储运条件对脐带间充质干细胞存活率的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.36.008

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (36): 6430-6435.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.36.008

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储运条件对脐带间充质干细胞存活率的影响

汪大琨¹，王芝辉²，郭红²，张乐玲³

¹山东大学齐鲁医院低温医学研究室，山东省济南市 250012；²山东齐鲁干细胞有限公司，山东省济南市 250004；³山东大学齐鲁儿童医院，山东省济南市 250022

收稿日期:2012-11-21 修回日期:2013-01-29 出版日期:2013-09-03 发布日期:2013-09-03
通讯作者: 张乐玲，硕士，主任医师，山大齐鲁儿童医院，山东省济南市 250022
作者简介:汪大琨，1986年生，山东省威海市人，汉族，2009年山东大学毕业，主要从事生物技术专业研究。 sagittariuswong@hotmail.com
基金资助:
山东大学自主创新基金(2012ZD023)*；山东省科技发展计划项目(2010G0020213)*

Effects of transportation conditions on survival rate of umbilical cord mesenchymal stem cells

Wang Da-kun¹, Wang Zhi-hui², Guo Hong², Zhang Le-ling³

¹Cryomedicine Lab, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, Shandong Province, China; ²Shangdong Qilu Stem Cells Co., Ltd., Jinan 250004, Shandong Province, China; ³Qilu Children’s Hospital, Shandong University, Jinan 250022, Shandong Province, China

Received:2012-11-21 Revised:2013-01-29 Online:2013-09-03 Published:2013-09-03
Contact: Zhang Le-ling, Master, Chief physician, Qilu Children’s Hospital, Shandong University, Jinan 250022, Shandong Province, China
About author:Wang Da-kun, Cryomedicine Lab, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, Shandong Province, China sagittariuswong@hotmail.com
Supported by:
the Autonomous Innovation Project of Shandong University, No. 2012ZD023*; the Shandong Provincial Technology Development Project, No. 2010G0020213*

摘要/Abstract

摘要：

背景：国内外尚无对脐带间充质干细胞运输过程中相关活力指标的全面评估。
目的：检测白蛋白和储运时间等不同条件对脐带间充质干细胞存活率的影响。
方法：体外培养的脐带间充质干细胞分为实验组和对照组，每组将3.15×10⁹ L^-1细胞悬浮在3 mL生理盐水中。其中实验组加入1%白蛋白并避光保存，对照组分为不加白蛋白避光保存组和加白蛋白光照保存组，在0，2，4，8和24 h分别测定各组细胞数、锥虫蓝拒染率和细胞存活率。
结果与结论：与对照组相比，实验组(保存液中加白蛋白且避光)的8 h细胞损失率几乎为零，细胞存活率接近90%。对照中不加白蛋白组8 h细胞损失率高达38.5%，细胞存活率为86%。在脐带间充质干细胞的长途运输中，加入1%白蛋白可以有效保证细胞存活量。运输时间超出8 h后，细胞损失率上升且存活率下调。实验数据表明，16 ℃、避光和1%白蛋白生理盐水的保存条件下，脐带间充质干细胞在8 h内符合临床输注要求。

关键词: 干细胞, 脐带, 间质干细胞, 血清白蛋白

Abstract:

BACKGROUND: General assessment of viability of umbilical cord mesenchymal stem cells during transport is not considered at home and abroad.
OBJECTIVE: To explore the effects of different transportation conditions such as albumin and transport time on survival rate of umbilical cord mesenchymal stem cells.
METHODS: Umbilical cord mesenchymal stem cells cultured in vitro were divided into experimental and control groups. Each of group contained 3.15×10⁹/L cells in 3 mL normal saline. The experimental group contained 1% albumin in dark environment. The control group included two subgroups: dark preservation group with the absence of albumin and light preservation group with the presence of albumin. Cell counting, trypan blue staining and cell survival rate were compared at 0, 2, 4, 8, and 24 hours.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, no cell loss was observed in experimental group (with the presence of albumin in the dark) and a 90% viability ratio was achieved at 8 hours. In the control group without albumin, loss rate reached 38.5% and survival rate reached 86% at 8 hours. Results revealed that 1% albumin predominantly improved cell survival rate in long-distance transport of umbilical cord mesenchymal stem cells. When transport time was more than 8 hours, cell loss rate increased and cell survival rate downregulated. Our experimental data demonstrated that umbilical cord mesenchymal stem cells preserved in normal saline consisting of 1% albumin placing in dark environment at 16 ℃ apply to clinical application criterion in 8 hours.

Key words: stem cells, umbilical cord, mesenchymal stem cells, serum albumin

中图分类号:

R394.2

汪大琨，王芝辉，郭红，张乐玲. 储运条件对脐带间充质干细胞存活率的影响[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(36): 6430-6435.

Wang Da-kun, Wang Zhi-hui, Guo Hong, Zhang Le-ling. Effects of transportation conditions on survival rate of umbilical cord mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(36): 6430-6435.

图/表（结果） 4

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引言

间充质干细胞可从多种成人组织(尤其是骨髓和脂肪组织)中分离得到，并具有向间质细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌腱细胞、神经细胞和脏层中胚层细胞分化的能力^[1-6]。体外培养时，间充质干细胞贴壁生长，同时高表达CD29、CD44、CD54、CD73、CD90、CD105，不表达造血细胞表面标记CD34或CD45^[2-6]。间充质干细胞能分泌多种细胞因子，并具有抗氧化应激和免疫调控能力，所以被广泛应用于退行性疾病^[7]_、损伤性疾病及自身免疫病等多种疾病的治疗中^[8-11]。

临床中常用骨髓间充质干细胞，但老人骨髓脂肪多，干细胞活性差，且取骨髓为损伤过程，而脐带间充质干细胞的优点为生长快，人类白细胞相关抗原表达低，不会引发严重的移植物抗宿主病，适用于异体移植，且有胎血屏障的存在，病毒污染率低，也可发挥因子分泌与免疫调控、抗氧化应激功能，所以逐渐取代骨髓间充质干细胞成为科学研究和临床应用的热点^[12-13]。

脐带间充质干细胞的原代培养有组织块贴壁法和酶消化分离法两种方法^[14-15]，且两种方法皆有成功获取脐带间充质干细胞的报道。其中，组织块贴壁法完全依赖于脐带组织中的细胞迁徙及贴壁，该方法收获的细胞数量较少，培养周期较长^[16]，但操作简单、稳定性高；酶消化分离法的原理是蛋白酶能够消化细胞基质，相比于组织块贴壁法，能够在一定程度上促进细胞游离、贴壁，进而缩短培养时间，但目前不同研究者采用的消化酶种类与作用时间有所差异，使得细胞分离效果的组间差异比较明显^[17-19]，无法从根本上形成一个规范的制备流程。为保证脐带间充质干细胞生长周期的一致性和操作处理的稳定性，实验采用组织块贴壁法培养原代脐带间充质干细胞。

移植的细胞质量直接影响治疗效果，虽然对间充质干细胞的制备和质控已有很多报道，但对于细胞运输条件(移植保存介质、保存温度、保存时间)对细胞质量的研究报道并不多见。实验首先用流式细胞仪测定脐带间充质干细胞表面标志性分子表达率，然后将脐带间充质干细胞悬浮于临床细胞治疗广泛应用的介质即生理盐水中，在细胞的适宜运输温度16 ℃环境中，分别研究了运输时间和运输条件对脐带间充质干细胞活力的影响，以期为细胞治疗的临床应用细节规范提供参考。

材料方法

设计：细胞水平的体外观察实验。

时间及地点：于2012年5至9月在山东大学齐鲁医院低温医学研究室完成。

材料：山东大学齐鲁医院妇产科足月正常分娩脐带(产妇及家属签订知情同意书)。

储运条件对脐带间充质干细胞存活率影响实验所需要试剂及仪器：

实验方法：

脐带间充质干细胞分离培养：脐带无菌条件下剪碎，常规贴壁培养法置于37 ℃、体积分数5%CO₂和100%湿度的培养箱中，培养基含10%FBS，2 mg/L表皮生长因子，2 mg/L 成纤维细胞生长因子，2 mg/L 血管内皮生长因子。培养5 d后全量换液并去除浮起的组织块，培养7 d时有可见细胞爬出，培养12 d后去除组织块，用2.5 g/L胰蛋白酶消化细胞并以5×10⁵/cm²的密度传代培养，常规瑞氏染色观察形态。

脐带间充质干细胞鉴定：取第5代细胞，用2.5 g/L胰蛋白酶消化收集，10⁶个细胞悬浮在100 μL的PBS中，分别加入下列鼠抗人单克隆抗体：FITC-CD34，FITC-CD45，PE-CD44，PE-CD90，PE-CD71和PE-CD105，避光孵育20 min，PBS清洗1次后去上清，用1 mL PBS重悬，使用CytomicsTMFC500流式细胞仪检测。

不同储运条件对细胞的影响：取第5代细胞，用2.5 g/L胰蛋白酶消化收集，以1×10⁶个细胞悬浮在生理盐水中，并分为3组。①加白蛋白避光组置于暗盒中，含白蛋白(终浓度为1%)。②不加白蛋白避光组置于暗盒中，不含白蛋白。③加白蛋白光照组普通室内灯光照射，含白蛋白(终浓度为1%)。分别放置0，2，4，8和24 h，然后使用Muse^TM Count&viability Kit试剂盒在Muse^TM Cell Analyzer仪器上进行细胞数量和细胞活性的检测，并通过细胞计数计算出细胞损失率，计算公式为：

主要观察指标：①脐带组织块贴壁法原代细胞的形态。②流式细胞仪检测脐带间充质干细胞表面标志性分子抗原。③用传统的锥虫蓝染色对不同时间段细胞拒染率的变化进行统计。④用Muse^TM Count&viability Kit试剂盒在Muse^TM Cell Analyzer仪器上检测不同时间段细胞数量和细胞活性的变化。

统计学分析：数据以x(_)±s显示，组间比较通过SPSS 17.0软件进行Student’s t-检验。其中P < 0.05被认为组间差异有显著性意义。

讨论

脐带间充质干细胞被证明符合国际细胞治疗学会(ISCT)关于间充质干细胞的鉴定标准^[20]，在合适的体外培养条件下可分化成为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞、骨骼肌细胞等^[21-25]，且被广泛的研究证实具有广阔的临床应用前景。间充质干细胞在临床应用前，必然要脱离正常的生长环境保存于美国食品药物管理局(FDA)批准的可被直接输注于人体的移植介质中，然后完成后续应用流程。此外间充质干细胞在外科手术中的应用往往需要迎合较长的手术时间，这同样会延长间充质干细胞在介质中的保存时间。尽管细胞冻存是一项成熟的细胞保存方法^[20^，^26]，但其细胞复活率低、活性差且冷冻保护剂对细胞和人体有害，同时操作繁琐并对操作环境有较高的要求，并不适用于间充质干细胞的短期(0-24 h)常温保存。在细胞输注介质的选择方面，不同的研究小组采用不同的运输介质^[27-31]。

实验采用目前临床常用的间充质干细胞运输介质为生理盐水^[7]，具有获取容易、操作简单、临床认可度高的优点，经pH仪测定pH值为6.85(16 ℃测定)，接近细胞生长的pH环境，常用的运输温度为12-18 ℃(本实验选用16 ℃)，为白细胞的最适宜保存温度。从新陈代谢来讲，这个温度范围既能保证细胞正常生理行为，又不至于细胞代谢过于旺盛而过早衰亡。Pal等^[32]报道认为5%的葡萄糖溶液是短期内维持间充质干细胞活性的最佳介质，但是同样有研究指出，高糖环境可影响间充质干细胞生物学特性，引发细胞增殖力减弱及细胞衰老^[33-35]。Mohyeddin-Bonab等^[28]报道在保存介质中加入1%白蛋白能够有效提高细胞的生存率。这一点在实验中也得到了验证：白蛋白组的细胞活性要明显高于对照组。这可能与白蛋白溶液作为缓冲剂为细胞提供一个更温和的保存环境相关。

锥虫蓝染色法属染色排除法，是细胞学实验中常用的判断细胞活性的技术，其原理是健康的正常细胞能够排斥锥虫蓝，而死亡的细胞，膜完整性丧失、通透性增加，可被锥虫蓝染成蓝色。但细胞膜破损后会产生大量的无核细胞碎片，增加了镜下判断的难度。为了更精确地判定细胞的活力，作者使用了Millipore公司的Muse^TM Cell Analyzer细胞仪和Muse^TM Count&Viability Kit试剂，该试剂盒的原理是细胞死亡或接近死亡时，膜完整性被破坏，试剂可以进入细胞内与胞核DNA结合，在535 nm光激发下呈现阳性信号，具有结果稳定、灵敏度高且能排除细胞碎片干扰的优点。在实验中，避光不加白蛋白组24 h的锥虫蓝拒染率与Muse^TM Count&Viability Kit结果相差近10个百分点，证明无核的细胞碎片能够一定程度上干扰锥虫蓝拒染实验结果。理论上避光保存的效果会优于曝光保存，因为光照环境下，细胞会产生更多的氧化自由基，受到更严重的氧化应激损伤^[36]。从实验的加白蛋避光组和加白蛋白光照组结果来看，光照组和避光组的细胞在4 h之内，锥虫蓝拒染率和细胞活性差异无显著性意义；而在8 h和24 h时，光照组与避光组细胞活性的差异有显著性意义。考虑到正常的运输过程中，细胞多被放在特质的运输箱中保存，因而也就自然达到了避光的条件。

实验结果显示：加白蛋白避光组的细胞活力最好，细胞损失率最低，8 h存活率高于93%，损失率几乎为零；24 h存活率高于90%，损失率为25%左右。加白蛋白光照组8 h存活率高于90%，损失率几乎为零；24 h存活率高于88%，损失率接近50%。不加白蛋白避光组的细胞活力最差，细胞损失率最高，8h存活率86%，损失率接近40%；24 h存活率77%，损失率高达70%。

实验结果表明，介质中加入白蛋白并避光运输能够有效维持细胞活性。在16 ℃、避光和1%白蛋白的保存条件下，10⁹ L^-1密度的细胞在8 h内的存活率可达90%以上，符合FDA关于细胞移植时最低活性为70%的要求，这为脐带间充质干细胞的长途运输提供了可靠的数据支持。在细胞活性测定中，Cell Analyzer测定细胞存活率的方法要比传统的锥虫蓝染色更为敏感且更具说服力。在临床应用等级的细胞制备和运输流程中，探寻更优质的保存介质和检测条件十分必要，这也将有助于进一步规范现有的细胞治疗流程。

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