去抗原羊椎松质骨支架微观空间结构的分析

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.42.001

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (42): 7341-7348.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.42.001

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去抗原羊椎松质骨支架微观空间结构的分析

崔杰，李征，何惠宇，胡杨

新疆医科大学第一附属医院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

收稿日期:2013-04-09 修回日期:2013-04-18 出版日期:2013-10-15 发布日期:2013-10-31
通讯作者: 何惠宇，博士，教授，主任医师，新疆医科大学第一附属医院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054 hehuiyu01@126.com
作者简介:崔杰★，男，1984年生，北京市人，2011年新疆医科大学毕业，硕士，主要从事口腔修复临床工作及口腔组织工程方面研究，现工作于新疆医科大学第一附属医院口腔修复科。 cuijieme@163.com
基金资助:
国家自然科学基金地区科学基金项目(81060088)*：三维打印构建组织工程化牙槽骨的实验研究；新疆医科大学第一附属医院组织工程专项基金(2012ZZG02)*：海藻酸钠凝胶复合异种骨构建支架材料的力学性能及生物性能研究

The microstructure of antigen-extracted heterologous bone

Cui Jie, Li Zheng, He Hui-yu, Hu Yang

First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2013-04-09 Revised:2013-04-18 Online:2013-10-15 Published:2013-10-31
Contact: He Hui-yu, M.D., Professor, Chief physician, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China hehuiyu01@126.com
About author:Cui Jie★, Master, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China cuijieme@163.com
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81060088*; Special Fund for Tissue Engineering, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, No. 2012ZZG02*

摘要/Abstract

摘要：

背景：实验证实不同去除免疫原性方法对去抗原异种骨材料微观空间结构有着不同的影响。
目的：比较不同方法处理条件下去抗原异种松质骨的微观空间结构。
方法：取成年绵羊新鲜椎骨松质部分制备成特定形状的圆柱体，其长轴与所取松质骨骨小梁排列方向一致，行振动冲洗、不同频率超声冲洗后随机分为3组：物理煅烧组采用甲醇/氯仿、过氧化氢等化学制剂序列脱脂脱细胞脱蛋白后，与焦磷酸钠溶液水浴并直接在煅烧炉内1 000 ℃煅烧3 h；化学处理组采用甲醇/氯仿、过氧化氢等化学制剂序列脱脂脱细胞脱蛋白；对照组直接置于室温自然晾干。通过孔隙率测定、扫描电镜观察、X射线衍射分析、X射线原子能谱元素分析比较各组样品的微观空间结构。
结果与结论：与对照组相比，物理煅烧组、化学处理组均不同程度保持了原骨组织的天然网状孔隙结构，大孔孔径为50-600 μm，微孔孔径为2 μm左右，孔隙率55%-70%；物理煅烧组的主要成分为羟基磷灰石和一定量的β-磷酸三钙，化学处理组与对照组的主要成分为羟基磷灰石；经化学或物理煅烧处理的松质骨立体空间结构并无很大破坏，保留了孔径不等、交通性良好、表面开放的孔隙和高度的孔隙间连接；并且经物理煅烧步骤可更彻底地去除异种松质骨的抗原成分，制成的去抗原异种骨支架材料基本符合组织工程骨支架材料的要求。

关键词: 生物材料, 组织工程骨材料, 去抗原异种骨, 支架材料, 骨组织工程, 微观空间结构, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Different methods to remove immunogenicity have different effects on the spatial microstructure of antigen-extracted heterologous bone.
OBJECTIVE: To compare the microstructure of the antigen-extracted heterologous bone via different methods to provide experimental data for tissue engineering industrialization.
METHODS: Fresh cancellous bones extracted from adult sheep vertebrae were prepared into cylinders. Their long axis direction was the same with orientation of the trabeculae. After vibration washing and different-frequency ultrasound rinsing, the cylinder samples were randomly divided into three groups: in physical calcined group, the samples were defatted, decellularized and deproteinized sequentially using methanol/chloroform and hydrogen peroxide, then bathed in sodium pyrophosphate and directly calcined at 1 000 ℃ for 3 hours; in chemical group, the samples were defatted, decellularized and deproteinized sequentially using methanol/chloroform and hydrogen peroxide; in control group, the samples were dried naturally at room temperature. Microstructure of the samples in each group was analyzed and compared through determination of porosity, scanning electron microscopy observation, X-ray diffraction analysis, X-ray atomic spectroscopy elemental analysis microscopic spatial structure.
RESULTS AND CONCLUSION: The physical calcined and chemical groups maintained natural network pore system to different extents. The size of the large pore was 50-600 μm and that of the small one was about 2 μm. The porosity was 55% to 70%. Hydroxyapatite was the main component of the physical calcined group which was determined by X-ray diffraction, and a small amount of the β-Tricalcium phosphate was also determined. In the chemical group, the main component was only hydroxyapatite. The three-dimensional spatial structures of the deproteinized cancellous bones were not damaged greatly, and they had a natural pore network system. Antigen component of xenogeneic cancellous bone can be more thoroughly removed by physical calcination step. The scaffold material made by antigen-extracted heterologous bone may satisfy the demands for bone tissue-engineering scaffolds.

Key words: antigens, stents, tissue engineering, spine

中图分类号:

R318

崔杰，李征，何惠宇，胡杨. 去抗原羊椎松质骨支架微观空间结构的分析[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(42): 7341-7348.

Cui Jie, Li Zheng, He Hui-yu, Hu Yang. The microstructure of antigen-extracted heterologous bone[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(42): 7341-7348.

图/表（结果） 9

2.1 各组一般观察 见图1。

物理煅烧组样品表面呈白色，可见清晰的孔径大小不一的多孔结构，各孔隙内部与样品表面颜色一致；逆光观察可见样品透光，手指用力按压可将骨块压碎，碎片较规则。化学处理组样品表面呈淡黄色，表面个别孔隙不清晰并未完全敞开且内部可见深黄色物质；样品透光性较物理煅烧组差，手指用力按压无法将骨块压碎，但可使其发生形变。对照组样品呈深黄色，表面可见部分多孔结构，无前两组清晰；逆光观察透光差，并可见内部大量杂质手指用力按压无法将骨块压碎，但可使其发生少量形变，见图1。

2.2 支架孔隙率测定 分别将两种测定方法所得的3组平均孔隙率整理，设定检验水准α=0.05水准，结果见表1。

同一测定方法条件下，采用单因素方差分析检测得出结果：①液体置换法：组间比较F=27.89，P < 0.01，说明各组间孔隙率差异不全相同，再用Bonrerroni法行组间两两比较，各组间P < 0.01，说明液体置换法测定各组间孔隙率差异有显著性意义。②软件分析法：组间比较F=62.06，P < 0.01，说明各组间孔隙率差异不全相同，再用Bonrerroni法行组间两两比较，各组间P < 0.01，说明软件分析法测定各组间孔隙率差异有显著性意义。

同一分组条件下，采用配对t 检验比较两种测定孔隙率方法：①物理煅烧组：根据结果得出液体置换法与软件分析法测定孔隙率的差异无显著性意义(P=0.16)。②化学处理组、对照组：根据结果得出液体置换法与软件分析法测定孔隙率的差异有显著性意义(P < 0.01)。

2.3 支架超微形态结构观察

扫描电镜低放大倍数下观察(放大20-100倍)：物理煅烧组材料表面呈天然松质骨的蜂窝状多孔结构，孔径与天然松质骨相似，大孔孔径范围为41.23-780.06 μm不等，孔隙内未见杂质影像，各个孔隙之间存在广泛的交通，大孔壁上可见大量微孔存在，孔壁表面粗糙，表面形貌为小梁状和山嵴状，并可见β-磷酸三钙斑片状结构散布，见图2。

化学处理组表面与物理煅烧组相近，大孔孔径为50-600 μm，孔隙之间存在广泛的交通，但孔壁上可见少量未去净残留细胞、脂类等杂质成分，见图3。

对照组材料表面多数孔隙内可见大量未去除干净的细胞、脂类等杂质影像，各个孔隙之间交通性差，孔壁表面粗糙并可见细胞等杂质黏附，见图4。

扫描电镜高放大倍数下观察(放大倍数1 000倍以上)：物理煅烧组1 000倍视野下羟基磷灰石晶体呈柱状排列，β-磷酸三钙斑片状晶体结构分布在羟基磷灰石晶体微孔周围，最小微孔孔径0.12 μm，2 000倍视野下可见羟基磷灰石晶体表面呈椭圆型，见图5。

化学处理组可见少量细胞、脂类等杂质残留于孔壁表面，羟基磷灰石晶体呈柱状排列，未见斑片状β-磷酸三钙晶体结构，见图6。对照组可见大量未去除的细胞、脂类等杂质影像，大孔孔壁上少见清晰微孔结构，羟基磷灰石晶体结构不清晰，未见斑片状β-磷酸三钙晶体结构影像，见图7。

2.4 支架组织学观察 物理煅烧组切片经苏木精-伊红染色后可见支架材料骨性框架保存完整，呈多孔网络孔隙结构，孔隙上椭圆形骨陷窝空虚，孔隙内未见血细胞、脂肪细胞、神经、血管和嗜酸性物质染色，见图8A。化学处理组支架材料骨性框架保存完整清晰，有少量基质细胞附着于骨小梁表面，少数孔隙内可见细胞核和嗜酸性物质及脂肪网隔残留染色，孔壁上骨陷窝中可见散在骨细胞核染色，见图8B。对照组支架材料骨性框架结构完整，骨髓腔内可见骨髓组织、细胞核和嗜酸性物质及脂肪网隔残留染色，基质细胞均附着于骨小梁表面，见图8C。

2.5 支架X射线衍射分析 物理煅烧组样品衍射角2-Theta值特征峰尖锐清晰，与标准数据库特征峰值对比中得到主要矿物晶相为羟基磷灰石和一定量的β-磷酸三钙，分子式Ca₅(PO₄)3OH和Ca₃(PO₄)₂，根据特征峰值偏移程度可见羟基磷灰石较β-磷酸三钙含量多，该结果亦在扫描电镜观测结果中得到证实，见图9。

化学处理组样品衍射角2-Theta值特征衍射峰值清晰程度较物理煅烧组差，可见许多杂质衍射峰出现，其主要衍射特征峰与标准数据库特征衍射峰值对比中得到主要成分为羟基磷灰石，分子式Ca₅(PO₄)₃OH，无β-磷酸三钙特征衍射峰，见图10。

对照组样品衍射角羟基磷灰石特征衍射峰可见外，其他峰值均不清晰，有大量杂质衍射峰存在，提示该组样品中含有羟基磷灰石，分子式Ca₅(PO₄)₃OH，但无β-磷酸三钙特征衍射峰且杂质较多，见图11。

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引言

材料方法

设计：观察性实验。

时间及地点：于2012年3至12月在新疆医科大学第一附属医院医学研究中心完成。

材料：市售成年绵羊椎骨；甲醇(分析纯)、氯仿(分析纯)、0.09 mol/L焦磷酸钠溶液(分析纯)、体积分数30%过氧化氢溶液(分析纯)(上海静融生物科技有限公司)；PYRO高温微波煅烧炉(新疆医科大学公共卫生学院提供)；5200型双频超声清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；光学显微镜及图像采集系统(新疆医科大学基础医学院组织胚胎教研室提供)；JEOL-JSM-6390LV(日本)扫描电子显微镜(新疆医科大学电子显微镜室提供)；MAC-X射线衍射分析仪(新疆大学理化测试中心提供)；各类离心管、烧瓶、三角烧瓶等。

实验方法：

去抗原异种松质骨支架材料的制备：

初步处理：取市售成年绵羊脊柱骨，利刀去除皮质骨部分，用自制的切割成型器具将骨块初步制为底面直径为0.5 cm、高3 cm左右大小的松质骨圆柱体形状。将各组样品分别经过盛有蒸馏水的三角烧瓶中低速摇床上振动(60 r/min)冲洗、不同频率超声冲洗等清洗步骤3次，置于室温自然晾干。

分组处理：将所有经过初步处理的骨块样品使用随机数字表编号，随机抽取120块归入3组，每组40块样品。物理煅烧组：①经甲醇/氯仿(1∶1)、体积分数30%过氧化氢溶液3次反复处理后置室温自然晾干，将骨块样品置于0.09 mol/L焦磷酸钠(Na₄P₂O₇•10H₂O)溶液中，70 ℃恒温水浴12 h后室温自然干燥。②将骨块样品入PYRO高温微波煅烧炉中，设置煅烧炉加温程序，以10 ℃/min缓慢升温至1 000 ℃时，维持3 h，自然冷却至室温，包封后紫外线消毒6 h备用。化学处理组：按物理煅烧组①方法处理，消毒包封备用。对照组仅行初步处理后直接置于室温自然晾干，紫外线消毒6 h包封后备用。

材料性能检测：

孔隙率测定：①孔隙率测定方法一(液体置换法)：取各组10块样品用游标卡尺再次精确测量其底面直径和高度，计算体积(V)，将其放入有一定刻度并盛有相同体积甘油的玻璃容器内，得到甘油前后变化的体积V₁。采用孔隙率公式=(1-V₁/V)×100%，其中V为骨块所占空间体积，V₁为骨块所占空间体积减去孔隙所占的体积，数据输入Microsoft Excel软件储存并计算，取平均值。②孔隙率测定方法二(软件分析法)：将骨块样品的扫描电镜照片用Adobe Photoshop CS2软件中直方图(histogram)计算功能，分别统计样品表面孔隙所占象素数a和样品表面所占总象素数A，采用孔隙率公式= a/A×100%，选取不同视野及多次统计，将数据输入Microsoft Excel软件储存并计算，取平均值。实验中随机挑选各组样品分别采用两种方法测定其孔隙率。

超微形态结构观察：各组取10块样品以3%戊二醛溶液中固定24 h，锐刀横切，乙醇系列脱水，真空干燥，表面喷金，使用JEOL-JSM-6390LV(日本)扫描电子显微镜观察其横切面表面的超微形态结构，并随机选择样品表面不同区域，采用扫描电子显微镜图像分析系统中电子游标卡尺功能测量材料样品表面孔径大小，采集图像。

组织学观察：各组取10块样品分别放入EDTA液中脱钙，锐刀横切，石蜡包埋，用切片机对其横断面切片，采用苏木精-伊红染色，光学显微镜观察组织学结构，采集图片。

X射线衍射分析：各组随机选取10块样品，低温研磨成粉末状(40目)，放入MAC-X射线衍射分析仪中测试样品中无机成分的组成和晶体结构，根据所得衍射角2-Theta值的特征衍射峰与数据库中标准数据卡片对比，鉴别其所含矿物成分。X线衍射分析仪检测条件为：铜靶，工作电压为40 kV，工作电流100 mA，扫描角度10°-90°。采集图像。

质量控制：实验采用随机分组的方式将所测样品分组并分别测量其各项性能数据，在扫描电镜拍摄、X射线衍射、X射线元素能谱分析均请与实验不相关的实验人员参与，采用随机重复测量的方法来控制所得结果的偏倚。

主要观察指标：经不同方法处理去抗原异种松质骨的孔隙率、扫描电镜观察、X射线衍射分析、X射线原子能谱元素分析结果。

统计学分析：将各组数据用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。所得计量资料先行方差齐性检验，再以x(_)±s表示，采用方差分析多组样本均数比较，得出P值以α=0.05为检验水准，判断差异是否有统计学意义。

讨论

构建具有低免疫原性的组织工程骨已成为研究热点并深受国内外医疗科研工作者热衷，因为组织工程化骨作为治疗大面积缺损的替代骨修复材料，可避免自体或同种异体来源的骨移植材料的风险与不足^[2]。研究表明理想的骨组织工程支架材料应具备以下特性^[3-6]：具有良好的生物相容性；支架材料的体内降解速率应与新生骨组织细胞的生长速率相适应；一定的可塑性；支架材料的表面活性应有利于细胞的有效黏附；支架材料应该具有高孔隙率的多孔性三维结构；特定的生物活性，能在分子水平介导细胞间信号传导、诱导新骨形成等。

由于去抗原异种松质骨支架材料来源广泛，具有与人体骨相似的天然多孔结构，一直是被认为是构建组织工程骨的良好支架材料之一^[7-8]。近年来不同学者采用许多不同方法以去除异种骨的免疫原性，Erdemli等^[9]将聚己内酯-生物玻璃复合材料分别与硫酸钙和脱钙骨基质复合进行体内外对比实验，结果提示脱钙骨基质复合材料抗原性去除后基本符合骨组织工程支架材料的要求；Rocchietta等^[10]将rhPDGF-bB与去除蛋白的牛骨复合植入动物体内，通过X射线散射电镜元素分析其骨生长情况，结果提示该组织工程骨构建后新生骨组织生长良好；其他处理方法如高温煅烧、深低温冷冻、放射线辐照等物理方法，运用化学试剂进行脱脂、脱钙、脱蛋白、脱细胞等生物化学方法，为制备符合理想标准的骨组织工程支架材料提供了更多全新解决方案^[11-13]。当然不同处理方法由于其原理不同使得去除抗原的效果也不同，不同学者通过将支架材料植入大鼠、狗、牛等动物体内，在影像学、组织学、生物学方面进行检测，证实了不同去除免疫原性方法对去抗原异种骨抗原性的去除有着密切而不同的影响^[14-16]。实验意在研究不同处理方法对异种骨支架材料去除抗原效果的影响，筛选出适宜的去异种抗原方法，为后期构建组织工程骨提供实验依据。

实验在开始前通过查阅大量国内外文献和进行预实验，收集整理并分析了各种去除异种骨中异种抗原的方法，从中选择了较常用的物理煅烧法和化学试剂处理法。在分组进行处理之前均采用超声波清洗的方法，因为超声波在清洗液体中传播可以引起液体空化效应，可加速溶解和剥离被清洗材料内孔、盲孔的杂质，而在相同条件下，振动频率较低超声波引起的超声空化效应更加显著，对破碎细胞具有更加强烈的作用^[17]。实验采用20 kHz和40 kHz双频超声清洗设备进行不同频率下的交替超声清洗，先使用20 kHz的超声清洗使得骨块孔隙内的细胞破裂，再选择频率为40 kHz的超声振动将破裂的细胞残片及材料内脂类清洗出来，在3组清洗过程中均可明显看到清洗液表面漂浮有油脂类物质，在苏木精-伊红染色切片也可以看到部分脂类物质、血液细胞等已被清除，证明该方法用于支架材料初期处理阶段较流动水简单洗涤的清洗效果明显。

许多学者指出支架材料的微观孔隙结构对其生物医学性能及力学性能均有着至关重要的影响^[18]。孔隙过大易造成骨支架材料各项力学性能的下降，难以广泛应用于不同骨缺损区，尤其是如牙槽骨等承重功能区域；而过小的孔径亦会导致新生细胞及组织难以顺利的长入并影响细胞间的营养供给，影响组织工程骨在体内的成活。目前关于骨组织工程支架材料孔径具体应为多大为适宜仍有不同争议，有学者认为正常生理骨的骨松质的孔径应为200-400 μm大小，成骨细胞静态时直径应为20 μm左右，附着时直径约30 μm，由此可知一个成骨细胞占据的面积约为700 μm²，成骨细胞迁移的最小孔径为100 μm^[19]，因此支架材料孔径的大小要与细胞体积相一致。Likibi 等^[20]认为支架允许血管生长的最小孔径应为50 μm，允许新骨长入的最小孔径应为 200 μm。Bucholz等^[21]认为在体外悬浮液中有利于新骨生长的骨移植替代材料的孔径应大于等于100 μm。但孔径>500 μm时会影响支架材料的力学强度和细胞的有效黏附率。而Porter等^[22]认为骨支架材料孔径不小于200 μm是骨传导的基本要求，在200-400 μm之间最利于新生骨组织的生长。实验通过扫描电子显微镜观察各组骨块样品的超微形态结构并测量孔径数据，经过处理的物理煅烧组、化学处理组材料表面大孔孔径均大于40 μm，微孔大于0.12 μm，提示经过一定处理后和未行有效处理的对照组相比较均达到文献中所提到的利于细胞生长的孔径标准，利于种子细胞的生长。另外，孔隙的连通率和孔隙之间交通性的好坏也是影响新生骨组织顺利长入材料的重要因素^[23]。Sánchez-Salced等^[24]以β-磷酸三钙和羟基磷灰石为主要原料，通过人工添加发孔剂的方法制成了一种具有多孔孔隙结构的煅烧人工合成骨材料，虽然其也具有不同直径的多孔结构，但其孔隙结构间缺少互相联通的微孔结构，与天然骨相比仍存在很大不足。实验材料均为具有天然骨孔隙结构的天然生物骨材料，对照组因未进行系统处理，化学处理组未进行煅烧，其天然孔隙之间均存在各种杂质交通性差未呈现开放交通的孔隙系统，与此两组比较，物理煅烧组因经过高温煅烧，扫描电子显微镜不同放大倍数下均可见材料孔壁上布满开放且互相连通的大孔及微孔结构，结果提示经过高温煅烧的羊脊椎松质骨既能保留了天然敞开的大孔孔隙结构以适宜新骨长入，也保留了互相连通的微孔结构开放，解决了人工化学合成陶瓷类支架材料的孔径大小和孔隙交通性无法很好掌握控制的难题^[25]。

罗卓荆等^[26]通过研究松质骨的抗原性，在经过苏木精-伊红染色切片中观察到骨小梁骨基质染色呈阴性，而骨细胞、成骨细胞、软骨细胞及骨陷窝等均有不同程度的阳性染色，细胞阳性染色的部位主要在胞浆中，由此可见各种细胞成分仍是松质骨中抗原的主要成分。通过苏木精-伊红染色，在不同放大倍数光学显微镜下观察，对比是否有残留的阳性染色细胞核成分和脂肪组织，即可初步判断材料的免疫原性高低。实验中高温煅烧处理组材料经苏木精-伊红染色后观察发现，材料内部仅剩下无机骨小梁，在材料孔隙上及骨陷窝内均未见细胞、细胞核及脂肪等带有免疫原性成分的染色，而化学试剂浸泡组材料在少量骨陷窝内可见有个别未去净的残留细胞核染色；对照组因未行物理或化学处理可视为新鲜椎骨组织，在光镜各种放大倍数下均可见有大量骨细胞、脂肪细胞、细胞基质等物质染色，细胞核清晰可见。以上结果均提示经过煅烧后的羊椎松质骨基本去除了带有免疫原性的有机成分，而单纯化学处理亦可去除了大多数带有免疫原性的有机成分，与物理煅烧方法比较的差异可能因化学试剂处理时间不够或化学试剂浸泡无法进入材料内部相关。

有研究证实异种骨组织经过一定的处理之后可得到羟基磷灰石和β-磷酸三钙复相结构，并且以羟基磷灰石为主相^[27]。有学者通过X射线衍射分析，当羟基磷灰石/磷酸三钙双相陶瓷样支架材料中的羟基磷灰石成分多于或等于β-磷酸三钙时，表现出较好的成骨性能，而β-磷酸三钙含量多于羟基磷灰石时成骨能力降低^[28-29]。提示双相陶瓷样支架材料中的羟基磷灰石/β-磷酸三钙比例对新骨形成有影响作用。实验综合学者Li和Fellah等^[30-31]的方法，将物理煅烧组在煅烧前与0.09 mol/L焦磷酸钠(Na₄P₂O₇·10H₂O)溶液的水浴复合，经高温煅烧后将材料中的羟基磷灰石部分转化成降解性能好的β-磷酸三钙成分(反应式Ca₅(PO₄)₃OH+ Na₄P₂O₇·10 H₂O→Ca₃(PO₄)₂)，在扫描电镜图像上便可见呈现斑片状的β-磷酸三钙结构影像分布于长椭圆形的羟基磷灰石晶体周围，这一结果在影像学上亦证实了采用与焦磷酸钠溶液复合后煅烧的方法可制备出同时具有羟基磷灰石和β-磷酸三钙的双相钙磷陶瓷样骨支架材料。羟基磷灰石/β-磷酸三钙双相复合材料的影像结果在后期X射线衍射分析检测中也得到了证实。实验结果提示经过煅烧的松质骨矿物晶相符合双相陶瓷样生物骨的特性，同时具备羟基磷灰石与β-磷酸三钙的特点，在一定情况下满足了支架材料在体内降解时间应与骨修复过程时间相匹配的要求，为后期体内降解实验亦提供了依据，但其细胞相容性和组织相容性尚需要后续实验进一步验证。

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许多学者指出支架材料的微观孔隙结构对其生物医学性能及力学性能均有着至关重要的影响。孔隙过大易造成骨支架材料各项力学性能的下降，难以广泛应用于不同骨缺损区，尤其是如牙槽骨等承重功能区域；而过小的孔径亦会导致新生细胞及组织难以顺利的长入并影响细胞间的营养供给，影响组织工程骨在体内的成活。目前关于骨组织工程支架材料孔径具体应为多大为适宜仍有不同争议，有学者认为正常生理骨的骨松质的孔径应为200-400μm大小，成骨细胞静态时直径应为20μm左右，附着时直径约30μm左右，由此可知一个成骨细胞占据的面积约为700μm²左右，成骨细胞迁移的最小孔径为100μm，因此支架材料孔径的大小要与细胞体积相一致。Likibi 等认为支架允许血管生长的最小孔径应为50μm，允许新骨长入的最小孔径应为200μm。Bucholz等认为在体外悬浮液中有利于新骨生长的骨移植替代材料的孔径应大于等于100μm。但孔径>500μm时会影响支架材料的力学强度和细胞的有效黏附率。而Porter等认为骨支架材料孔径不小于200μm是骨传导的基本要求，在200-400μm之间最利于新生骨组织的生长。实验通过扫描电子显微镜观察各组骨块样品的超微形态结构并测量孔径数据，经过处理的物理煅烧组、化学处理组材料表面大孔孔径均大于40μm，微孔大于0.12μm，提示经过一定处理后和未行有效处理的对照组相比较均达到文献中所提到的利于细胞生长的孔径标准，利于种子细胞的生长。另外，孔隙的连通率和孔隙之间交通性的好坏也是影响新生骨组织顺利长入材料的重要因素。Sánchez等以β-磷酸三钙和羟基磷灰石为主要原料，通过人工添加发孔剂的方法制成了一种具有多孔孔隙结构的煅烧人工合成骨材料，虽然其也具有不同直径的多孔结构，但其孔隙结构间缺少互相联通的微孔结构，与天然骨相比仍存在很大不足。实验材料均为具有天然骨孔隙结构的天然生物骨材料，对照组因未进行系统处理，化学处理组未进行煅烧，其天然孔隙之间均存在各种杂质交通性差未呈现开放交通的孔隙系统，与此两组比较，物理煅烧组因经过高温煅烧，扫描电子显微镜不同放大倍数下均可见材料孔壁上布满开放且互相连通的大孔及微孔结构，结果提示经过高温煅烧的羊脊椎松质骨既能保留了天然敞开的大孔孔隙结构以适宜新骨长入，也保留了互相连通的微孔结构开放，解决了人工化学合成陶瓷类支架材料的孔径大小和孔隙交通性无法很好掌握控制的难题。

去抗原羊椎松质骨支架微观空间结构的分析

The microstructure of antigen-extracted heterologous bone

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