地塞米松诱导成骨细胞凋亡的蛋白激酶C途径

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.41.004

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (41): 7205-7212.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.41.004

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地塞米松诱导成骨细胞凋亡的蛋白激酶C途径

仲兴¹，张德志²，韩鸿宾³，李凯⁴，杨智洋¹，付文举¹

¹辽宁医学院，辽宁省锦州市 121001；²辽宁医学院附属第一医院骨关节科，辽宁省锦州市 121001；³北京大学医学部科研处，北京市 100191；⁴北京大学医学部，北京市 100191

收稿日期:2013-01-03 修回日期:2013-01-28 出版日期:2013-10-08 发布日期:2013-11-01
通讯作者: 张德志，博士，副主任医师，辽宁医学院附属第一医院骨关节科，辽宁省锦州市 121001 zdzhi5@yahoo.com.cn
作者简介:仲兴★，男，1987年生，山东省兖州市人，汉族，辽宁医学院在读硕士，主要从事骨组织工程方面的研究。 baobeilongdao@163.com

Mechanism of osteoblast apoptosis induced by dexamethasone via the protein kinase C pathway

Zhong Xing¹, Zhang De-zhi², Han Hong-bin³, Li Kai⁴, Yang Zhi-yang¹, Fu Wen-ju¹

¹Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China; ²Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China; ³Department of Scientific Research, Peking University Health Science Center, Beijing 100191, China; ⁴Peking University Health Science Center, Beijing 100191, China

Received:2013-01-03 Revised:2013-01-28 Online:2013-10-08 Published:2013-11-01
Contact: Zhang De-zhi, M.D., Associate chief physician, Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China zdzhi5@yahoo.com.cn
About author:Zhong Xing★, Studying for master’s degree, Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China baobeilongdao@163.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：地塞米松以增加细胞周期时间的方法提高细胞凋亡来减少成骨细胞和骨细胞的数量。蛋白激酶C是细胞内信号传导通路的一种，与细胞凋亡有关已有相关文献报道。
目的：探讨地塞米松诱导成骨细胞凋亡在蛋白激酶C细胞内信号转导途径方向的机制。
方法：取胎鼠骨髓间充质干细胞进行成骨诱导，分为塞米松模型组、佛波醇组和星型胞菌素组。地塞米松模型组加入1×10^-6 mol/L地塞米松，佛波醇组加入1×10^-6 mol/L地塞米松和1×10^-7 mol/L佛波醇，星型胞菌素组加入1×10^-6 mol/L地塞米松和1×10^-7 mol/L星型胞菌素，观察不同干预组细胞的增殖或抑制，并对细胞膜及细胞质中蛋白激酶C含量的变化进行检测。
结果与结论：地塞米松可明显的诱导凋亡，加入佛波醇后凋亡明显增加，加入星形孢菌素后凋亡明显减少。加入地塞米松后胞浆的蛋白激酶C明显减少，包膜明显增加。加入地塞米松不同时间，胞浆和胞膜的蛋白激酶C变化在30 min最明显。说明地塞米松诱导成骨细胞凋亡的机制与蛋白激酶C有关，地塞米松为蛋白激酶C激动剂。细胞受到刺激后，胞浆的蛋白激酶C转移至包膜，胞浆中的蛋白激酶C量减少，包膜中的增加。

关键词: 组织构建, 骨组织构建, 蛋白激酶C途径, 成骨细胞, 地塞米松, 凋亡, 糖皮质激素

Abstract:

BACKGROUND: Dexamethasone can improve the cell apoptosis and decrease the number of osteoblasts and bone cells through increasing the time of cell cycle. Protein kinase C is a kind of intraecellular singnal transduction pathways, and there are related reports on the relationship between protein kinase C and cell apoptosis.
OBJECTIVE: To investigate the mechanism of dexamethasone-induced osteoblast apoptosis via protein kinase C intracellular signal transduction pathway.
METHODS: Fetal rat bone marrow mesenchymal stem cells were collected for osteogenic induction, and the cells were divided into dexamethasone group, phorbol group and star cytochalasin group. The cells in the dexamethasone group were added with 1×10^-6 mol/L dexamethasone, the cells in the phorbol group were added with 1×10^-6 mol/L dexamethasone and 1×10^-7 mol/L phorbol, while the cells in the star cytochalasin group were added with 1×10^-6 mol/L dexamethasone and 1×10^-7 mol/L star cytochalasin. The proliferation and inhibition of the cells in different intervention groups were observed, and the content of protein kinase C in the cell membrane and cytoplasm was measured.
RESULTS AND CONCLUSION: Dexamethasone could induce apoptosis significantly, and after added with phorbol, the apoptosis was increased significantly; while after added with star cytochalasin, the apoptosis was decreased significantly. After added with dexamethasone, the content of protein kinase C in the cytoplasm was significantly decreased, while increased in the cell membrane. At different time points after added with dexamethasone, the change of the content of protein kinase C in the cytoplasm and cell membrane was most significant at 30 minutes. The results indicated that mechanism of dexamethasone-induced osteoblast apoptosis was correlated with protein kinase C, and dexamethasone was the agonist of protein kinase C. After the cells were stimulated, the protein kinase C in the cytoplasm will moved to the cell membrane, and then the content of protein kinase C in the cytoplasm was decreased, while increased in the cell membrane.

Key words: osteoblasts, dexamethasone, bone and bones, protein kinase

中图分类号:

R318

仲兴，张德志，韩鸿宾，李凯，杨智洋，付文举. 地塞米松诱导成骨细胞凋亡的蛋白激酶C途径[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(41): 7205-7212.

Zhong Xing, Zhang De-zhi, Han Hong-bin, Li Kai, Yang Zhi-yang, Fu Wen-ju. Mechanism of osteoblast apoptosis induced by dexamethasone via the protein kinase C pathway[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(41): 7205-7212.

图/表（结果） 8

2.1 SD大鼠成骨细胞形态观察

细胞生长状况：接种后细胞悬浮，1 h左右开始贴壁，为单核、多边形及梭形，生长旺盛期，见图2。

成骨细胞在相差显微镜下表现为细胞体积较大，呈鳞片状，胞浆丰富，多伪足呈“铺路石”样排列，带有粗大伪足；细胞间无连接，呈成骨系细胞特征，胞质呈强嗜碱性。胞浆内丰富的基质前体成分呈小的分散颗粒或小滴。随着代数的增加，细胞体积逐渐增大，细胞的状态到第6代时开始变差，见图3。

茜素红染色：成骨细胞连续培养30 d以上，茜素红染色后出现钙结节，结节红染色艳，周围细胞淡色红染，见图4。

碱性磷酸酶测试：标准液的A值是0.325±0.021，实验所测细胞的A值是0.162±0.017，两组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.2 成骨细胞凋亡模型结果观察 加入1×10^-6 mol/L的地塞米松模型组72 h收集细胞，细胞的凋亡明显比空白组增加，细胞凋亡率为(18.627±3.756)%，而空白组的凋亡率为(5.067±1.693)%，两组比较，差异有显著性意义(t=4.357，P < 0.05)。见图5。

2.3 激素性骨坏死的原理检测结果

MTT检测：MTT法检测可以反应存活细胞的数目，酶标仪检测A值与活细胞数成正比。空白组、地塞米松模型组、星型胞菌素组和佛波醇组的A值分别为0.690±0.098，0.502±0.015，0.548±0.016，0.543± 0.020，与空白组比较，其他3组均降低，差异有显著性意义(F =50.640，P < 0.01)。但星型孢菌素与佛波醇组均高于地塞米松模型组，见表1，图6。

流式细胞仪检测：空白组、地塞米松模型组、佛波醇组和星型胞菌素组的凋亡率分别为(5.067±1.693)%、(8.627±3.756)%，(25.653± 2.480)%，(8.333±3.327)%，组间比较，差异有显著性意义(F=20.451，P < 0.05)。佛波醇组和星型胞菌素组明显低于地塞米松模型组。可见佛波醇和星型胞菌素可调节地塞米松诱导成骨细胞的凋亡，佛波醇的凋亡率低于地塞米松模型组可能与佛波醇促进细胞增殖的作用有关，见表2，图7。

2.4 细胞胞浆与胞膜蛋白激酶C含量的变化 胞浆中的蛋白激酶C加入地塞米松10 min时降到最低，30 min时与空白组持平，60 min时高于空白组，见表3。胞膜中10 min最高，30 min时与空白持平，60 min时低于空白，见表4。

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引言

股骨头骨坏死的特点是股骨头坏死组织缺血和骨微结构的恶化，从而增加股骨头残疾和崩溃的风险^[1-2]。糖皮质激素是自然产生的类固醇激素或人工合成的化合物，被广泛用于治疗炎症和自身免疫性疾病^[3]。外源性和内源性的糖皮质激素过剩主要的不良反应是骨质流失和骨质疏松症^[4]，导致骨折的风险增加^[4]。据报道长期糖皮质激素治疗可抑制骨微结构和骨组织的矿物密度^[5]，而约有一半的库欣综合征患者和1/3的患者长期服用糖皮质激素^[6-7]，由于骨质疏松导致低能量骨折，发病后治疗几个月之内迅速增加骨折风险，停药后迅速下降^[4]。相当多的证据表明，糖皮质激素在人类和小鼠引起的骨质流失分两个阶段：早期为快速流失的阶段，由于过度的骨吸收和较慢骨重建，后阶段骨量丢失是因骨形成不足^[8-10]，而后阶段是因为糖皮质激素的细胞毒性对成骨细胞的生成和活动的影响^[10]。成骨细胞分化和骨形成的减值是糖皮质激素引起的骨质疏松症的主要解释^[11-12]。

长期类固醇治疗导致骨形成减少和骨质流失被认为是股骨头坏死有力的病因学^[13-15]。骨架可连续再生，10年完成骨骼重塑，重塑包括由破骨细胞去除老骨和由成骨细胞生成新骨^[16]。多数幸存的成骨细胞变成骨，埋在骨基质，其中可能发挥的协调作用进一步改造活动，包括骨骼的修复微损伤^[17]。成骨细胞和/或骨细胞凋亡将危及骨骼的完整性，骨质流失和脆弱性骨折的发病与糖皮质激素过剩^[18]。

骨重建中的这些变化可能与成骨细胞的数量减少和活动有关^[19]。糖皮质激素影响骨内成骨细胞的分化和活性^[4]。1×10^-7mol/L地塞米松抑制成骨细胞分化和增殖，在第7天诱导骨祖细胞MC3T3-E1细胞的凋亡^[3]。糖皮质激素通过类似抑制细胞周期提高细胞凋亡的方法减少成骨细胞和骨细胞的数量^[20-21]。骨细胞凋亡增加已在股骨头坏死临床研究中得到证实^[22-23]。实验研究发现糖皮质激素通过增加成骨细胞凋亡导致股骨头坏死发生^[24-25]。对糖皮质激素诱导成骨细胞的凋亡机制的研究有利于揭示激素性骨坏死的发病过程。

糖皮质激素已被证明能抑制成骨细胞分化，通过下调一些关键蛋白，如生长激素，胰岛素样生长因子Ⅰ和Ⅱ，碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨钙素、骨质素或通过某些蛋白质如MKP-1，胶原酶1，胶原酶3^[26]。地塞米松在其他信号通路涉及成骨细胞分化的影响可能是Krox20/EGR2，MPK-1，转化生长因子β-Smad，Camp/PKA，β-catenin^[27-35]。现在有文献报道蛋白激酶C与成骨细胞凋亡有关，例如神经酰胺通过细胞内蛋白激酶C信号转导通路调节成骨细胞的存活和凋亡^[16]，甲状旁腺激素调节成骨细胞凋亡依赖环磷酸腺苷的PKA途径和依赖钙的蛋白激酶C途径^[36]，但目前没有关于地塞米松诱导成骨细胞凋亡在蛋白激酶C方向机制的报道。这次实验研究目的是探索地塞米松诱导成骨细胞凋亡的机制。

材料方法

设计：细胞学体外观察。

时间及地点：于2011年3至12月在北医三院科研楼中心实验室完成。

材料：

实验动物：健康新生1 d内SD大鼠4只，不分雌雄，购自北京大学医学部动物实验中心，实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。

实验方法：

实验原理：蛋白激酶C蛋白激酶C是一种细胞质酶，在未受刺激的细胞中，蛋白激酶C主要分布在细胞质中，呈非活性构象。一旦有第二信使的存在，蛋白激酶C将成为膜结合的酶，它能激活细胞质中的酶，参与生化反应的调控，同时也能作用于细胞核中的转录因子，参与基因表达的调控，是一种多功能的酶。因此检验胞膜、胞质中的蛋白激酶C量的变化可反应蛋白激酶C是否参与细胞凋亡^[33]。

地塞米松诱导成骨细胞凋亡机制在蛋白激酶C途径实验的试剂、药品和设备：

制作标准曲线：使用RD公司的大鼠蛋白激酶C试剂盒，以标准浓度做横坐标，以标准浓度测得的A值为纵坐标，绘制标准曲线。依照试剂盒测取相关实验对象的A值，求出蛋白激酶C的量。见图1。

成骨细胞的培养：成骨细胞的分离采用酶交替消化法。在超净台内将4只大鼠胎鼠浸泡于体积分数75%的乙醇5 min，取出后放入培养皿中，剥出颅骨，剔除骨膜、血管和结缔组织，放入PBS中浸泡。骨片剪碎，用PBS冲洗3次，冲洗干净。加入0.25%胰蛋白酶4 mL 消化5 min，加入4 mL 含体积分数10%FBS的F12培养基终止消化，去掉消化液；加入0.1%Ⅰ型胶原酶5 mL，于37 ℃消化30 min，收集消化液，连续消化3次。用离心机1 000 r/min，离心半径13.5 cm，离心5 min，弃去上清；将沉淀移入培养瓶中，加入培养基含体积分数10% FBS的F12培养基4.5 mL，倒置培养瓶于培养箱；1 h后将培养瓶翻转过来。以后每3 d换培养液1次，待生长细胞铺满平皿80%后，进行传代，取第3代做实验^[35]。

成骨细胞的鉴定：①细胞形态观察相差显微镜下观察原代培养24 h、6 d及第2，3代的成骨细胞的细胞形态。②茜素红染色：茜素红配置用蒸馏水配置0.1%的茜素红溶液，调节pH到7.2，然后原代和第4代的细胞培养18 d以上即可染色。③染色方法：先用PBS冲洗3次，体积分数95%的乙醇固定10 min，加入茜素红染液，放入培养箱中30 min，用PBS冲洗后即可。④碱性磷酸酶试剂盒检测细胞培养液中的碱性磷酸酶含量。

骨细胞凋亡模型：选择生长良好的成骨细胞，以细胞浓度为1×10⁸ L^-1接种于25 cm的培养瓶中，48 h后贴壁生长良好，用药物剂量1×10^-6 mol/L的地塞米松加入培养瓶中，于72 h收集细胞，检查凋亡比例。

激素性骨坏死的原理检测：

MTT检测：第4代未干预细胞分空白组、地塞米松模型组、佛波醇组和星型胞菌素组，每组5孔。以8×10³细胞浓度接种于96孔板，12 h后加药物，24 h后加入1×10^-6 mol/L的地塞米松，于48 h后检查细胞活性。

流式细胞仪检测：以细胞浓度为1×10⁸ L^-1接种于 25 cm的培养瓶中，48 h后地塞米松模型组加入1× 10^-6 mol/L地塞米松，佛波醇组加入1×10^-6mol/L地塞米松和1×10^-7mol/L佛波醇，星型胞菌素组加入1× 10^-6 mol/L地塞米松和1×10^-7 mol/L星型胞菌素。空白组不再进行干预。加药72 h后流式细胞仪检测凋亡。

检测蛋白激酶C变化：收集上述4组细胞，加入 1 mol/L蛋白激酶C提取液，超声粉碎5次，20 s/次， 100 000×g离心1 h，上清为胞浆部分。在沉淀中加入 1 mL含0.1% Triton100的蛋白激酶C提取液，按上述方法超声粉碎，4 ℃裂解30 min后离心(同上)。上清为含胞膜部分。根据浓度绘制曲线，选择测试点为10，30，60 min进行测量。

主要观察指标：①MTT检测观测各种药物对细胞增殖或抑制的影响。②流式细胞仪检测观测加入各种药物加入后对细胞增殖或抑制的影响。③检测蛋白激酶C变化观测加入各种药物后对细胞膜及细胞质中蛋白激酶C含量的变化。

统计学分析：第一作者统计，采用SPSS 13.0统计软件进行处理，采用t 检验和单因素方差分析检验方法，统计学软件来至于辽宁医学院。

讨论

长期服用地塞米松可导致机体内源性和外源性的地塞米松剩余，主要的不良反应为骨质流失和骨质疏松症^[3]。导致这些不良反应的原因是地塞米松抑制骨形成，骨形成跟成骨细胞的数量和变化有关^[11-12^，^19]。地塞米松影响骨内成骨细胞的分化和活性^[4]，降低成骨细胞的数量通过加强细胞凋亡以及抑制细胞周期^[20-21]。所以要想改善地塞米松的不良反应需要干预地塞米松对成骨细胞的影响。

实验得出结论地塞米松诱导成骨细胞凋亡的机制之一是增强蛋白激酶C的活性，所以阻止蛋白激酶C的传导是一种治疗方法。蛋白激酶C是磷脂依赖钙激活的蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶，是多种细胞信号传导通路中的主要因子。蛋白激酶C参与调控细胞周期，并对细胞的生长与凋亡起调节作用。生理状态下细胞信号如激素、生长因子或神经递质等首先和细胞膜受体结合，进而激活G蛋白，后者激活磷脂酶C，水解磷脂肌醇4、5二磷脂产生二酯酰甘油(DAG)和肌醇1、4、5-三磷酸，其中DAG是激活蛋白激酶C的主要胞内物质，它可直接激活蛋白激酶C，被激活的蛋白激酶C在转位到细胞膜后介导细胞增殖和分化、影响细胞周期和细胞凋亡、调节基因表达、控制神经传导等。

地塞米松导致成骨细胞凋亡的机制很多，包括Krox20/EGR2，MPK-1，转化生长因子β-Smad，camp/PKA，β-catenin。目前细胞传导通路还不是很明确，各传导通路之间互相影响，pkb跟蛋白激酶C之间的作用也不明确，有时协同，有时拮抗。所以蛋白激酶C只是机制中的一种，pka，pkb，蛋白激酶C等各传导通路之间的关系有待进一步研究。

星型胞菌素与佛波醇为蛋白激酶C的调节剂，实验中所得结论为星型胞菌素降低地塞米松诱导成骨细胞的凋亡率，佛波醇增加细胞的凋亡率。但肉眼可见佛波醇组的细胞生长活跃，细胞数量增多。佛波醇促进细胞增殖但细胞凋亡增加，最终成骨细胞的活着的数量增加还是减少还有待调查。

加入地塞米松后胞浆的蛋白激酶C明显减少，胞膜明显增加；蛋白激酶C蛋白的总量数据显示没有固定关系，应该有蛋白激酶C蛋白的生成或消耗。但胞浆、胞膜都提示在加入地塞米松10 min时蛋白激酶C的变化最大，30 min时几乎恢复到原始水平，30-60 min期间慢慢恢复，60min时超过原始水平。这说明细胞对地塞米松刺激受时间的影响，细胞在一定时间后会自动减弱地塞米松刺激对自身的影响，细胞可能有适应地塞米改变的机制。

细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程。细胞凋亡的特征是细胞由于降解酶，主要是水解酶-蛋白酶与核酸酶的作用，在近乎正常的细胞质膜内趋向死亡。有研究报道：线粒体跨膜电位的耗散与细胞凋亡有密切关系，在细胞凋亡过程中线粒体跨膜电位的耗散主要是由于线粒体内膜的通透性转变，这是由于生成了动态的由多个蛋白质组成的位于线粒体内膜与外膜接触位点的通透性转变孔道，PT孔道开放导致细胞凋亡，而PT孔道关闭能防止细胞凋亡。线粒体是细胞的能量中枢，而蛋白激酶C的激活是需要耗能的，抑制蛋白激酶C的的激活可以减少细胞的耗能，或许在能量方面双方会有一定的联系，有待下一步的进展研究。

地塞米松诱导成骨细胞凋亡的蛋白激酶C途径

Mechanism of osteoblast apoptosis induced by dexamethasone via the protein kinase C pathway

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