去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的体外成骨诱导

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.36.007

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (36): 6423-6429.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.36.007

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去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的体外成骨诱导

王云，鲍小明，侯永新，李军，张民

山西医科大学第二医院关节科，山西省太原市 030001

收稿日期:2013-01-07 修回日期:2013-02-19 出版日期:2013-09-03 发布日期:2013-09-03
通讯作者: 张民，博士，副教授，山西医科大学第二医院关节科，山西省太原市 030001 zhangminty@yahoo.com.cn
作者简介:王云★，男，1985年生，山西省长治市人，汉族，山西医科大学第二医院关节科在读硕士。 wangyunff@163.com
基金资助:
山西省科技攻关项目(20100311098-2)*

In vitro osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells from ovariectomied osteoporotic rats

Wang Yun, Bao Xiao-ming, Hou Yong-xin, Li Jun, Zhang Min

Department of Orthopedics, the Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China

Received:2013-01-07 Revised:2013-02-19 Online:2013-09-03 Published:2013-09-03
Contact: Zhang Min, M.D., Associate professor, Department of Orthopedics, the Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China zhangminty@yahoo.com.cn
About author:Wang Yun★, Studying for master’s degree, Department of Orthopedics, the Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China wangyunff@163.com
Supported by:
Key Science and Technology Project of Shanxi Province, No. 20100311098-2*

摘要/Abstract

摘要：

背景：细胞学研究表明，骨髓间充质干细胞在绝经后骨质疏松症的发病过程中起有重要作用。
目的：观察去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的体外成骨分化。
方法：将6月龄雌性SD大鼠双侧卵巢切除建立骨质疏松模型。实验分为4组：正常干细胞组、骨质疏松干细胞组、正常干细胞成骨诱导组、骨质疏松干细胞成骨诱导组。全骨髓贴壁法培养正常和骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞至第3代细胞用于实验。倒置相差显微镜观察细胞形态，流式细胞仪测定细胞周期、增殖指数。加成骨诱导液进行成骨诱导，检测各组骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性，茜素红染色法比较各组钙结节的形成。
结果与结论：正常干细胞成骨诱导组、骨质疏松干细胞成骨诱导组均具有成骨细胞的形态特征，但骨质疏松干细胞成骨诱导组形态变化相对缓慢。正常干细胞组细胞增殖指数高于骨质疏松干细胞组(P < 0.05)；成骨诱导组碱性磷酸酶活性均明显高于相应的正常或骨质疏松干细胞组(P < 0.05)；正常干细胞成骨诱导组明显高于骨质疏松干细胞成骨诱导组(P < 0.05)。成骨诱导组茜素红染色均呈阳性，相应的正常或骨质疏松干细胞组呈阴性；且正常干细胞成骨诱导组染色强于骨质疏松干细胞成骨诱导组。提示去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的增殖能力和成骨分化能力明显降低，可能与去卵巢大鼠骨质疏松的发生相关。

关键词: 干细胞, 间质干细胞, 骨质疏松, 卵巢切除术, 碱性磷酸酶

Abstract:

BACKGROUND: Cytological studies show that bone marrow mesenchymal stem cells play an important role in postmenopausal osteoporosis mechanism.
OBJECTIVE: To study the osteogenic differentiation in vitro of bone marrow mesenchymal stem cells from ovariectomied osteoporotic rats.
METHODS: The osteoporotic animal model was established by performing ovariectomy in the 6-month-old female Sprague-Dawley rats. There were four groups: bone marrow mesenchymal stem cells control group, bone marrow mesenchymal stem cells osteoporosis group, bone marrow mesenchymal stem cells osteogenic induction group and oseogenesis induction group. Bone marrow mesenchymal stem cells were isolated from the rats of control group and oseogenesis induction group by means of the whole bone marrow adherence method and cultured to the 3rd generation. Then the bone marrow mesenchymal stem cells were used in all the experiments. Cell morphology was observed under the inverted phase contrast microscope, cell cycle and proliferation index of bone marrow mesenchymal stem cells were detected by flow cytometry. After osteogenic induction, the expression level of alkaline phosphatase was detected, and the fornation of calcium nodes of bone marrow mesenchymal stem cells were marked by alizarin red staining.
RESULTS AND CONCLUSION: The cells in the osteogenic induction group and oseogenesis induction group had the morphology of osteobalsts, and the change of morphology of the cells in the oseogenesis induction group was relatively tardiness. The proliferation index in the control group was higher than that in the osteoporosis group (P < 0.05); expression level of alkaline phosphatase in the osteogenic induction group was significantly higher than that in the oseogenesis induction group (P < 0. 05), and the control group was significantly higher than the oseogenesis group (P < 0.05). The alizarin red staining of the cells in the osteogenic induction group was positive, while negative in the control group and the oseogenesis group; the staining in the osteogenic induction group was stronger than that in the oseogenesis induction group. These findings indicate that both the proliferative potential and the osteogenic potential of bone marrow mesenchymal stem cells from the ovariectomized osteoporotic rats are decreased, which may be related with the ostoeporosis pathogensis of ovariectomied rats.

Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, osteoporosis, ovariectomy, alkaline phosphatase

中图分类号:

R394.2

王云，鲍小明，侯永新，李军，张民. 去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的体外成骨诱导[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(36): 6423-6429.

Wang Yun, Bao Xiao-ming, Hou Yong-xin, Li Jun, Zhang Min. In vitro osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells from ovariectomied osteoporotic rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(36): 6423-6429.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析 实验选用大鼠40只，分为4组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。 2.2 骨髓间充质干细胞(成骨诱导后)形态学观察 正常干细胞组和骨质疏松干细胞组的骨髓间充质干细胞经培养、传代后，细胞状态逐渐稳定，两组的细胞形态均呈梭形，无明显差异，见图1，2。正常干细胞成骨诱导组和骨质疏松干细胞成骨诱导组的骨髓间充质干细胞在加入成骨诱导液后形态开始改变，逐渐由梭形转变为圆形、立方形。其中，正常干细胞成骨诱导组骨髓间充质干细胞的细胞形态在诱导后6 d明显变为铺路石样外观；而骨质疏松干细胞成骨诱导组骨髓间充质干细胞在诱导6 d后，除立方形细胞外，仍存有部分梭形细胞，见图3，4。诱导8 d后，骨质疏松干细胞成骨诱导组细胞形态明显变为立方型、呈铺路石样外观，与正常干细胞成骨诱导组无明显差别。

2.3 正常及骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞增殖指数变化 正常干细胞组和骨质疏松干细胞组的细胞周期分布、增殖指数见表1。

由表1可见，正常干细胞组的骨髓间充质干细胞增殖指数值明显高于骨质疏松干细胞组，差异有显著性意义 (P < 0.05)，表明骨质疏松干细胞组的细胞增殖活性降低。

2.4 骨髓间充质干细胞成骨诱导后茜素红染色成骨诱导14 d后，茜素红对正常干细胞组、骨质疏松干细胞组及相应的正常干细胞成骨诱导组、骨质疏松干细胞成骨诱导组细胞进行染色。其中正常干细胞组、骨质疏松干细胞组的染色结果呈阴性，见图5，6。

2.5 各组骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶染色表达量变化 培养(或成骨诱导)后各组骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶表达量见表2。在培养的第7天(或成骨诱导的第7天)，正常干细胞组和骨质疏松干细胞组的碱性磷酸酶表达量差异无显著性意义(P > 0.05)。正常干细胞成骨诱导组和骨质疏松干细胞成骨诱导组碱性磷酸酶的表达量分别是相应正常干细胞组的3.22倍(P < 0.01)、骨质疏松干细胞组的2.07倍(P < 0.01)。正常干细胞成骨诱导组碱性磷酸酶表达量是骨质疏松干细胞成骨诱导组的1.53倍(P < 0.05)。在培养的第14天(成骨诱导的第14天)，正常干细胞组和骨质疏松干细胞组的碱性磷酸酶表达量差异无显著性意义(P > 0.05)。正常干细胞成骨诱导组和骨质疏松干细胞成骨诱导组碱性磷酸酶的表达量分别是相应正常干细胞组的4.25倍(P < 0.01)、骨质疏松干细胞组的2.84倍(P < 0.01)。正常干细胞成骨诱导组碱性磷酸酶表达量是骨质疏松干细胞成骨诱导组的1.78倍 (P < 0.05)。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2011年9月2012年2月在山西医科大学附属第二临床医院骨科实验室完成。

材料：

去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的体外成骨诱导实验所需要主要试剂及仪器：

实验动物：同批次健康清洁级未育6月龄雌性SD大鼠40只，体质量(300±30) g，由山西医科大学实验动物中心提供，依据2006年科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》对实验动物进行处理^[7]。

方法：

实验动物分组及去卵巢骨质疏松动物模型建立^[8]：将大鼠适应性喂养1周，之后随机分为4组：正常骨髓间充质干细胞组(正常干细胞组)、骨质疏松骨髓间充质干细胞组(骨质疏松干细胞组)、正常骨髓间充质干细胞成骨诱导组(正常干细胞成骨诱导组)、骨质疏松骨髓间充质干细胞成骨诱导组(骨质疏松干细胞成骨诱导组)。

正常干细胞组和正常干细胞成骨诱导组不作任何处理。骨质疏松干细胞组、骨质疏松干细胞成骨诱导组在无菌条件下，经腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉。麻醉成功后双侧腰背部术野剪毛、碘伏消毒、铺手术洞巾。手术切口位于腰背部肋下约1 cm、脊柱两侧约1 cm的交界处，手术切口长约1.5 cm，依次切开大鼠皮肤、皮下组织、肌肉以暴露腹腔，沿输卵管逆行确定卵巢位置后将其切除，结扎残端、依次缝合切口。建模后腹腔注射青霉素预防感染^[9]。所有动物均置于24- 28 ℃、湿度60%-80%、通风良好的相同条件下，饲养3个月后处死。

骨髓间充质干细胞的体外分离培养^[10]：建模后3个月将上述两组动物麻醉下颈椎脱臼处死，体积分数75%乙醇浸泡10 min后于无菌条件下分离双侧股骨，切除骨骺显露髓腔，用含体积分数15%胎牛血清的DMEM/F12培养液反复冲洗髓腔至变白为止，获取骨髓悬液。1 000 r/min离心(离心半径8 cm)骨髓悬液5 min，弃上清，加含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养液重新悬浮细胞并以1×10⁹ L^-¹浓度接种至25 cm²培养瓶，置于 37 ℃、体积分数5%CO₂的饱和湿度培养箱中培养。

第4天首次半量换液，7 d后全量换液，之后每3 d全量换液1次。待细胞融合至80%-90%时，用2.5 g/L胰蛋白酶消化细胞并按1∶2比例进行传代。每天用倒置相差显微镜观察细胞生长变化。取第3代(P3)细胞用于实验。实验细胞分为4组：正常干细胞组；骨质疏松干细胞组；正常干细胞成骨诱导组；骨质疏松干细胞成骨诱导组。

骨髓间充质干细胞的细胞周期分布与细胞增殖检测^[11]：正常干细胞组及骨质疏松干细胞组细胞融合达90%后， 2.5 g/L胰蛋白酶消化、收集细胞，PBS清洗细胞2次，对细胞进行计数并将其浓度调整至10⁹ L^-¹，加入碘化丙锭(50 mg/L)，室温避光孵育20 min，流式细胞仪和细胞周期分析软件检测分析细胞周期分布及细胞增殖活性。用增殖指数表示增殖活性。

骨髓间充质干细胞成骨诱导：取P3代骨髓间充质干细胞滴加于盖玻片上，接种至6孔板，细胞融合至80%时，每孔加成骨诱导液2 mL，每3 d换液1次，诱导14 d。

骨髓间充质干细胞成骨诱导后茜素红染色：成骨诱导14 d后，取出细胞爬片，PBS清洗2次，体积分数95%乙醇室温固定20 min、吹干，茜素红染液染色1.5 min，PBS清洗2次，倒置相差显微镜照相。

骨髓间充质干细胞成骨诱导后碱性磷酸酶活性检测^[12]：成骨诱导7 d(14 d)后，2.5 g/L胰蛋白酶消化、收集细胞，将细胞置于-70 ℃冰箱反复冻融2次(-70 ℃冷冻 30 min，37 ℃消融10 min)，以磷酸苯二钠为底物测定方法检测细胞碱性磷酸酶活性。

主要观察指标：①倒置显微镜观察成骨诱导后大鼠骨髓间充质干细胞形态学改变。②流式细胞仪测定正常干细胞组和骨质疏松干细胞组骨髓间充质干细胞的细胞周期、增殖指数。③茜素红染色法比较各组钙结节的形成。④碱性磷酸酶试剂盒测定各组碱性磷酸酶活性。

统计学方法：所有实验重复3次。所有参数进行多样本均数单因素方差分析，q检验进行组间两两比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

绝经后骨质疏松症以骨量丢失、骨微结构，导致骨脆性增加而易发骨折的一种骨代谢疾病^[13]，绝经后妇女的发病率较高^[14]。调查显示中国2003至2006年期间，>50岁女性人群中，其绝经后骨质疏松的发病率为20.7%，且发病率随年龄增加呈进一步上升趋势^[15]。绝经后骨质疏松不仅给患者带来痛苦，也给社会造成极大的医疗负担，已成为严重危害健康的公共卫生问题^[16]。很多学者研究发现，绝经后骨质疏松症的发生发展伴随着骨髓间充质干细胞生物学特性的变化^[17]。

骨髓间充质干细胞是广泛存在于骨髓组织和松质骨内的成体干细胞，具有成骨、成脂、成软骨等分化特点，是成骨细胞的前体细胞^[18]，对于维持骨吸收和骨形成的起着重要的调节作用^[19]；而绝经后骨质疏松症的发生正是由于患者骨组织形成与吸收失衡所导致的^[20]。Kretlow等^[21]认为，大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化能力与大鼠年龄、体内雌激素水平相关，大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化能力随年龄增加、雌激素水平下降而下降。Zhou等^[22]将10例17-90岁志愿者的骨髓间充质干细胞进行成骨诱导，发现年龄较大者骨髓间充质干细胞的成骨分化能力显著下降。Rodriguez等^[23]认为与健康志愿者相比，体外培养的绝经后骨质疏松妇女骨髓间充质干细胞对成骨分化的刺激敏感度和钙沉积程度均明显下降。因此，研究骨质疏松骨髓间充质干细胞的生物学特性对于骨质疏松症的诊疗有着重要意义。

绝经后骨质疏松症病程长、病因复杂，因此实验动物的选择对于绝经后骨质疏松症的研究起着重要的作用。只有选择合适的动物及造模方法，才能在实验动物身上对绝经后骨质疏松症的骨代谢过程进行模拟，为科研及临床工作提供切实有效的指标。除了能够较好地模拟绝经后骨质疏松的病理生理变化，所选实验动物还应具备良好的可重复性、较高的可行性以及合理的实验成本。

经过大量的相关研究发现，去卵巢大鼠模型是绝经后骨质疏松症较为理想的动物模型^[24]。大鼠寿命一般为2.5-3.0年，一般认为约18月龄后大鼠进入老年期，即进入与人类绝经后骨质疏松症发病相符的年龄段。由于将大鼠饲养至18月龄的实验成本过高，因此可将雌性大鼠的卵巢切除用以促进骨质疏松病理过程的发展^[25]。郑良朴等^[26]认为，从性激素水平与骨密度两方面考虑，6月龄雌性大鼠切除卵巢后体内雌激素和骨密度的下降较为明显，能够在短时间内良好地模拟绝经后骨质疏松症的病理变化，因此实验选择6月龄去卵巢大鼠用于实验。

实验将正常和去卵巢骨质疏松大鼠的骨髓间充质干细胞培养至第3代用于实验。利用流式细胞仪检测细胞周期可以发现，骨质疏松干细胞组的增殖指数值明显低于正常干细胞组，表明与正常干细胞组相比，骨质疏松干细胞组骨髓间充质干细胞的增殖能力明显下降。加入成骨诱导剂后，经倒置显微镜对骨髓间充质干细胞形态进行观察发现，成骨诱导后的骨质疏松干细胞成骨诱导组和正常干细胞成骨诱导组的细胞形态均逐渐变为成骨细胞所特有的铺路石样外观。但骨质疏松干细胞成骨诱导组骨髓间充质干细胞细胞形态改变较正常干细胞成骨诱导组缓慢，表明骨质疏松干细胞成骨诱导组骨髓间充质干细胞的成骨分化能力可能较正常干细胞成骨诱导组有所下降。

钙化结节是成骨细胞分泌的胶原在细胞外基质中结合钙盐而生成的^[27]，是鉴定细胞骨向分化的重要标志^[28]。在培养(诱导)14 d后，实验分别对正常干细胞组、骨质疏松干细胞组、正常干细胞成骨诱导组、骨质疏松干细胞成骨诱导组细胞进行茜素红染色。结果发现，成骨诱导各组均呈阳性，而相应骨髓间充质干细胞组则呈阴性；且正常干细胞成骨诱导组染色强于骨质疏松干细胞成骨诱导组，此结果同样表明骨质疏松干细胞成骨诱导组骨髓间充质干细胞的成骨分化能力可能较正常干细胞成骨诱导组有所下降。

能够合成、分泌成骨特异性蛋白是骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的另一重要标志，例如碱性磷酸酶、骨钙素等^[29]。其中，碱性磷酸酶是鉴定成骨分化的常用标志物^[30]。碱性磷酸酶又称为矿化相关蛋白，在1907年由Suzuki首先发现，是一类与矿物质形成紧密相关的蛋白质^[31]。在成骨细胞中，碱性磷酸酶由基质小泡释放至胞内，在胞内钙离子的作用下沉积于胶原上，促进细胞的钙化^[32]。因此，细胞内碱性磷酸酶的活性高低是判定成骨细胞功能及分化的重要指标，也是衡量成骨诱导成功与否的重要指标^[33]。研究表明，与正常女性骨髓间充质干细胞相比，绝经后骨质疏松女性患者的骨髓间充质干细胞经成骨诱导后，其碱性磷酸酶表达量明显降低，且其表达量具有一定的时间依赖性^[34]，所以实验分别测定了在7 d和14 d时碱性磷酸酶的表达量。

结果表明：7 d和14 d时，正常干细胞组和骨质疏松干细胞组的碱性磷酸酶的表达量无明显差别，但成骨诱导后的正常干细胞成骨诱导组和骨质疏松干细胞成骨诱导组碱性磷酸酶的表达量明显高于相应各骨髓间充质干细胞组，差异有显著性意义(P < 0.01)；而且，正常干细胞成骨诱导组碱性磷酸酶表达量明显高于骨质疏松干细胞成骨诱导组，差异有显著性意义(P < 0.05)，且诱导组碱性磷酸酶的表达量随时间延长呈升高趋势。碱性磷酸酶是骨髓间充质干细胞成骨分化的重要指标，成骨诱导后各组碱性磷酸酶的表达量明显高于各未诱导组，表明实验成功地对各组骨髓间充质干细胞进行了成骨诱导；诱导后骨质疏松干细胞成骨诱导组碱性磷酸酶表达量明显低于正常干细胞成骨诱导组，表明骨质疏松骨髓间充质干细胞成骨能力较正常骨髓间充质干细胞降低。

正常骨髓间充质干细胞能够向成骨、成软骨等不同细胞系分化并保持平衡^[35]，当骨髓间充质干细胞的分化能力改变时可能会导致疾病的发生^[36]。实验发现，去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化能力较正常骨髓间充质干细胞降低，提示骨髓间充质干细胞成骨分化能力的下降可能是影响绝经后骨质疏松发生和发展的一个重要的因素。

去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的体外成骨诱导

In vitro osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells from ovariectomied osteoporotic rats

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