无血清培养促进脂肪干细胞向血管内皮细胞分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.36.010

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (36): 6443-6448.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.36.010

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无血清培养促进脂肪干细胞向血管内皮细胞分化

郭峘杉，颜玲

中山大学附属第三医院整形外科，广东省广州市 510630

收稿日期:2013-04-27 修回日期:2013-06-18 出版日期:2013-09-03 发布日期:2013-09-03
通讯作者: 颜玲，博士，主任医师，硕士生导师，中山大学附属第三医院整形外科，广东省广州市 510630 ling0518@163.com
作者简介:郭峘杉★，女，1986年生，陕西省西安市人，汉族，中山大学附属第三医院整形外科在读硕士，主要从事脂肪干细胞在创面修复方面的应用研究。 guohshan@126.com
基金资助:
广东省科技计划项目(2009B060700025)*

Serum-free culture promotes rat adipose-derived stem cells differentiating into endothelial cells

Guo Huan-shan, Yan Ling

Department of Plastic Surgery, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China

Received:2013-04-27 Revised:2013-06-18 Online:2013-09-03 Published:2013-09-03
Contact: Yan Ling, M.D., Master’s supervisor, Chief physician, Department of Plastic Surgery, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China ling0518@163.com
About author:Guo Huan-shan★, Studying for master’s degree, Department of Plastic Surgery, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China guohshan@126.com
Supported by:
the Science and Technology Project of Guangdong Province, No. 2009B060700025*

摘要/Abstract

摘要：

背景：无血清培养对大鼠脂肪干细胞向血管内皮细胞诱导分化影响的报道甚少。
目的：观察无血清培养大鼠脂肪干细胞后向血管内皮细胞诱导分化的情况。
方法：采用酶消贴壁培养法获得雄性SD大鼠脂肪干细胞，传代培养至第3代。实验组细胞无血清培养24 h，对照组用含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM完全培养基培养。然后应用血管内皮细胞诱导培养基培养3周。
结果与结论：大鼠脂肪干细胞经体外培养可呈多角形或梭形贴壁生长，并能稳定传代。传代后大鼠脂肪干细胞极低表达细胞表面标志CD31。大鼠脂肪干细胞定向血管内皮细胞诱导分化后细胞呈鹅卵石样，CD31阳性表达明显上升且实验组明显高于对照组。实验组诱导后大鼠脂肪干细胞能够吞噬Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白及在基质胶上形成2D小管样结构，其能力明显强于对照组。结果证实无血清培养可促进体外大鼠脂肪干细胞向血管内皮细胞诱导分化。

关键词: 干细胞, 脂细胞, 内皮生长因子, 培养基, 无血清

Abstract:

BACKGROUND: There are few reports about the effect of serum-free culture on the differentiation of rat adipose-derived stem cells into vascular endothelial cells.
OBJECTIVE: To investigate the isolation, serum-free culture of rat adipose-derived stem cells differentiating into vascular endothelial cells.
METHODS: The rat adipose-derived stem cells were isolated from male Sprague-Dawley rats and expanded to the third passage by enzymatic digestion-adherent explants method. In the experimental group, rat adipose-derived stem cells were cultured in serum-free medium for 24 hours. In the control group, rat adipose-derived stem cells were cultured in low-glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium containing 10% fetal bovine serum. After that, the cells were cultured in inducing medium for 3 weeks to differentiate into vascular endothelial cells.
RESULTS AND CONCLUSION: The rat adipose-derived stem cells grew as polygonal or fusiform-shaped adherent cells when cultured in vitro, which could stably proliferate and passage. The rat adipose-derived stem cells showed very low expression of CD31, a cell surface marker, after passages. After directional differentiations into vascular endothelial cells, the cells were pebble-shaped under the inverted microscope. Expression of CD31 was up-regulated, which was much higher in the experimental group than the control group. The induced cells in the experimental group had stronger abilities than those in the control group to swallow Dil-labeled acetylated low-density lipoprotein and form tube-like structures on the matrigel after differentiation into vascular endothelial cells. So, rat adipose-derived stem cells could be highly successfully induced to differentiate into vascular endothelial cells in vitro after serum-free culture.

Key words: stem cells, adipocytes, endothelial growth factors, culture media, serum-free

中图分类号:

R394.2

郭峘杉，颜玲. 无血清培养促进脂肪干细胞向血管内皮细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(36): 6443-6448.

Guo Huan-shan, Yan Ling. Serum-free culture promotes rat adipose-derived stem cells differentiating into endothelial cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(36): 6443-6448.

图/表（结果） 4

2.1 大鼠脂肪干细胞的体外培养 体质量100-120 g的SD雄性大鼠腹膜后脂肪、附睾脂肪、肠道附着脂肪共能有效取材20-30 mL，经充分消化后接种于25T细胞培养瓶内，接种浓度约1×10⁸ L^-1。原代分离的大鼠脂肪干细胞大部分可在24 h完成细胞贴壁，但细胞伸展性欠佳，多呈小圆形、晕状，伸展较快的细胞体积较大；经过48 h贴壁培养后，可见多个克隆形成，细胞逐渐伸展、汇合成片状；五六天细胞可生长汇合至80%-90%，细胞形态以三角形、短梭形多见，细胞核椭圆形，较大，有时可见双核。细胞密集生长后可见旋涡状形成。生长状态良好的大鼠脂肪干细胞传代细胞增殖速度较快，约三四天可生长汇合至90%。传代后的大鼠脂肪干细胞仍旧能保持较好的细胞形态及折光性，细胞大小相似、生长均匀，形态更趋于短梭形，核仁清晰，细胞质内杂质较少，旋涡状分布更加明显，见图1。

检测纯化后第3代大鼠脂肪干细胞表面标志物CD31、CD34、CD45、CD90、CD105的表达情况。结果显示传代后的大鼠脂肪干细胞低表达CD31(1.4± 0.3)%、CD34(1.97±0.04)%、CD45(2.07±0.03)%，高表达CD90(89.5±2.6)%、CD105(86.5±0.47)%。

2.3 大鼠脂肪干细胞成血管内皮细胞诱导后的形态 实验组经内皮细胞诱导液诱导后6 d，部分大鼠脂肪干细胞形态发生改变，细胞由多角短梭形变为卵圆形，逐渐形成在短梭形细胞中散在铺路石、鹅卵石样细胞聚集区，细胞质饱满，细胞核大而清晰，形态类似血管内皮细胞，见图3。

2.4 大鼠脂肪干细胞成血管内皮细胞诱导后表面标志CD31的表达情况 见图4。

经诱导后大鼠脂肪干细胞 CD31表达明显上升，实验组(55.54±0.06)%明显高于对照组(9.31± 0.02)%(P < 0.05)，提示大鼠脂肪干细胞可以向血管内皮细胞诱导分化，且经过无血清培养后诱导效率提升更加明显。

2.5 大鼠脂肪干细胞成血管内皮细胞诱导后吞噬Dil-Ac-LDL的能力 含Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL)的完全培养基培养，荧光显微镜下观察经诱导后大鼠脂肪干细胞部分细胞细胞质内存在红色荧光，表示其具有吞噬Dil-Ac-LDL的能力，见图5。

经体外Matrigel二维培养，显微镜下观察发现体外培养6 h，部分诱导的大鼠脂肪干细胞发出突起，随时间推移，突起逐步相互连接且形成较多的单层细胞相连的小管样结构，类似毛细血管样结构形成。

参考文献

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引言

材料方法

设计：细胞学体外观察。

时间及地点：实验于2011年6月至2012年6月在中山大学附属第三医院实验室完成。

材料：100-120 g雄性健康SD大鼠18只，鼠龄四五周，由中山大学中山医学院实验动物中心提供，许可证号SYXK(粤)2011-0112。实验过程中采用的动物实验操作程序符合2006年《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。

无血清培养大鼠脂肪干细胞所用主要试剂及仪器：

方法：

大鼠脂肪干细胞的分离、培养：采用酶消贴壁培养法获得雄性SD大鼠脂肪干细胞。将大鼠放入CO₂密闭箱内处死后浸泡于体积分数75%乙醇内20 min，然后移至动物外科解剖操作台，腹部向上，橡皮筋固定头部及四肢。沿腹部中线剪开皮肤及腹膜，曝露腹腔肠道及双侧附睾，仔细剥取肠道外附着脂肪、腹膜后脂肪及附睾脂肪，浸泡于含双抗的PBS中。迅速转入生物安全柜内，轻柔冲洗组织，更换PBS，反复漂洗，尽量除去漂浮脂滴及红细胞。缓慢吸去PBS，用无菌眼科剪将大鼠脂肪组织剪碎至糊状后移入15 mL离心管内，加入与脂肪量等体积I型胶原酶(工作浓度0.125%)，涡旋混合器充分震荡混匀，放入37 ℃水浴锅充分消化。每10 min取出涡旋混合器震荡1次，消化约30 min至离心管内容物混沌状。向15 mL离心管内加入与离心管内容物等体积L-DMEM完全培养基，震荡混匀，800×g离心10 min。去上清，L-DMEM完全培养基重悬15 mL离心管底沉淀，再次800×g离心10 min。5 mL L-DMEM完全培养基重悬 15 mL离心管底沉淀，巴氏吸管轻轻吹打吹散细胞，接种于25T细胞培养瓶中，旋紧瓶盖，做好标记，轻轻摇晃至细胞均匀分布，放入体积分数5%CO₂、37 ℃、饱和湿度培养箱中孵育。24 h后培养基半换液，继续培养箱中孵育。每天倒置相差显微镜下观察细胞生长状态及细胞密度，隔2 d完全换液1次。

大鼠脂肪干细胞传代：细胞长满至80%-90%时，吸去培养瓶内培养基，加入2 mL PBS轻柔清洗2次。向培养瓶内加入1 mL 0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)，液面充分覆盖培养瓶底细胞层，放入CO₂培养箱中消化20 s。迅速倒置相差显微镜下观察细胞形态变化，见细胞皱缩成小圆形，轻轻拍打培养瓶底可见细胞脱落，确定消化完全后加入3 mL L-DMEM完全培养基终止消化(注意差速消化纯化大鼠脂肪干细胞)。巴氏吸管轻柔吹打至单个细胞悬液，转入15 mL离心管中，120×g离心5 min。弃上清，加入新L-DMEM完全培养基重悬细胞沉淀，以1∶2比例接种培养。将培养瓶做好标记，每天倒置相差显微镜下观察细胞生长状态及细胞密度，隔2 d完全换液1次。传至第3代实验使用。

大鼠脂肪干细胞的表面标志鉴定：取第3代细胞长满至90%时，吸去培养瓶内培养基，清洗、消化后转入15 mL离心管中，120×g离心5 min。弃上清，加入PBS重悬细胞沉淀，轻柔吹散混匀细胞，计数，分装入1-6号BD流式细胞管，确保每管含细胞1×10⁵以上。分别将1 μL抗鼠CD31-FITC、抗鼠CD34-FITC、抗鼠CD45-FITC、抗鼠CD90-PE、抗鼠CD105-FITC(工作浓度1∶200，PBS稀释)加入1-5号BD流式细胞管，6号管加入1 μL PBS作空白对照。避光冰浴孵育30 min。向1-6号管内加入500 μL PBS洗掉未结合抗体，120×g离心5 min，去上清。向1-6号管内加入2 mL PBS重悬细胞，吹打分散成单个细胞悬液。上机进行流式检测。

大鼠脂肪干细胞无血清培养：将第3代大鼠脂肪干细胞分为实验组及对照组，实验组予无血清培养基(100%L-DMEM)培养24 h，对照组继续L-DMEM完全培养基(90%L-DMEM+体积分数10%FBS)培养。

大鼠脂肪干细胞的成血管内皮细胞诱导：将无血清培养的实验组及未做特殊处理的对照组细胞消化计数，吹打分散成单个细胞悬液后接种于12孔板，注意细胞均匀分布于孔底，保证每孔细胞浓度在1×10⁵以上。培养孔内加入1 mL血管内皮细胞诱导培养基(90%L-DMEM+体积分数10% FBS+50 μg/L血管内皮生长因子₁₆₅+10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子)，放入细胞培养箱中培养。隔1 d换液1次，诱导培养3周。每日倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。

大鼠脂肪干细胞成血管内皮细胞诱导后的鉴定：①倒置相差显微镜下观察经诱导后大鼠脂肪干细胞的形态。②鉴定诱导后大鼠脂肪干细胞表面标志CD31表达情况，方法同上述大鼠脂肪干细胞表面标志流式鉴定，对比实验组与对照组细胞CD31表达情况。③将经诱导后大鼠脂肪干细胞以1×10⁴/孔的浓度均匀铺于96孔板，完全培养基(90%L-DMEM+10%FBS)培养，至细胞铺满孔80%以上，更换含Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL，10 mg/L)的完全培养基，体积分数5% CO₂、37 ℃、饱和湿度培养箱中孵育6 h，于荧光显微镜下观察，红色荧光表示吞噬了Dil-Ac-LDL的细胞。④将Matrigel置于冰上融化后包被96孔板(50μL/孔)，将经诱导后大鼠脂肪干细胞以1×10⁴/孔的浓度均匀铺于包被孔上，体积分数5%CO₂、37 ℃、饱和湿度培养箱中孵育12 h，观察成小管样结构情况。

主要观察指标：①成血管内皮细胞诱导前后大鼠脂肪干细胞的CD31的表达。②大鼠脂肪干细胞细胞形态及成血管内皮细胞诱导后细胞形态。③成血管内皮细胞诱导后，实验组细胞吞噬Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL)及在基质胶上形成2D小管样结构的能力。

统计学分析：应用SPSS统计分析软件，符合正态分布的数据采用x(_)±s表示，数据采用2组样本t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

自2001年Zuk等^[5]从脂肪组织中分离得到脂肪干细胞起，脂肪干细胞就因其取材方便、来源丰富、性能稳定、易于培养等多种优点逐渐引起学者们的关注。Strem等^[6]研究发现，脂肪干细胞约占脂肪组织的2%；脂肪组织中脂肪干细胞的浓度是骨髓中骨髓间充质干细胞的100-300倍^[7]。与骨髓间充质干细胞相比，脂肪干细胞同样具有多向分化、低免疫原性等特点，已证实脂肪干细胞可分化为脂肪细胞^[8]、软骨细胞^[9]、骨细胞^[10]、神经细胞^[11]、肝细胞^[12]、平滑肌细胞^[13]、内皮细胞^[14]、心肌细胞等^[15]；且脂肪干细胞在分化的过程中自身可分泌大量的生长因子、细胞因子及其他活性蛋白酶，如血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、血管生成素、肿瘤生长因子、胎盘凝血酶、蛋白酶等^[5,16-17]，均可促进新生血管的生成。同时，研究表明脂肪干细胞能够向脉管系统分化，并通过多种机制，促进血管的新生^[14]。因此脂肪干细胞在治疗缺血性病变可能具有良好效果。

2004年，Miranville等^[18]从人体脂肪组织中分离出一系列CD34⁺/CD31^-细胞，并且证明了在一定条件下这些细胞在体内或体外具有向内皮细胞诱导分化的潜能。Rehman等^[19]则认为，脂肪干细胞经体外培养分化为CD34^-/CD31^-的内皮细胞参与脉管管腔的形成，还可以分泌多种细胞因子、生长因子促进血管新生。还有学者将脂肪干细胞注入至下肢缺血模型的裸鼠体内，分化成血管内皮细胞^[20]。2008年Amos等^[21]利用免疫荧光标记脂肪干细胞，经体外培养、扩增后，注射至缺血模型的大鼠的肠系膜内，发现29%脂肪干细胞表达脉管系统的表型和特征性标志，新生血管密度较空白对照组明显增加。由此得出脂肪干细胞的多向分化潜能及多种细胞因子、生长因子分泌功能，可以用于缺血组织血管新生的细胞治疗。

尽管已有不少关于脂肪干细胞作为血管组织工程种子细胞向血管内皮细胞诱导分化的研究报道^[22]，但诱导效率较低。为寻求提高脂肪干细胞成血管内皮诱导效率、解决缺血性疾病的细胞移植治疗的丰富可靠的种子细胞来源问题，实验以大鼠脂肪干细胞为研究对象，探讨无血清培养对于大鼠脂肪干细胞在体外向血管内皮细胞定向诱导分化的影响及诱导分化后细胞形态功能的鉴定。

血管内皮生长因子是早期内皮细胞所表达的特异表型酪氨酸激酶受体KDR/Flk-1的重要配体，具有特异性促进内皮细胞分裂的功能，且KDR/Flk-1与血管内皮生长因子的结合后在诱导血管新生中有重要作用，所以血管内皮生长因子是血管系统胚胎发育及生长分化的重要生长因子^[23]；碱性成纤维细胞生长因子是血管内皮细胞分化成熟的重要调控因子之一，也在血管发生及生成方面扮演重要角色^[24]。Konno等^[21]研究发现血管内皮生长因子对于血管新生的影响存在浓度剂量依赖性，但当其作用浓度达到50 μg/L时继续增大血管内皮生长因子浓度对血管新生并无明显积极作用，如果联合使用血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子则可明显提高血管内皮生长因子促进血管新生的能力，且在碱性成纤维细胞生长因子10 μg/L时效用最明显。

考虑到慢性难愈性创面等缺血性疾病主要是血管微环境的改变，所以实验首先从细胞微环境中细胞因子及其浓度改变的角度出发，以富含血管内皮生长因子₁₆₅及碱性成纤维细胞生长因子的完全培养基作为大鼠脂肪干细胞向血管内皮细胞的诱导培养基，对大鼠脂肪干细胞进行体外诱导及分化；其次，实验采用实验组大鼠脂肪干细胞无血清培养24 h模拟慢性难愈性创面长期所处的低氧缺血环境，以期观察由此产生的对于大鼠脂肪干细胞向血管内皮诱导的影响。结果提示经无血清培养后的大鼠脂肪干细胞向血管内皮诱导效率明显提升，可能是由于低氧缺血等外部刺激可以激活大鼠脂肪干细胞膜上的酪氨酸激酶受体，促使细胞外信号调节激酶以及丝苏氨酸信号通道磷酸化，稳定低氧诱导因子，启动血管内皮生长因子调节通路，促进大鼠脂肪干细胞向血管内皮分化^[25]。另外低氧缺血状态更能促使大鼠脂肪干细胞分泌促血管生成及抗凋亡的生长因子，而血管内皮生长因子调节通路的启动也可以通过血管内皮生长因子受体调节大鼠脂肪干细胞的自分泌及旁分泌作用，同样起到促进大鼠脂肪干细胞向血管内皮分化的作用。

CD31为成熟血管内皮细胞相关抗原，CD34为早期血管内皮祖细胞相关抗原，CD45为造血干细胞特征抗原，CD90、CD105为多能间充质干细胞相关抗原。流式检测结果显示传代后的大鼠脂肪干细胞低表达CD31、CD34、CD45，高表达CD90、CD105，说明大鼠脂肪干细胞具备间充质干细胞的表面抗原特征，且取材、培养过程中几乎未受到造血干细胞和血管内皮细胞的污染。实验组及对照组大鼠脂肪干细胞经向血管内皮细胞诱导分化后CD31表达提高，提示大鼠脂肪干细胞可以向血管内皮细胞诱导分化，且经过无血清培养后诱导效率提升更加明显。Dil-Ac-LDL吞噬实验与Matrigel小管形成实验是检测血管内皮细胞功能的特异实验。镜下观察可见诱导后的实验组大鼠脂肪干细胞部分细胞可以吞噬Dil-Ac-LDL；同时通过体外Matrigel 2D培养6 h后，经诱导后的实验组大鼠脂肪干细胞可以发出突起，且随时间推移突起相互连接形成较多的单层细胞相连的小管样结构，类似毛细血管样结构，说明实验组大鼠脂肪干细胞向血管内皮细胞诱导后部分细胞已经具备成熟血管内皮细胞的功能。

脂肪干细胞本身具有多向分化及分泌多种细胞因子及生长因子功能，实验通过无血清培养提高大鼠脂肪干细胞向血管内皮细胞诱导效率，可以为解决缺血性疾病的细胞移植治疗的丰富可靠的种子细胞来源问题提供一种新的选择。可以认为高浓度血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及低血缺氧环境刺激在大鼠脂肪干细胞向血管内皮细胞分化的过程中起到了重要的调控、影响作用，但具体机制仍有待于进一步研究。

无血清培养促进脂肪干细胞向血管内皮细胞分化

Serum-free culture promotes rat adipose-derived stem cells differentiating into endothelial cells

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