血管内皮生长因子165转染骨髓间充质干细胞绿色荧光蛋白的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.36.001

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (36): 6381-6387.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.36.001

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血管内皮生长因子165转染骨髓间充质干细胞绿色荧光蛋白的表达

杨洋¹，黄政德¹，田雪飞¹，周德生²，李鑫辉¹，胡华²，杨艳红¹

¹ 湖南中医药大学中医内科学实验室，国家重点学科国家中医药管理局病理生理实验室湖南中医药大学中医诊断研究所，湖南省长沙市 410007；² 湖南中医药大学第一附属医院神经内科，湖南省长沙市 410007

收稿日期:2012-12-07 修回日期:2013-01-18 出版日期:2013-09-03 发布日期:2013-09-03
通讯作者: 黄政德，博士，教授，博士研究生导师，湖南中医药大学中医内科学实验室，国家重点学科国家中医药管理局病理生理实验室湖南中医药大学中医诊断研究所，湖南省长沙市 410007 Hzd112@136.com
作者简介:杨洋☆，男，1983年生，吉林省九台市人，满族，湖南中医药大学在读博士，医师，主要从事心血管疾病的中西医结合防治研究。 antonyyangoo1@126.com
基金资助:
国家自然科学基金资助(30973750)*：加味丹参饮对骨髓干细胞促IRI血瘀鼠心肌血管新生的影响及机制的研究；2012年湖南省研究生科研创新项目(CX2012B335)*

Green fluorescent protein expression in vascular endothelial growth factor 165 gene transfected bone marrow mesenchymal stem cells

Yang Yang¹, Huang Zheng-de¹, Tian Xue-fei¹, Zhou De-sheng², Li Xin-hui1, Hu Hua², Yang Yan-hong¹

¹Diagnostics Institute of Traditional Chinese Medicine, Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Laboratory of Pathophysiology, National Key Subjects of State Administration of Traditional Chinese Medicine, Laboratory of Key Laboratory of Chinese Internal Medicine, Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410007, Hunan Province, China; ²Department of Neurology, First Hospital of Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410007, Hunan Province, China

Received:2012-12-07 Revised:2013-01-18 Online:2013-09-03 Published:2013-09-03
Contact: Huang Zheng-de, M.D., Professor, Doctoral supervisor, Diagnostics Institute of Traditional Chinese Medicine, Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Laboratory of Pathophysiology, National Key Subjects of State Administration of Traditional Chinese Medicine, Laboratory of Key Laboratory of Chinese Internal Medicine, Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410007, Hunan Province, China Hzd112@136.com
About author:Yang Yang☆, Studying for doctorate, Physician, Diagnostics Institute of Traditional Chinese Medicine, Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Laboratory of Pathophysiology, National Key Subjects of State Administration of Traditional Chinese Medicine, Laboratory of Key Laboratory of Chinese Internal Medicine, Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410007, Hunan Province, China antonyyangoo1@126.com
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 30973750*; Hunan Provincial Innovation Foundation For Postgraduate in 2012, No. CX2012B335*

摘要/Abstract

摘要：

背景：血管内皮生长因子是一种有效的血管形成和通透性诱导因子，其中在体内以血管内皮生长因子165和血管内皮生长因子121表达为主，具有强烈的促血管新生作用。
目的：观察以血管内皮生长因子165基因转染骨髓间充质干细胞，继而分化为血管内皮细胞的可行性。
方法：分离提取50 g SD大鼠骨髓间充质干细胞，采用流式细胞仪鉴定，将携有血管内皮生长因子165基因的质粒pGLV-EF1a，采用慢病毒转染骨髓间充质干细胞，转染后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。
结果与结论：转染后12 h可见细胞内有绿色荧光蛋白表达，48 h 后表达增多，72 h后达到高峰，其后部分细胞荧光开始减退。结果证明血管内皮生长因子165基因转染骨髓间充质干细胞后，骨髓间充质干细胞内有绿色荧光蛋白表达，提示细胞转染成功，骨髓间充质干细胞定向分化为血管内皮细胞具有可行性。

关键词: 干细胞, 血管内皮生长因子类, 转染, 绿色荧光蛋白质类

Abstract:

BACKGROUND: Vascular endothelial growth factor is a potent angiogenesis and permeability inducible factor. Vascular endothelial growth factor 165 and vascular endothelial growth factor 121 are mainly expressed in vivo, with a strong role of angiogenesis.
OBJECTIVE: To observe the feasibility of vascular endothelial growth factor 165 gene transfected bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into vascular endothelial cells.
METHODS: Bone marrow derived mesenchymal stem cells were isolated and collected from 50 g Sprague-Dawley rats,and identified by flow cytometry. The plasmid pGLV-EF1a carrying a vascular endothelial growth factor 165 gene was transfected to the mesenchymal stem cells using lentiviral. Expression of green fluorescent protein was observed under a fluorescence microscope.
RESULTS AND CONCLUSION: After 12 hours of transfection, expression of green fluorescent protein was observed, increased at 48 hours, peaked at 72 hours and gradually declined thereafter. Results prove that vascular endothelial growth factor 165 gene transfected bone marrow mesenchymal stem cells have the expression of green fluorescent protein, indicating successful transfection. It is feasible to induce bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into vascular endothelial cells.

Key words: stem cells, vascular endothelial growth factors, transfection, green fluorescent proteins

中图分类号:

R394.2

杨洋，黄政德，田雪飞，周德生，李鑫辉，胡华，杨艳红. 血管内皮生长因子165转染骨髓间充质干细胞绿色荧光蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(36): 6381-6387.

Yang Yang, Huang Zheng-de, Tian Xue-fei, Zhou De-sheng, Li Xin-hui, Hu Hua, Yang Yan-hong. Green fluorescent protein expression in vascular endothelial growth factor 165 gene transfected bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(36): 6381-6387.

图/表（结果） 3

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引言

材料方法

设计：细胞学体外观察。

时间及地点：于2012年1至7月在湖南中医药大学中医内科学实验室及国家重点学科国家中医药管理局病理生理实验室湖南中医药大学中医诊断研究所完成。

材料：

实验动物：健康50 g SD大鼠幼鼠150只，雄性，由湖南中医药大学动物中心提供，动物许可证号：SCXK(湘)2009-0004，实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例

血管内皮生长因子165转染骨髓间充质干细胞绿色荧光蛋白实验的主要试剂及仪器：

实验方法：

血管内皮生长因子165全基因合成：引物合成，待合成的基因序列在网站http:// berry.engin.umich.edu/gene 2oligo/上进行

引物设计，送引物合成。引物按F、R依次编号1、2、3、4……。离心12 000 r/min，1 min，按nmol/A数值用灭菌双蒸水溶解引物至终浓度10 µmol/L。PCR扩增回收，将引物分组，进行PCR扩增拼接 PCR产物切胶回收，2.0%琼脂糖凝胶电泳，切取目的片断，加入回收试剂溶液A 3 000 µL/g，60 ℃水浴至胶完全溶化，加入50 µL回收试剂溶液B，混匀，将溶液置于离心柱中，静置5 min，12 000 r/min，1 min，弃液体，加入500 µL 体积分数80%乙醇，12 000 r/min，离心1 min，弃液体，重复1次，12 000 r/min，离心5 min，甩干余液，弃液体，晾干5-8 min，将离心柱置于新的离心管中，加入30 µL灭菌双蒸水，静置10 min，13 000 r/min，2 min离心，取2 µL进行琼脂糖凝胶电泳检测。连接转化，加A(Taq 0.5 µL，PCR回收产物4 µL，dNTPs 0.5 µL)，72 ℃，15 min将全基因连接到pEASY-T3载体上：连接条件：25 ℃，20 min，取连接产物加入到100 µL DH5α感受态细胞中，冰浴静置30 min 42 ℃，90 s，即刻冰浴2 min，加入800 µL LB培养基， 150 r/min，37 ℃培养1 h，离心4 000 r/min，3 min，吸弃800 µL上清，重悬细胞，涂于Amp+/ X-gal/IPTG LB培养板上，37 ℃培养过夜。

菌落PCR检测：挑取白斑单菌落，用载体引物进行PCR鉴定。

质粒提取：挑选PCR检测为阳性的菌落，按质粒提取试剂盒小量提取质粒。挑取阳性菌落，加入Amp+ LB液体培养液中，180 r/min 37 ℃培养过夜，收集菌液，1 200 r/min，1 min，弃上清，加入250 µL A液(含RNase A)，充分振荡混匀，室温放置2 min，加入250 µL B液，温和混匀，变清亮，室温放置2-5 min，加入350 µL C液，颠倒混匀，见白色絮状物室温放置2 min，1 200 r/min，10 min，将上清置于离心柱中，静置5 min，1 200 r/min，1 min，加入500 µL质粒提取试剂D液，1 200 r/min， 1 min，加入500 µL质粒提取试剂E液，1 200 r/min， 1 min，12 000 r/min，3 min，甩干余液，晾干5-10 min，将离心柱置于新的离心管中，加入30 µL F液，静置 5 min，12 000 r/min，离心3 min，管底即为质粒DNA，取2 µL电泳检测。

慢病毒滴度检测：第1天，铺板：293T 细胞，96-well，加入(0.5-1.0)×10⁴细胞/well，100 DMEM +体积分数10% FBS，37 ℃、体积分数5%CO₂过夜；第2天，10倍稀释病毒：稀释液DMEM +体积分数5%-10% FBS+ 终浓度5 mg/L Polybrene，将慢病毒(10-20 µL) 10倍稀释3-5个梯度；移去细胞培养液，加入Step2稀释后的病毒液0.1 mL，同时建立对照，37 ℃、体积分数5%CO₂过夜；第3天，移去细胞培养液，加入 100 µL DMEM+体积分数10%FBS，37 ℃、体积分数5%CO₂过夜；第4天，根据细胞状态和类型，如果必要分出1/3-1/5，加入100 µL DMEM+体积分数10% FBS，继续培养24 h；第5天，通过荧光显微镜或FACS计数荧光细胞，结合稀释倍数计算病毒滴度。

病毒滴度(BT=TU/mL，transducing units)计算公式：

骨髓间充质干细胞分离培养及鉴定：将50 g SD大鼠幼鼠用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，以颈椎脱臼法处死，浸泡在体积分数75%乙醇中10-15 min，取出后用无菌PBS冲洗鼠体至无乙醇，在超净台无菌条件下快速取出胫骨和股骨，剔除附壁周围组织，PBS反复冲洗。组织钳剪去胫骨和股骨两端的骨端，用5 mL无菌注射器抽吸DMEM液反复冲洗骨髓腔，以冲出骨髓入离心管，将冲洗液收集于离心管中，洗液以1∶1比例缓慢加入到Percoll液中，1 500 r/min，离心10 min，弃上清。用完全培养液重悬细胞，火焰抛光后吸管吹打至单细胞悬液后进行细胞计数。以1×10⁹ L^-¹细胞浓度接种于50 cm²培养瓶中，每瓶细胞悬液5 mL，在37 ℃、体积分数为5%的CO₂饱和湿度培养箱中常规培养。原代培养的细胞48 h后首次换液，以后每2 d换液1次，悬浮生长的造血细胞随换液被弃去，留下贴壁生长的骨髓间充质干细胞。每日于倒置显微镜下观察细胞的形态生长情况，10-12 d，当细胞在瓶底融合基本达到80%-90%时，经0.25%胰蛋白酶- 0.02%EDTA消化酶室温消化后收集细胞进行传代。按1∶2比例传代，接种到培养瓶培养，即为第1代(P1)；依此类推，传至第5代(P5)。

骨髓间充质干细胞鉴定：流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞表面抗原取P3代达到80%-90%融合、生长状态良好细胞，0.25%胰酶-0.02%EDTA消化酶消化后加L-DMEM完全培养液终止消化，火焰抛光吸管吹打至单细胞悬液；将FALCON管顺序编号(包括3个检测抗体和1个阴性对照共4管)，每管中分别加入FITC荧光标记的CD34-FITC单克隆抗体、CD45-FITC单克隆抗体、CD90-FITC单克隆抗体，各20 μL；对照组加PBS；再加入100 μL细胞混悬液，充分混匀，室温下(20-25 ℃)避光孵育15-30 min；加2 mL PBS，离心1 000 r/min，5 min，弃上清，以洗去未标记上的抗体；重复3次；每管再加入1 mL PBS重新混悬细胞，以40 g/L多聚甲醛固定，上流式细胞仪检测细胞表面抗原表达；以CD34、CD45阳性率低于5%，CD90阳性率高于95%为标准，鉴定所得细胞为高纯度的骨髓间充质干细胞。

骨髓间充质干细胞的转染：转染前对骨髓间充质干细胞进行细胞计数，调整细胞浓度为10⁹ L^-¹，根据病毒感染细胞所用培养基体积和病毒量参数，T25瓶，正常培养基5 mL，MOI=1，加病毒液5 µL计算得出大鼠骨髓间充质干细胞每瓶加入病毒液15 µL，置于37 ℃，体积分数5%CO₂，饱和湿度条件下培养，分别于12， 48，72 h进行荧光检测，观察细胞转染效率。

主要观察指标：骨髓间充质干细胞的形态观察与鉴定，以及转染血管内皮生长因子165后12，48，72 h的荧光检测结果。

讨论

间充质干细胞是一种多功能间充质干细胞，能够自我更新，并存在于产后几乎所有组织和器官中，它是中胚层发育的早期细胞，是一类存在于骨髓网状间质内的非造血干细胞，具有分化成各种间叶组织细胞的潜能^[6]。近年来的研究表明间充质干细胞基于其自我更新和对免疫功能的调节为特征的多功能特点，可以在合适的诱导条件下就可以分化为心肌细胞、血管内皮细胞、神经元、肝细胞、上皮细胞和脂肪细胞等细胞，以及骨、关节、脂肪、肌腱、肌肉和骨髓基质等多种组织^[7-12]。

细胞分泌分自分泌、旁分泌、远距离分泌3种形式，其中细胞分泌的细胞因子、激素等不经血液运输而经组织液扩散作用于临近细胞的方式称之为旁分泌。骨髓间充质干细胞分泌细胞因子主要是通过旁分泌的形式作用于其他细胞，发挥作用。骨髓间充质干细胞可能通过多种途径改善组织供血状况，目前认为其旁分泌促血管生成因子及具有向血管内皮细胞分化的潜能是其促血管再生的重要机制。血管再生形成过程中需要各种细胞因子调节，骨髓间充质干细胞几乎可以分泌血管再生所需的各种细胞因子，其中包括只对内皮细胞起作用的生长因子^[13-14]。间充质干细胞分泌的与血管发生有关的细胞因子包括血管内皮生长因子、前列腺素F、转化生长因子B、血管生长素1、肝细胞生长因子等^[15]，后两者可以促进平滑肌细胞增殖，其他主要是促进血管内皮细胞的增殖及迁移。在这些细胞因子对缺血心肌的修复中, 血管内皮生长因子是1989年Ferrara等在牛垂体滤泡星状细胞体外培养液中首先纯化出来的糖蛋白，它是内皮细胞的特异性有丝分裂原，也是一种有效的血管形成和通透性诱导因子。

血管内皮生长因子基因mRNA前体经选择性剪切后产生功能相互拮抗的两类选择性剪切异构体^[16-17]：一类为刺激性血管内皮生长因子异构体，体内以血管内皮生长因子165和血管内皮生长因子121表达为主，具有强烈的促血管新生作用；一类为抑制性血管内皮生长因子异构体，以血管内皮生长因子165b表达为主，拮抗血管内皮生长因子165介导的促血管新生，抑制血管生成^[18]。研究表明：血管内皮生长因子作为强有力的趋化因子，能够促进内皮祖细胞从骨髓中迁移出来并参与新生血管的形成。血管内皮生长因子是一种糖蛋白，相对分子质量约45 000，为同型二聚体，编码血管内皮生长因子的基因位于6p21.3，由8个外显子和7个内含子组成断裂基因，血管内皮生长因子与血管内皮细胞的相应受体结合，在转录和翻译过程中通过不同的剪接方式在人类至少形成5种亚型，分别由121、145、165、189、和206个氨基酸组成，其中血管内皮生长因子165为主要的生物活性形式，刺激血管内皮细胞的增殖，同时还可以促进血管内物质的泄露，为血管内皮细胞的迁移提供基质^[19-20]。它还是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，可在体内诱导血管新生，能直接作用于血管内皮细胞促进血管内皮细胞增殖。是已知的诱导血管再生作用最强的生长因子^[21-23]，血管内皮生长因子还在缺血心肌中起到保护心肌的作用，其机制可能是通过促进NO释放，清除氧自由基以及减少冠脉循环阻力，增加冠脉血流^[24]。

由于对骨髓间充质干细胞生物特性研究的不完善，至今仍没有筛选到骨髓间充质干细胞特异性的标记分子，因此对骨髓间充质干细胞的分离纯化、培养扩增，还没有一个统一的标准进行鉴定^[25-27]。骨髓间充质干细胞是一类具有独特表型的细胞，能表达多种表面抗原，在增殖和分化过程中，骨髓间充质干细胞表面抗原的变化是其分离纯化的标志之一。因此，目前常采用细胞形态学、流式细胞术、免疫组化等技术联合做为鉴定骨髓间充质干细胞的鉴定方法^[28-29]。

研究发现，骨髓间充质干细胞表达间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面抗原，但是造血干细胞的抗原为阴性表达^[30]。一般认为，骨髓间充质干细胞表达SH2、SH3、CD29、CD44、CD71，CD90、CD106、CD120a、CD124、CD166和多种表面蛋白，但不表达如Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原、碱性磷酸酶或骨桥蛋白(osteopontin)等与分化相关的细胞标志^[31]；不表达如造血前体细胞标志抗原 CD34、成熟造血细胞标志抗原CD38、淋巴细胞表面抗原CD11、白细胞标志抗原CD45等^[32-33]。实验应用流式细胞仪对培养的第3代细胞的CD34、CD45和CD90等表面抗原标志进行了鉴定，结果显示培养的细胞表面抗原显示出间充质干细胞的特性，CD34和CD45等造血干细胞和内皮细胞表面标志抗原表达阴性，阳性率小于5%，而间充质干细胞表面标志抗原CD90表达阳性，阳性率超过95%，细胞均一性较好，纯度较高。

实验利用基因转染技术，将血管内皮生长因子165转染入骨髓间充质干细胞中，使其持续稳定的表达蛋白血管内皮生长因子165，影响转染细胞的自分泌和旁分泌功能，使骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞和血管新生作用进一步增强。实验中采用的质粒pGLV-EF1a，带有绿色荧光蛋白载体，在转染过程中与转染细胞相结合，形成融合蛋白，从而能表达出荧光效应，研究表明绿色荧光蛋白或其突变体对寄主细胞生长发育没有明显的影响。绿色荧光蛋白表达后折叠环化，在氧存在下由65-67位的氨基酸残基(Ser-Tyr-Giy)环化，形成发色团^[34-36]，不需要添加其他酶就可以在紫外线或蓝光激发下发出绿色荧光，便于及时动态观察。本实验采用慢病毒为载体转染骨髓间充质干细胞，慢病毒以VSV-G膜蛋白包裹，从而明显增加了病毒感染谱，转染效率高，而且操作简便。实验结果表明转染后骨髓间充质干细胞在12 h绿色荧光蛋白开始表达，在48 h绿色荧光蛋白表达增多，在72 h表达达到高峰，说明转染成功，同时也说明了利用基因转染技术诱导骨髓间充质干细胞分化成为血管内皮细胞成为可能，但如何使转染率增高，转染稳定表达还需进一步筛选，为后期研究提供良好的基础。

血管内皮生长因子165转染骨髓间充质干细胞绿色荧光蛋白的表达

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