人外周血内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.36.020

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (36): 6508-6514.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.36.020

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

人外周血内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

乔威¹，冉峰²，刘长建²

¹江苏省中医院血管外科，江苏省南京市 210029；²南京大学医学院附属鼓楼医院血管外科，江苏省南京市 210008

收稿日期:2013-04-02 修回日期:2013-04-11 出版日期:2013-09-03 发布日期:2013-09-03
通讯作者: 刘长建，教授，博士生导师，南京大学医学院附属鼓楼医院血管外科，江苏省南京市 210008 nju_liuchangjian@163.com
作者简介:乔威☆，男，1983年生，江苏省徐州市人，2010年南京大学医学院毕业，博士，主治医师，主要从事血管外科临床，干细胞及组织工程血管研究。 qw0329@163.com
基金资助:
江苏省卫生厅重大科研项目(K200609)*，课题名称：生物支架、干细胞构建组织工程血管的研究

Isolation, culture and characterization of endothelial progenitor cells from the human peripheral blood

Qiao Wei¹, Ran Feng², Liu Chang-jian²

¹Department of Vascular Surgery, Jiangsu Province Hospital of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China; ²Department of Vascular Surgery, Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China

Received:2013-04-02 Revised:2013-04-11 Online:2013-09-03 Published:2013-09-03
Contact: Liu Chang-jian, Professor, Doctoral supervisor, Department of Vascular Surgery, Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China nju_liuchangjian@163.com
About author:Qiao Wei,☆ M.D., Attending physician, Department of Vascular Surgery, Jiangsu Province Hospital of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China qw0329@163.com
Supported by:
Key Scientific and Technology Program of Jiangsu Provincial Health Bureau, No. K200609*

摘要/Abstract

摘要：

背景：内皮祖细胞是成熟内皮细胞的前体细胞，具有新生血管和新生内皮化作用，在许多方面均有广泛应用前景，但其生物学特征及鉴定方法仍存争议。
目的：探索从人外周血分离培养内皮祖细胞的方法并鉴定其生物学特征。
方法：外周采血后应用密度梯度离心法分离成人外周血单核细胞，在内皮细胞全培养基重悬后接种于纤维连接蛋白包被的培养瓶中，体外培养扩增获取人内皮祖细胞并观察其形态变化、生长增殖潜能及细胞表面抗原表达情况，并通过细胞一氧化氮分泌功能测定及体外血管形成实验检测其功能学特征。
结果与结论：体外诱导培养后，六七天形成纺锤样细胞簇，两三周黏附细胞发育形成鹅卵石样外观细胞，逐渐融合呈外生性生长。在相同培养条件下，与人主动脉内皮细胞相比人内皮祖细胞具有高的增殖潜能。人内皮祖细胞表达CD31、CD34、CD144、KDR，表现为典型内皮细胞系表型，此外细胞可摄取ac-LDL并结合UEA-Ⅰ。在功能上内皮祖细胞可分泌一氧化氮并可在Matrigel中形成管腔样结构。提示通过密度梯度离心法分离人外周血单核细胞体外黏附诱导培养可获取人外周血内皮祖细胞；细胞形态、增殖能力、生物表型特征结合细胞功能学的综合性鉴定方法用于内皮祖细胞的鉴定具有一定意义。

关键词: 干细胞, 内皮细胞, 单核细胞, 细胞培养技术, 一氧化氮

Abstract:

BACKGROUND: Endothelial progenitor cells, known as the precursor cells of mature endothelial cells, have the function of neovascularization and neoendothelialization. Therefore, endothelial progenitor cells have potential applicability in many fields. Endothelial progenitor cells can be isolated and cultured from different resources with different methods, but the biological properties and identification of endothelial progenitor cells still have controversies.
OBJECTIVE: To explore the methods of isolation and culture of endothelial progenitor cells from the human peripheral blood and to identify the biological features of endothelial progenitor cells.
METHODS: Mononuclear cells were isolated from the human peripheral blood using density gradient centrifugation, and the cells were resuspended in endothelial basal medium-2 supplemented with the EGM-2-MV-SingleQuots. Then, the cells were inoculated in human fibronectin-coated culture flasks and cultured in EBM-2MV medium. The morphology of endothelial progenitor cells was observed. The proliferation potential and surface markers of endothelial progenitor cells were characterized carefully. Furthermore, the functional properties such as nitric oxide release and tube formation on Matrigel were also evaluated.
RESULTS AND CONCLUSION: While adherent cells maintained, spindle-shaped cells formed a cell cluster after 6-7 days. Then, adherent cells developed to endothelial progenitor cells with a cobblestone appearance after 2-3 weeks. The endothelial progenitor cells were confluent with an outgrowth appearance. Endothelial progenitor cells had a higher proliferation potential compared with human aortic endothelial cells under the same culture condition. Endothelial progenitor cells expressed CD31, CD34, CD144 and KDR, displaying an obvious endothelial phenotype. Endothelial progenitor cells were also found to uptake DiL-acLDL and exhibit lectin binding capability. Furthermore, endothelial progenitor cells were able to form capillary tubes on Matrigel and had the ability to release nitric oxide. Therefore, endothelial progenitor cells can be obtained from the human peripheral blood by density gradient centrifugation and adherent culture. A combining method for the identification of endothelial progenitor cells should be recommended.

Key words: stem cells, endothelial cells, monocytes, cell culture techniques, nitric oxide

中图分类号:

R394.2

乔威，冉峰，刘长建. 人外周血内皮祖细胞的分离、培养及鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(36): 6508-6514.

Qiao Wei, Ran Feng, Liu Chang-jian. Isolation, culture and characterization of endothelial progenitor cells from the human peripheral blood[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(36): 6508-6514.

图/表（结果） 4

2.1 人外周血来源内皮祖细胞形态 新分离的单核细胞呈透亮圆形，见图1A，接种数小时后开始贴壁，贴壁细胞约占分离细胞15%，前3 d培养细胞呈大小不等圆形，六七天后胞体增大，形成纺锤样细胞簇，其间可见针状成簇生长细胞，但很快消退消失；而纺锤样细胞簇在第9-12天迅速长成集落，细胞呈铺路石样排列生长，培养16-20 d，细胞生长至80%-90%融合，见图1B，细胞传代后卵圆形生长迅速，见图1C，呈外生性生长，见图1D。细胞增殖迅速3-5 d可传代1次，传代后细胞形态稳定。

为了评估人外周血内皮祖细胞的增殖能力，将第1代人外周血内皮祖细胞与人主动脉内皮细胞进行了比较。通过增殖曲线发现内皮祖细胞有强大的增殖潜能，其8 d内的增殖情况表明其细胞数呈指数级增长，第4，6，8天其细胞数与人主动脉内皮细胞相比差异有显著性意义(P < 0.05)，第8天内皮祖细胞细胞数约是人主动脉内皮细胞的2.8倍。
2.3 流式细胞表面抗原标记检测 见图3。通过流式细胞仪对人外周血内皮祖细胞的细胞表型分析发现，内皮祖细胞表达与内皮细胞系相关的表面抗原标记KDR、CD31、CD144，阳性率分别为(85.2±7.1)%、(91.1±6.8)%和(91.5±8.8)%；而不表达造血干细胞系表面抗原标记CD14、CD45，阳性率分别为(0.1±0.07)%和(0.4± 0.1)%；CD34和CD133作为鉴定内皮祖细胞的主要表面抗原标记，结果显示，CD34的表达阳性率为(13.8±4.2)%，而人外周血内皮祖细胞几乎不表达CD133仅为(0.7±0.2)%，这可能与细胞培养分化逐渐成熟有关。

2.4 DiI-ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ双荧光染色分析 染色为红色表示细胞摄取ac-LDL，见图4A，染色为绿色表示其与UEA-Ⅰ结合，见图4B。人外周血内皮祖细胞能摄取ac-LDL，并能与UEA-Ⅰ结合，为双染色阳性细胞。

2.5 一氧化氮分泌功能测定 测量原代内皮祖细胞、第3代内皮祖细胞和人主动脉内皮细胞培养基上清中一氧化氮浓度为分别(1.81±0.24)，(2.21±0.41)和(2.78± 0.17) μmol/L，原代培养的内皮祖细胞结果与第3代内皮祖细胞、人主动脉内皮细胞相比差异有显著性意义(P=0.032)，而第3代内皮祖细胞与人主动脉内皮细胞结果间差异无显著性意义(P > 0.05)，提示培养的人外周血内皮祖细胞可以分泌一氧化氮，随着培养细胞分化其分泌一氧化氮能力增强，而分泌一氧化氮是内皮细胞的重要功能，这提示了分离培养的人外周血内皮祖细胞可向内皮细胞分化成熟。
2.6 体外毛细血管形成实验 接种在Matrigel凝胶上的原代人外周血内皮祖细胞，于37 ℃培养箱中孵育12 h，即能形成稳定的血管腔样结构，见图5。

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引言

材料方法

设计：细胞学水平，对比观察实验。

时间及地点：于2009年3月至2010年5月在南京大学医学院附属鼓楼医院科研实验室完成。

材料：经南京大学伦理委员会批准，7份人外周血取自7名健康志愿者，4名男性，3名女性，年龄20-33岁，对实验方案均知情同意。

人外周血内皮祖细胞的分离、培养及鉴定实验的主要试剂与仪器：

实验方法：

人外周血内皮祖细胞的分离和培养：经外周静脉抽取 50 mL静脉血，用PBS等体积稀释后，加入含Ficoll-Paque人淋巴细胞分离液的离心管上层(两者高度比为4∶6)，常温下，离心半径15 cm，2 000 r/min 离心30 min，小心吸取中间白膜层细胞，PBS洗涤2次后，以离心半径15 cm，1 500 r/min离心8 min获取单核细胞。将单核细胞重悬于含体积分数10%胎牛血清内皮细胞全培养基，以1×10⁶浓度接种于预先包被好纤维连接蛋白(5 μg/cm²)的25 cm²细胞培养瓶中，置37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱中培养，3 d后换液除去未贴壁悬浮细胞，贴壁细胞继续培养，以后每3 d换液1次^[15-16]。待细胞80%左右融合后以1∶3比例传代培养。培养期间，每天在倒置相差显微镜下观察贴壁细胞的形态和数量变化。

人外周血内皮祖细胞增殖能力：为评估人外周血内皮祖细胞的增殖能力，将成熟的人主动脉内皮细胞和第1代的人外周血内皮祖细胞进行了比较。人主动脉内皮细胞购自于Clonetics公司并也在内皮细胞全培养基的同一环境中培养。绘制并比较了其8 d的生长增殖曲线：首先，内皮祖细胞和人主动脉内皮细胞以2×10³/孔的浓度接种于35 mm直径的6孔板，细胞每3 d换液1次。第2，4，6和8天时，胰酶消化细胞并应用血细胞计数板计数，无活性细胞通过锥虫蓝染色区别去除。

人外周血内皮祖细胞表面抗原标记分析：为保护细胞表面标记应用非酶型细胞解离液分离黏附的第3代人外周血内皮祖细胞，取4×10⁶个细胞，FACSCalibur型流式细胞仪行表面抗原标记鉴定：细胞在4 ℃下与荧光标记单克隆抗体CD31-PE、CD34-PE、CD133-PE、CD144-PE、CD14-FITC、CD45-FITC以及KDR-PE孵育30 min，以同种型免疫球蛋白作为对照进行流式细胞仪分析。

DiI-ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ双荧光染色分析：原代内皮祖细胞经体外诱导分化培养3周后，取贴壁细胞与 10 mg/L DiI-ac-LDL 4 μg置培养箱孵育4 h，PBS洗3次，20 g/L多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗，将10 mg/L FITC- UEA-Ⅰ 4 μg加于上述标本中，于37 ℃孵育1 h，荧光显微镜下观察染色情况。

一氧化氮分泌功能测定：分别取原代内皮祖细胞，第3代内皮祖细胞和人主动脉内皮细胞培养，以5×10⁴个细胞种植于6孔板，培养3 d后，取培养基上清，按一氧化氮试剂盒说明测定一氧化氮浓度。

体外毛细血管形成实验：为分析体外内皮祖细胞毛细血管形成能力，将300 μL Matrigel凝胶铺于24孔板内并在37 ℃下孵育30 min，随后将消化下来的第3代内皮祖细胞以5×10⁴个与300 μL的完全培养基混合重悬后加入24孔板内，孵育12 h后倒置相差显微镜下观察毛细血管管腔样结构形成情况。

主要观察指标：观察人外周血来源内皮祖细胞形态、增殖能力、细胞表型特征以及细胞功能特征。

统计学分析：采用SPSS 13.0统计软件包进行分析，数据以x(_)±s表示，组间比较采用非配对t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

内皮祖细胞在出生后病理生理的新生血管形成过程中起重要作用^[3^，^17-18]。因而其在组织工程、再生医学及肿瘤生理等领域具有广泛应用前景。内皮祖细胞数量极少仅占骨髓细胞的1%和外周血单核细胞的0.01%^[19]，故在应用前的分离培养及扩增尤为重要。内皮祖细胞主要存在于骨髓、外周血和脐血，少量存在于心脏、血管、骨骼肌和脂肪组织，骨髓、外周血或脐血是内皮祖细胞外培养扩增的主要来源^[15^，¹⁷^，^20-23]。而内皮祖细胞经典的分离培养方法有密度梯度离心分离单核细胞的黏附诱导培养和免疫磁珠富集分离培养法。作者选择自外周血分离人外周血内皮祖细胞，其操作安全可行性强；而以骨髓为来源分离内皮祖细胞，存在骨穿引起疼痛不适、易感染、不易操作等不足；而脐血获得较难且存在伦理问题很难作为分离内皮祖细胞的常规来源。分离方法上由于传统免疫磁珠分选内皮祖细胞的方法操作复杂、费用较大，细胞获得率较低以及单独培养时缺少其他细胞的相互作用而导致内皮祖细胞增生及分化受限，在一定程度上制约了临床的广泛应用^[20^，^24]。故此实验中应用密度梯度分离外周血单核细胞，予体外黏附诱导培养成功培养扩增内皮祖细胞，其细胞形态及生物学特性稳定，可为进一步应用提供基础，此方法简单有效，值得推广。

作者分离培养获取的内皮祖细胞来源外周血单核细胞，而研究表明单核细胞具体多分化潜能，除包含有内皮祖细胞外，其在不同环境条件下可向血细胞、肝细胞、心肌细胞、上皮细胞、神经细胞等细胞分化^[25]，为得到实验所需的内皮祖细胞，要求体外诱导培养提供合适的坏境，作者采用分离的单核细胞种植于体外包被有人纤维连接蛋白的基底上贴壁培养，并应用含有重组人表皮增长因子、血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子等成分的内皮细胞全培养基进行诱导培养，通过不断去除不贴壁的杂质细胞，最终获得了纺锤形、鹅卵石样的单层细胞，经鉴定为实验所要培养的内皮祖细胞。而在内皮祖细胞体外诱导培养方面，也有一些不同研究报道，其培养所获得的细胞也有一定区别，如有研究将分离得到单个核细胞接种到铺有纤维连接蛋白的培养板中，24 h后将未贴壁细胞重新接种，可获得增殖能力强细胞集落，被称为内皮集落形成单位；有学者将分离得到的单个核细胞按与本文相同方法诱导培养获得相关细胞，并将其称为内皮集落形成细胞；此外还有相关报道将单个核细胞在培养基中培养4 d后弃去未贴壁的细胞，得到的贴壁细胞群继续培养，这些细胞可以促进缺血动物模型的血管新生，但不形成集落，被称为循环血管细胞^[12^，^15-16^，^26]。几乎所有研究者都认为其获得为相应内皮祖细胞，但何种细胞是真正意义内皮祖细胞仍需严格的鉴定研究探讨。

在应用之前，内皮祖细胞的定义及鉴定明确其细胞类型及其生物学特征也十分重要。然而，现今关于内皮祖细胞的定义及鉴定仍有很多争论。内皮祖细胞是一群存在于成血管细胞中的不同分化阶段具有高增殖能力并能够最终分化为内皮细胞的细胞亚群^[27]，研究已报道内皮祖细胞包括早期内皮祖细胞和晚期内皮祖细胞，其表型及功能不一，早期内皮祖细胞增殖缓慢，不能长期培养很快消退，主要分泌各种细胞因子促进晚期内皮祖细胞增殖生长及成血管作用，但不参与血管新生^[19^，^28]，本实验中在诱导培养早期可以发现一些针尖状贴壁细胞出现，但很快消退，可能即为早期内皮祖细胞，但近期已有研究表明早期内皮祖细胞是具有单核细胞分子表型的造血细胞^[29]，而不像晚期内皮祖细胞那样表现为内皮系特征细胞，而本文最终分离培养的内皮祖细胞与已有报道的晚期内皮祖细胞类似，具有内皮细胞分化特征，应为真正的内皮祖细胞。

内皮祖细胞研究报道中如上所述对其称呼不一，所有的研究结果均不完全相同，每位研究者均认为培养获得的相关细胞为可能存在的内皮祖细胞，但其所得到的细胞生物学特征不能完全统一。这可能与细胞不同分化阶段、培养环境条件以及其明显的异质性等因素息息相关^[12^，^30-34]。而这也进一步说明内皮祖细胞缺乏特定的表面标记，很难通过简单方法鉴定定义内皮祖细胞。目前内皮祖细胞主要是通过细胞能共同表达造血干细胞和内皮细胞表面标记(如CD34，KDR，vWF，CD31， VE-cadherin等)定义，并且将能摄取ac-LDL和结合UEA-Ⅰ的细胞视为正在分化的内皮祖细胞^[10-11^，¹⁴^，^35-36]，但何种抗原组合能够最佳描述内皮祖细胞仍无统一意见。而且内皮祖细胞与单核细胞及巨噬细胞存在明显的抗原重叠，且细胞可随环境变化改变表面抗原表达^[26^，^35]，使内皮祖细胞鉴定不能简单应用特定抗原标记来完成。Yoder等^[37]总结了近20位研究者关于内皮祖细胞细胞免疫表型分析结果发现，没有完全相同的研究报道，而多数用于鉴定的表面标记有CD34，KDR，vWF，CD31，CD133等。而从另一方面考虑，内皮祖细胞分化成为内皮细胞并行使内皮细胞功能是培养扩增内皮祖细胞的最终目的，故内皮祖细胞的功能特征值得注意。为此，有学者提出不管细胞表型如何，可能的内皮祖细胞均必须经体内外细胞功能评估予以鉴定评估^[10^，^36]，于是相关内皮祖细胞体外成血管能力分析，一氧化氮分泌系统分析等研究的到了开展，结果表明内皮祖细胞具有向内皮细胞分化必须具备的相关功能特征^[38-40]。因此，作者认为内皮祖细胞定义鉴定必需以其可分化成为内皮细胞为根本，采用综合性方式进行鉴定，而应用细胞形态特征、增殖能力、细胞表型特征结合应用合适的功能分析(如CD34，KDR，CD144和一氧化氮分泌实验)可作为内皮祖细胞鉴定的可行方式，细胞的功能学特征不容忽视。

实验中为更好鉴定和明确人内皮祖细胞的生物学特性，对细胞形态，增殖潜能，细胞表型及细胞体外功能等方面进行了仔细鉴定。实验结果发现，内皮祖细胞在培养后的两三周出现，细胞为鹅卵石样外观，呈铺路石样排列外生性生长，这与许多报道典型内皮祖细胞生长形态相符。而通过与人主动脉内皮细胞比较发现内皮祖细胞具有高增殖潜能，细胞生长增殖较快，可以作为种子细胞应用于不同领域的研究。通过表型分析发现内皮祖细胞表达CD31，CD34，CD144和KDR，CD14，CD45，CD133则表达极少，主要表现为内皮细胞系表型，说明内皮祖细胞逐渐向内皮细胞分化，具备内皮细胞相关特性，而动态分析各时间段不同环境下内皮祖细胞表型变化值得进一步进行深入研究。在体外功能研究方面，分泌一氧化氮是内皮细胞最重要功能之一，作者认为可作为功能鉴定方面的重要指标，研究发现内皮祖细胞可以分泌一氧化氮，并随着分化功能逐渐增强，说明分离培养的细胞逐步具备分化并行使内皮细胞相应功能的能力。而内皮祖细胞可在Matrigel上形成毛细血管管腔结构，与内皮细胞功能相似，已逐步具备内皮细胞新生血管的功能特性。这些结果表明体外分离培养的内皮祖细胞具备典型细胞外形特点，具备高增殖能力，在细胞表型兼具有内皮细胞特征，而更重要一点内皮祖细胞逐步具备内皮细胞相关重要功能特征，这些进一步印证应用综合的重视细胞功能特征的鉴定内皮祖细胞方法的必要和可行性。

综上所述，文章提供了一种简单有效、低花费的从人外周血中分离培养内皮祖细胞的方法。另外，在仍存争议的内皮祖细胞定义鉴定方面，通过形态学、增殖能力、细胞表型及细胞功能多方面研究分析，提出了综合性的鉴定方法，更加强调了内皮祖细胞功能鉴定的重要性，值得在以后研究中进一步应用。

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作者于2013年3月进行检索分析，检索时间范围为1998年01月至2012年12月。在pubmed上以“Endothelial progenitor cells”联合“isolation, culture, characterization”进行检索，共检索出文章108篇，进一步筛查获得与本文细胞培养鉴定相关文献57篇，同时以“内皮祖细胞，培养、鉴定”为关键词检索中文期刊全文数据库(CHKD)进行检索，共有71篇相关文章。通过对检索文献进行分析，对于创新性详细叙述如下：对于内皮祖细胞培养鉴定方面研究，分离培养方法主要为密度梯度离心法及免疫磁珠，分离后采用黏附诱导方法培养出内皮祖细胞，国内外研究多数认为内皮祖细胞鉴定上主要通过多种细胞表型鉴定联合细胞可吞噬Ac-LDL 及结合UEA-I来进行，但国外研究内皮祖细胞定义鉴定仍有较大争议，无法形成统一标准，对于不同研究中分离细胞是否为真正内皮祖细胞及细胞特性各有论点，尤其是越来越多研究者强调不能单纯依靠表型特征定义内皮祖细胞，细胞功能特征需要引起重视。本课题中亦通过了分析内皮祖细胞的多种表面标志的表达情况以及其同时吞噬Ac-LDL和结合UEA-I的特征来对其进行鉴定，取得了与多数研究类似结果。但其表型特征上由于内皮祖细胞的异质性，结果也表明其表型特征大部分国内外研究一致。但也有有一定的不同。另一方面，对于内皮祖细胞功能学鉴定方面，内皮祖细胞最终分化为内皮细胞，其必然要逐步具备内皮细胞基本特征，故对一氧化氮分泌情况及体外成血管能力进行了评估，得到的结果与国内外相关报道基本一致。检索分析发现国内外研究研究对象多为动物来源内皮祖细胞，人内皮祖细胞研究标本选取也多为骨髓或脐血，人外周血分离培养内皮祖细胞的报道较少。骨髓及脐血存在来源及材料采取方面的弊端，为以后研究造成困难。而本实验以人外周血为研究材料，利用相对简单而且经济的方法，培养诱导出内皮祖细胞，不仅节约了试验成本而且得到较多的细胞数量，为以后的进一步研究提供实验基础和方法。为今后的体内实验，大规模临床应用提供细胞来源。同时针对内皮祖细胞定义鉴定方面，通过实验获取结果，结合国内外研究进展首次提出了通过细胞形态、增殖能力、细胞表型以及功能特征四方面进行综合性鉴定的内皮祖细胞鉴定策略，并特别强调了对于内皮祖细胞功能学鉴定的重要性，具有一定的创新性。

人外周血内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

Isolation, culture and characterization of endothelial progenitor cells from the human peripheral blood

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