细胞可表达多种表面抗原，对于其确切表型目前还没有统一的标准，一种方法是用多种分化潜能进行鉴定，即经定向分化后做细胞鉴别。有实验表明骨髓间充质干细胞增殖能力强，成骨能力较弱；而骨膜和颅骨来源的成骨细胞成骨能力较强，增殖能力较弱^[17-18]。实验将骨髓间充质干细胞定向诱导为成骨细胞，既能满足数量要求又能满足质的要求。骨髓间充质干细胞成骨分化的诱导方法目前有两种^[19-23]，一种是Jaiswal等创建的使用地塞米松、磷酸甘油和维生素C的诱导方法，另一种是Chaudhary等创建的使用骨形态发生蛋白7的诱导方法。后一种方法由于骨形态发生蛋白7价格昂贵，实验要求细胞数量大时不适合推广应用。

小肠黏膜下层是一种天然细胞外基质生物材料，含有丰富的纤维粘连蛋白和胶原，共同维持组织的精细结构和微环境；不仅起支架作用，而且具有一定的生理功能^[24-28]。有研究评价猪小肠黏膜下层与人胚骨膜成骨细胞、人胚皮肤成纤维细胞及兔肾血管内皮细胞的细胞相容性。实验制备猪小肠黏膜下层，将人胚骨膜成骨细胞、人胚皮肤成纤维细胞和兔肾血管内皮细胞与小肠黏膜下层体外复合培养，采用相差显微镜观察细胞的黏附和生长，并用 MTT法测定细胞增殖，用流式细胞仪检测复合培养细胞在不同培养时间的细胞周期、细胞凋亡。结果表明3种细胞均可在小肠黏膜下层上黏附生长，小肠黏膜下层可促进兔肾血管内皮细胞的增殖，小肠黏膜下层对3种细胞的细胞周期和细胞凋亡率无影响；小肠黏膜下层有良好的细胞相容性，其孔径、结构有助于人胚骨膜成骨细胞、人胚皮肤成纤维细胞和兔肾血管内皮细胞的黏附和生长，是良好的组织工程生物衍生材料。胶原蛋白在体内以胶原纤维的形式存在，其纤维状结构对于组织培养细胞的黏附、生长和繁殖极为有利^[29-32]。Ⅰ型胶原的a1链与细胞表面的特异受体结合，激活信号传导通路，促进细胞的黏附、增殖和分化。纤维粘连蛋白富含精氨酸甘氨酸-天门冬氨酸亚基、三肽，通过a58-链黏合分子在细胞黏附中发挥重要作用，在血管结构形成和调节细胞与基质之间的信息传递方面也起重要作用。小肠黏膜下层中含有多种生长因子，如成纤维细胞生成因子、转化生长因子、血管内皮生长因子和血小板源性生长因子等。顾延等^[33-35]报道这些生长因子在材料制备过程中经受消毒、冻干等处理后仍具有生物活性，在组织修复和重构中仍有着重要的促进作用。小肠黏膜下层作为异基因生物材料支架应用在动物模型中时能促进内皮细胞分裂，诱导血管再生和组织重塑。小肠黏膜下层不含有血管和细胞，基本上无抗原性和免疫原性，当作为异物植入体内不会引起明显的免疫排斥反应。实验证实小肠黏膜下层植入体内后仅引起以TH2淋巴细胞为主的一过性排异反应；TH2淋巴细胞可产生白细胞介素4、白细胞介素5、白细胞介素6、白细胞介素10，不激活巨噬细胞，产生的IgG不引起补体反应，伴免疫耐受，被认为是机体接受移植物的正常反应^[36-42]。

综上所述，人工骨膜的制备与生物相容性研究是治疗骨缺损的新技术，符合医学原理和发展趋势，有着广阔的医疗应用价值，视角独特，创新性强，这一研究成果还需在临床应用中继续完善和改进。

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