同基因与异基因胚胎肝干细胞移植治疗小鼠肝硬化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.36.015

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (36): 6474-6480.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.36.015

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同基因与异基因胚胎肝干细胞移植治疗小鼠肝硬化

韩博¹，徐三荣²，张进²，周庆²，李伟¹

¹江苏大学临床医学院，江苏省镇江市 212001；²江苏大学附属医院，江苏省镇江市 212001

出版日期:2013-09-03 发布日期:2013-09-03
通讯作者: 徐三荣，博士，主任医师，江苏大学附属医院，江苏省镇江市 212001
作者简介:韩博★，男，1982年生，陕西省商洛市人，汉族，2013年江苏大学毕业，硕士，主治医师，主要从事普外科相关疾病的研究。 393872056@qq.com
基金资助:
镇江市科学基金面上项目资助(SH2011023)*，课题名称：PTD-Foxp3融合蛋白诱导小鼠嵌合体及移植免疫耐受的研究

Syngeneic and allogeneic fetal liver stem cell transplantation in the treatment of mouse hepatic cirrhosis

Han Bo¹, Xu San-rong², Zhang Jin², Zhou Qing², Li Wei¹

¹Clinical College of Jiangsu University, Zhenjiang 212001, Jiangsu Province, China; ²Affiliated Hospital of Jiangsu Province, Zhenjiang 21200

Online:2013-09-03 Published:2013-09-03
Contact: Xu San-rong, M.D., Chief physician, Affiliated Hospital of Jiangsu Province, Zhenjiang 212001, Jiangsu Province, China
About author:Han Bo★, Master, Attending physician, Clinical College of Jiangsu University, Zhenjiang 212001, Jiangsu Province, China 393872056@qq.com
Supported by:
the General Program of Science Foundation of Zhenjiang City, No. SH2011023*

摘要/Abstract

摘要：

背景：胚胎肝干细胞移植免疫相关研究较少，同基因与异基因胚胎肝干细胞移植对小鼠肝硬化的治疗作用，目前尚不清楚。
目的：观察同种同基因与同种异基因胚胎肝干细胞移植对小鼠肝硬化的治疗作用，以及治疗过程中免疫排斥反应发生情况。
方法：采用Ⅳ型胶原酶消化法分离纯化BALB/c与C57BL/6胚胎肝干细胞。104只健康BALB/c小鼠随机分为4 组：正常对照组不予任何处理；肝硬化组、同种同基因移植组、同种异基因移植组腹腔注射四氯化碳石蜡油溶液复制肝硬化模型，16周后分别经其尾静脉注射生理盐水，等量同种同基因胚胎肝干细胞和同种异基因胚胎肝干细胞。在移植4周后比较各组受体小鼠存活情况、肝功能恢复情况、肝纤维化程度、免疫细胞(CD4⁺T、CD8⁺T、NK、NKT)数目及比值、肝脏病理学变化。
结果与结论：同种同基因移植组和同种异基因移植组生存率均为100%，与肝硬化组小鼠存活率67%相比差异有显著性意义(P < 0.05)；各组肝功能和肝纤维化指标差异无显著性意义(P > 0.05)。各组免疫学指标比较差异无显著性意义(P > 0.05)。肝脏组织病理学显示肝组织修复：同种异基因移植组>同种同基因移植组>肝硬化组。因此，经尾静脉移植胚胎肝干细胞能提高肝硬化小鼠的生存率、减轻肝细胞坏死程度；同种同基因与同种异基因胚胎肝干细胞移植未发现免疫排斥，对小鼠肝硬化有一定的治疗作用。

关键词: 干细胞, 胚胎干细胞, 干细胞移植, 肝硬化, 移植, 同基因

Abstract:

BACKGROUND: Immunity of fetal liver stem cell transplantation is rarely reported, syngeneic and allogeneic fetal liver stem cell transplantation in the treatment of hepatic cirrhosis is still unclear.
OBJECTIVE: To observe the therapeutic effects of syngeneic and allogeneic fetal liver stem cell transplantation on hepatic cirrhosis as well as immune rejections during the therapeutic process.
METHODS: The fetal liver stem/progenitor cells from BALB/c and C57BL/6 mice were isolated and purified by the type IV collagen enzyme digestion method. A total of 104 healthy BALB/c mice were randomly assigned to four groups. Normal control group: no treatment; Hepatic cirrhosis group, syngeneic transplantation group and allogeneic transplantation group: 16 weeks after hepatic cirrhosis models of mice were developed by intraperitoneal injection with carbon tetrachloride, physiological saline, syngeneic fetal liver stem cells and allogeneic fetal liver stem cells were injected via the caudal vein. Finally, the survival statuses, liver function, hepatic fibrosis index, the number and ratio of immune cells (CD4⁺T, CD8⁺T, NK, NKT) and histopathologic examinations were compared in each group after transplantation 4 weeks.
RESULTS AND CONCLUSION: The survival rates in the two transplantation groups were both 100%, which was significantly higher than that in the hepatic cirrhosis group (67%, P < 0.05). The liver function and liver fibrosis index in each group did not show statistical differences (P > 0.05). Immunological tests showed no difference between groups (P > 0.05). Pathohistology examination of hepatic tissue repair: Allogeneic transplantation group > syngeneic transplantation group > hepatic cirrhosis group. Hence, fetal liver stem cell transplantation via the caudal vein could elevate the survival rate of hepatic cirrhosis mice, alleviate the degree of hepatocyte necrosis. There is no immunologic rejection during syngeneic and allogeneic fetal liver stem cell transplantation that could help to treat hepatic cirrhosis in mice.

Key words: stem cells, embryonic stem cells, stem cell transplantation, liver cirrhosis, transplantation, isogeneic

中图分类号:

R394.2

韩博，徐三荣，张进，周庆，李伟. 同基因与异基因胚胎肝干细胞移植治疗小鼠肝硬化[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(36): 6474-6480.

Han Bo, Xu San-rong, Zhang Jin, Zhou Qing, Li Wei . Syngeneic and allogeneic fetal liver stem cell transplantation in the treatment of mouse hepatic cirrhosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(36): 6474-6480.

图/表（结果） 6

2.1 各组小鼠的生存率 胚胎肝干细胞移植4周后，肝硬化组小鼠16只存活，8只死亡，存活率为67%；同种同基因移植组小鼠24只存活，0只死亡，存活率为100%；同种异基因移植组小鼠24只存活，0只死亡，存活率为100%。移植组小鼠存活率明显高于肝硬化组(P < 0.05)，见图1和表1。

2.2 小鼠一般生存情况 肝硬化造模16周时小鼠精神萎靡，反应迟钝，食欲差，活动减少，毛发蓬乱，尿色深黄，体质差。移植7 d后，肝硬化组：精神差，反应迟钝，饮食活动渐增加，毛发乱，尿色黄，体质差；两移植组精神稍差，反应稍迟钝，饮食活动渐增加，毛发稍乱，尿色浅黄，体质差。4周后各组均正常饮食，活动自如，毛发正常，尿色浅黄，体质量增加。
2.3 小鼠肝功能及肝纤维化指标检测 肝硬化造模16周后小鼠血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶等肝功能指标和肝纤维化指标升高。胚胎肝干细胞移植后3，7 d移植组肝功能指标谷丙转氨酶和谷草转氨酶等明显降低，同种异基因移植组优于同种同基因移植组(P < 0.05)。移植后4周，两移植组与肝硬化组相比，差异无显著性意义(P > 0.05)，肝功能及肝纤维化指标见表2。

2.4 免疫学检查指标 移植后第4周流式细胞仪检测脾、肝门淋巴结内免疫细胞亚群CD3⁺T、CD4⁺T、CD8⁺T、NK、NKT等的比例及绝对数，NKI.1细胞主要是NK细胞或NKT细胞的标志，两移植组与肝硬化组比较，以及两移植组组间比较，差异均无显著性意义(P > 0.05)。表明同基因、异基因胚胎肝干细胞移植后无免疫排斥反应发生或免疫排斥反应较轻。流式免疫细胞亚群分析见图2，3。

2.5 肝脏病理特点 正常小鼠肝脏色泽红润，表面光滑无结节，肝叶边缘锐利，质地柔软，见图4。四氯化碳肝硬化建模16周后，模型小鼠肝脏颜色晦暗，表面弥漫大小不等结节，肝叶边缘变钝，肝脏质地变硬，见图5，镜下大量纤维组织增生，包绕肝细胞，形成假小叶。

两移植组：镜下肝小叶结构清晰，肝细胞索规则，肝窦无明显扩张，无纤维组织增生，肝细胞形态接近正常，见图7和图8。肝脏病理学结果：同种异基因移植组>同种同基因移植组>肝硬化组。

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引言

材料方法

设计：随机对照，动物体内实验观察。

时间及地点：实验于2011年12月至2012年10月在江苏大学基础医学与医学技术免疫学实验室完成。

材料：

实验动物：健康BALB/c小鼠104只，雌性，6周龄，体质量15-18 g。13.5 d 胎龄BALB/c孕鼠20只；13.5 d 胎龄C57BL/6孕鼠20只，由扬州大学比较医学实验动物中心提供。实验动物许可证号：SCXK(苏)2009- 0001，实验期间动物在标准房内饲养，自由饮食。实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

同种同基因与同种异基因胚胎肝干细胞移植治疗肝硬化实验所用主要试剂及仪器：

实验方法：

动物模型的建立：104只健康BALB/c小鼠随机分出20只作为正常对照，不予任何处理。剩余84只健康的雌性BALB/c小鼠腹腔注射新鲜配制的40%四氯化碳石蜡油溶液，剂量为1 mL/kg，2次/周(星期一，星期五)，连续16周。16周后造成肝硬化模型，存活72只，成模率86%(72/84)，72只雌性BALB/c小鼠肝硬化模型随机分为3组：肝硬化组(24只)，同种同基因移植组(24只)，同种异基因移植组(24只)。

小鼠胚胎肝干细胞悬液的制备：

同种同基因(BALB/c)胚胎肝干细胞悬液的分离纯化：取胎龄13.5 d的BALB/c孕鼠，颈椎脱臼法处死，体积分数为70%乙醇消毒后铺无菌孔巾，取下腹正中切口进腹，分离子宫各韧带后完整切除子宫，置于含4 ℃ PBS的无菌培养皿中。在超净工作台操作：剪开子宫，取出胚胎，剥离胎膜，4 ℃的PBS反复冲洗干净，精细分离胚胎前腹壁，完整取出胎肝^[16]，置于含4 ℃ PBS的无菌培养皿中清洗，漂洗3次后粗剪胎肝，剪成约 1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块，无菌吸管小心吸入30 mL离心管中，以体积比为1∶2加入1%Ⅳ型胶原酶 37 ℃下消化40 min，加入DMEM培养液终止消化，经200目钢筛过滤后，4 ℃ 1 500 r/min离心5 min，弃上清，将分离的胎肝细胞悬液加入70%与40% Percoll液中，4 ℃ 1 000 r/min密度梯度离心5 min，取单个核细胞层细胞，PBS洗2次，DMEM培养液沉淀重悬细胞，镜下细胞计数，调整细胞悬液浓度为1×10¹⁰ L^-¹。

同法制备同种异基因(C57BL/6)胚胎肝干细胞悬液。镜下细胞计数，调整细胞悬液浓度为1×10¹⁰ L^-¹。

小鼠胚胎肝干细胞鉴定：①倒置显微镜下细胞形态学观察：刚分离的细胞，呈圆形或椭圆形、透亮、有光泽。②流式细胞仪检测胚胎肝干细胞表面分子的表达^[17-19]，取刚分离纯化的原代同基因(BALB/c小鼠)胚胎肝干细胞以及异基因(C57BL/6)胚胎肝干细胞，PBS 洗3次，4 ℃1 500 r/min离心5 min，40 g/L多聚甲醛固定 15 min，PBS洗涤细胞、4 ℃ 1 000 r/min离心5 min，重复 3 次。细胞平均分到标记A，B，C，D，E的5支Eppendorf管中，每管细胞1×10⁶个。B，C，D，E管分别依次加入CFSE标记的甲胎蛋白抗体、CFSE标记的白蛋白抗体、FITC标记的C-met抗体、FITC标记的角蛋白19抗体；A管对照，加入PBS以代替抗体。4 ℃下，2 h后充分洗涤、离心，PBS重悬细胞，流式细胞仪检测甲胎蛋白、白蛋白、C-met及角蛋白19阳性细胞的比例。经检测细胞高表达甲胎蛋白、C-met及角蛋白19，低表达白蛋白。证实分离的细胞是胚胎肝干细胞，其纯度在80%左右。

胚胎肝干细胞移植：①同种同基因移植组(24只)：BALB/c胚胎肝干细胞移植，每只实验鼠用微量注射器经尾静脉移植BALB/c小鼠胚胎肝干细胞悬液0.2 mL (1×10¹⁰ L^-¹)。②同种异基因移植组(24只)：C57BL/6小鼠胚胎肝干细胞移植，每只实验鼠用微量注射器经尾静脉移植C57BL/6胚胎肝干细胞悬液0. 2 mL(1×10¹⁰ L^-¹)。③肝硬化组(24只)：移植等量的生理盐水。④正常对照组(20只)：不予任何处理。

主要观察指标：①一般生存状况及最终小鼠存活率。②肝功能及肝纤维化指标测定：于移植后1 d，3 d，7 d，2周，4周从小鼠眼球静脉采血，分离血清，测定肝功能指标：血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)等；血清肝纤维化指标：血清Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)、层粘连蛋白(LN)、血清透明质酸(HA)。③免疫学检查：于移植后第4周流式细胞仪检测脾、肝门淋巴结内的免疫细胞亚群CD3⁺T、CD4⁺T、CD8⁺T、NK、NKT等的比例及绝对数。所有操作均严格按照试剂盒说明书要求进行，由流式细胞仪专业技术人员检测。④肝脏病理组织学检查：于移植后第4周，断颈处死小鼠，取新鲜小鼠肝组织， 40 g/L多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，制成 5 μm厚的连续切片，苏木精-伊红染色，光镜观察。

统计学分析：用SPSS 16.0软件作统计学分析，数据资料以x(_)±s表示，存活率的比较用Fisher确切概率法计算，各组血清学检测结果采用完全随机设计资料的方差分析法。

讨论

肝硬化是各种慢性肝病发展的晚期阶段。病理上以肝脏弥漫性纤维化，再生结节，假小叶形成为特征。晚期以肝功能减退和门静脉高压为主要临床表现，常出现多种并发症，肝硬化是中国常见疾病和主要死亡病因之一^[20]。

目前，国际上虽对胚胎肝干细胞的研究取得进步，但对其生物学特性、体外诱导分化及其应用于肝硬化治疗等方面的研究仍不够充分^[21-24]，尤其胚胎肝干细胞移植免疫相关研究较少。本实验认为通过腹腔注射40%四氯化碳石蜡油溶液16周建立小鼠肝硬化模型^[25-27]，操作简单，费用低廉，效果明显，为研究胚胎肝干细胞移植提供了良好的动物模型。

实验采用胶原酶消化法和密度梯度离心法分离纯化同基因与异基因胚胎肝干细胞，分别经尾静脉途径移植入小鼠肝硬化模型体内，通过观察小鼠一般生存情况、生存率、肝功能，肝脏病理学及免疫学变化等，判断同基因与异基因胚胎肝干细胞移植对小鼠肝硬化有一定的治疗作用，为临床肝硬化的治疗提供实验理论依据。实验结果表明，未治疗的肝硬化组实验小鼠一般生活状况较差，存活率为67%，两移植组存活率均为100%，证实同基因与异基因胚胎肝干细胞移植后，可以改善肝功能，减轻肝纤维化，降低了动物死亡率^[28-29]。肝硬化组由于去除损伤因素，肝脏表现出强大的代偿和自我修复能力^[30]，4周后肝硬化组小鼠肝功能、肝纤维化指标恢复接近正常水平，与两移植组比较无明显差异。同种同基因与同种异基因胚胎肝干细胞移植对小鼠肝硬化均有治疗作用，并且未产生肿瘤组织或畸胎瘤^[31]；同种异基因胚胎肝干细胞移植优于同种同基因胚胎肝干细胞移植，其机制待进一步研究。

细胞移植免疫排斥反应依赖于供、受体间组织相容性抗原匹配程度，参与细胞移植免疫排斥反应主要有B细胞和T细胞，其他各种非特异性细胞群有NK和巨噬细胞等。①体液免疫应答IgM、IgG是发挥免疫功能最主要的免疫分子，在移植后短期内即可出现IgM、IgG抗体。②T细胞介导的细胞免疫^[32-35]，包括由CD4⁺T、CD8⁺T细胞介导的免疫应答，其中，CD4⁺T细胞直接对异基因MHCⅡ类分子起反应；CD8⁺T细胞主要对异基因MHCⅠ类分子起反应。同种异基因移植排斥反应主要是由T细胞介导的针对移植细胞表面同种异型抗原的免疫应答。其效应机制包括：①同种异型应答的CD4⁺T细胞活化，通过迟发型超敏反应引发免疫排斥反应。②同种异型应答的CD8⁺T细胞直接杀伤溶解移植细胞。③抗同种异型抗原抗体与相应抗原形成复合物，激活补体系统，损伤移植细胞。由于FLSPCs不表达 MHCⅡ类分子，不表达或低表达 MHCⅠ类分子，具有较弱免疫原性^[36-37]，为同种异体移植的免疫逃避提供了理论基础。实验表明同种同基因胚胎肝干细胞移植可以抑制T淋巴细胞的增殖从而导致免疫耐受，不激活异基因活化的T淋巴细胞，对异基因T细胞增殖的抑制作用不依赖于MHC，可以通过作用于其他的免疫细胞的方式发挥免疫调节作用。不仅同种同基因移植不存在免疫排斥问题，即使是同种异基因移植也能长期存活并发挥正常的生物学功能，无明显的免疫排斥反应发生。该特性克服了肝移植所带来的免疫排斥的缺点，胚胎肝干细胞移植产生免疫排斥反应极其轻微，可望成为活体肝移植最佳替代途径。

胚胎肝干细胞移植具有损伤小、技术简单，异体移植产生排斥反应小，对受体影响不大等优点，能直接修复受损伤肝脏，有利于肝硬化组织结构的重建及功能的恢复，具有极大的科研和临床价值。但是人类胚胎肝干细胞移植仍面临来源、体外诱导分化等诸多方面的问题^[38-41]，不论是其实验研究还是临床研究，胚胎肝干细胞移植能否应用于临床治疗人类肝脏疾病，皆有待于近一步研究和探索。

同基因与异基因胚胎肝干细胞移植治疗小鼠肝硬化

Syngeneic and allogeneic fetal liver stem cell transplantation in the treatment of mouse hepatic cirrhosis

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