骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛样细胞的降血糖作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.31.019

中国组织工程研究

• 器官移植学术探讨 academic discussion of organ transplantation • 上一篇下一篇

骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛样细胞的降血糖作用

张立明¹，王人颢²，万美荣³，温泉²，刘小云³，邵永²

1邳州市人民医院普外科，江苏省徐州市 221300；徐州医学院附属医院，2普外科，3中心实验室，江苏省徐州市 221000

收稿日期:2013-01-18 修回日期:2013-05-27 出版日期:2013-07-30 发布日期:2013-07-30
通讯作者: 王人颢，硕士，主任医师，副教授，硕士研究生导师，徐州医学院附属医院普外科，江苏省徐州市 221000 wangrenhao@126.com
作者简介:张立明★，男，1981年生，山东省莱芜市人，汉族，2012年徐州医学院普外科专业毕业，硕士，医师，主要从事肝胆胰方面的研究。 zlm2001789@163.com
基金资助:
文章获得徐州医学院院级课题基金资助。

Hypoglycemic effect of bone marrow mesenchymal stem cells in vitro differentiated into islet-like cells

Zhang Li-ming ¹, Wang Ren-hao ², Wan Mei-rong³, Wen Quan², Liu Xiao-yun³, Shao Yong²

1Department of General Surgery, Pizhou People’s Hospital, Xuzhou 221300, Jiangsu Province, China; 2Department of General Surgery, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221000, Jiangsu Province, China; 3Central Laboratory, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221000, Jiangsu Province, China

Received:2013-01-18 Revised:2013-05-27 Online:2013-07-30 Published:2013-07-30
Contact: Wang Ren-hao, Master, Chief physician, Associate professor, Master’s supervisor, Department of General Surgery, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221000, Jiangsu Province, China wangrenhao@126.com
About author:Zhang Li-ming★, Master, Physician, Department of General Surgery, Pizhou People’s Hospital, Xuzhou 221300, Jiangsu Province, China zlm2001789@163.com
Supported by:
Hospital-level Research Fund of Xuzhou Medical College*

摘要/Abstract

摘要：

背景：移植胰岛及胰岛细胞治疗糖尿病已初见成效，但由于胰岛来源匮乏和免疫排斥反应而研究受阻。
目的：移植将大鼠骨髓间充质干细胞在体外诱导分化为胰岛样细胞，观察其对糖尿病大鼠的治疗作用。
方法：将大鼠骨髓间充质干细胞用碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子等诱导，免疫细胞染色等检测诱导情况。SD大鼠腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型,建模成功后，随机分为对照组移植诱导胰岛样细胞的实验组，实验组经肾包囊移植诱导后的胰岛样细胞，对照组移植相同体积生理盐水，观察移植后糖尿病大鼠血糖和体质量变化。
结果与结论：大鼠骨髓间充质干细胞体外经肝细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等因子诱导后可以向胰岛样细胞转化。细胞移植后，对照组大鼠血糖无明显变化(P > 0.05)，实验组大鼠血糖与对照组和移植前相比较，明显降低(P < 0.05)。大鼠骨髓间充质干细胞经含肝细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等的诱导体系可诱导成胰岛样细胞，经诱导的细胞有一定胰岛素分泌能力，将诱导后细胞通过肾包囊途径移植入糖尿病大鼠体内，可降低大鼠血糖水平。

关键词: 器官移植, 器官移植学术探讨, 骨髓间充质干细胞, 诱导分化, 共同培养, 胰岛细胞, 细胞移植, 糖尿病, 免疫细胞化学, 双硫腙染色, 其他基金

Abstract:

BACKGROUND: Islet and islet cell transplantation for the treatment of diabetes has achieved effect, but the research is limited dut to the shortage of islet and immune rejection.
OBJECTIVE: To observe the effect of transplantation of islet-like cells that in vitro differentiated from bone marrow mesenchymal stem cells on the treatment of diabetes in rats.
METHODS: The rat bone marrow mesenchymal stem cells were induced with basic fibroblast growth factors and hepatocyte growth factors, and then received immunocytochemistry staining to detect the induction. The Sprague Dawley rats received intraperitoneal injection of streptozotocin to establish the diabetes models. After modeling, the rats were randomly divided into control group and experimental group (transplanted with induced islet-like cells). The experimental group was transplanted with the induced islet-like cells through renal capsule, and the control group was transplanted with normal saline in the same dose. The blood glucose and body mass of the diabetes rats were observed after transplantation.
RESULTS AND CONCLUSION: The bone marrow mesenchymal stem cells could differentiate into islet-like cells after in vitro induced with basic fibroblast growth factors and hepatocyte growth factors. There was no significant change in blood glucose of the control group after transplantation (P > 0.05), and the blood glucose of the rats in the experimental group was significantly decreased compared with the control group (P < 0.05). The bone marrow mesenchymal stem cells can differentiate into islet-like cells after in vitro induced with the induction system containing basic fibroblast growth factors and hepatocyte growth factors, and the islet-like cells have a certain ability of insulin secretion. The transplantation of induced islet-like cells after transplanted into the diabetes rats through renal capsule can decrease the blood glucose level of the rats.

Key words: organ transplantation, organ transplantation academic discussion, bone marrow mesenchymal stem cells, induced differentiation, co-culture, islet cells, cell transplantation, diabetes, immunocytochemistry, dithizone staining, other grants-supported paper

中图分类号:

R318

张立明，王人颢，万美荣，温泉，刘小云，邵永. 骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛样细胞的降血糖作用[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.31.019.

Zhang Li-ming, Wang Ren-hao, Wan Mei-rong, Wen Quan, Liu Xiao-yun, Shao Yong. Hypoglycemic effect of bone marrow mesenchymal stem cells in vitro differentiated into islet-like cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.31.019.

图/表（结果） 1

2 相关研究结果分析

2.1 相关研究资料的获取检索CNKI数据库和SCI数据库的方法获取相关研究文献^[11-12]。检索时间范围1990至2012年，检索词为“骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells)；诱导分化(induced differentiation)；分离培养(isolation)；共同培养(co-culture)；胰岛细胞(islet cell)；移植(transplant)；糖尿病(diabetes)；细胞分化(cell differentiation)；胰岛素(insulin)”，检索出相关研究文献28篇，其中CNKI数据库文献12篇，学术期刊9篇，学位论文2篇，会议论文1篇。SCI数据库文献16篇。按设定的主题要求，纳入研究的文献共10 篇^[13-22]。

2.2 入选标准 ①研究的主题包括骨髓间充质干细胞体外诱导分化胰岛样细胞的国内外动物实验、优势及存在的问题等。检索的文献中排除与研究主题无关的文献7篇。②研究所撰写的文章类型包括原著、实验分析及病例分析等。检索文献中排除综述类文章3篇。③文献内容筛选如下，检索的文献中探讨骨髓间充质干细胞体外诱导分化胰岛样细胞的国外基础实验的研究文献共2篇，2篇文献为同一实验项目，且为同一组实验人员进行的研究，定为重复研究文献，选取其中1篇进行深入分析。同样对骨髓间充质干细胞体外诱导分化胰岛样细胞的国内基础实验研究文献共3篇文献也为重复文献，选取其中1篇进行深入分析。在对比骨髓间充质干细胞体外诱导分化胰岛样细胞在糖尿病治疗中的优点研究中，同样检索出重复的2篇研究文献，选取其中1篇进行深入分析。

2.3 质量评估符合纳入标准的10篇研究中，对骨髓间充质干细胞体外诱导分化胰岛样细胞的国内外基础实验研究进行了比较^[13-16]；并分析了骨髓间充质干细胞体外诱导分化胰岛样细胞在糖尿病治疗中的优点^[17-22]。

2.4 国内外相关动物实验的结果 2005年，武晓泓等^[13]将骨髓间充质干细胞诱导分化为胰岛素阳性细胞，观察了大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛素阳性细胞能力，结果流式细胞术检测显示低糖诱导组和高糖诱导组胰岛素阳性细胞数和平均荧光强度均明显高于骨髓间充质干细胞诱导前(P < 0.05)。此后，陆琰等^[14]将骨髓间充质干细胞诱导分化成胰岛样细胞团，在无菌条件下从正常成人骨髓中分离间充质干细胞，体外培养传3代后用表皮生长因子、β-巯基乙醇和高糖培养基诱导骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化，观察骨髓间充质干细胞在诱导前后的形态变化，用胰岛素免疫细胞化学染色检测胰岛素的表达，用双硫腙染色鉴定胰岛β样细胞，结果显示，未经诱导的骨髓间充质干细胞在培养体系中呈贴壁生长，长梭形，经诱导分化后，细胞逐渐变圆，并聚集成团，胰岛素免疫细胞化学表明细胞团内的细胞呈胰岛素染色强阳性反应，双硫腙染色阳性，因此，认为人骨髓间充质干细胞可在体外被定向诱导分化为胰岛β样细胞。

国外专家在该研究领域虽然公开发表论文较晚，但工作做得深入、细致。2004年，Tang等^[15]将由小鼠骨髓间充质干细胞在体外诱导分化为胰岛素生成细胞移植到6只链脲佐菌素诱导的糖尿病模型小鼠(5×10⁶个/只)，另外5只模型小鼠不做移植作为对照组，结果显示，移植1周后模型小鼠的血糖水平降低并趋于正常化，而对照组的模型小鼠血糖持续维持在高水平，体质量减轻，并且大多在成模后15-20 d死亡，结果表明小鼠骨髓间充质干细胞可在体外诱导分化成有功能的胰岛样的细胞。Choi等^[16]报道，将骨髓间充质干细胞在体外诱导分化成胰岛样细胞团，在高糖溶液刺激下胰岛素分泌量由0.25 μg/L增加到0.58 μg/L。

2.5 骨髓间充质干细胞体外诱导分化胰岛样细胞在糖尿病治疗中的优点 ①很强的自我修复能力和多向分化潜能^[17]。②获取方法简单，采用脊髓穿刺或从外周血中提取即可得到骨髓间充质干细胞。③体外易增殖，采用合适的纯化、增殖方法可以在6周内增加2×10⁹倍，照此计算，1次骨髓穿刺所获得的骨髓间充质干细胞可以在较短时间内在体外增殖到能满足移植需要的数量^[18]。④易于基因修饰，可以将外源性基因修饰的骨髓间充质干细胞建立成一种基因治疗的“细胞载体”。⑤自体骨髓间充质干细胞避免了免疫排斥的难题。⑥不存在伦理学上的争议问题，因此具有很大的应用价值^[19-20]。

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引言

近年来，研究发现一些糖尿病患者接受胰腺移植后可脱离胰岛素治疗、血糖控制的最长时间超过6年^[1]。虽然胰腺移植是治疗糖尿病的重要方法，但该手术创伤大，移植后并发症多，且难以解决供体缺乏和免疫排斥反应^[2]。胰岛移植也是治疗糖尿病的有效手段^[3-4]，但是胰岛细胞来源有限，也存在免疫排斥反应难以广泛开展的问题。骨髓间充质干细胞是骨髓中除造血干细胞以外的另一种成体干细胞，具有多向分化潜能^[5]，它可避免使用胚胎干细胞移植所带来的法律及伦理上的局限性，若将自体的骨髓间充质干细胞诱导分化为胰岛细胞，可彻底解决细胞来源和免疫排斥等问题，是治疗糖尿病的理想细胞移植的来源。有研究显示，通过诱导剂可将骨髓间充质干细胞诱导为胰岛样细胞，具有与胰岛细胞相似的超微结构，并能分泌胰岛素，该细胞注入糖尿病模型体内可降低血糖水平^[6]。

骨髓间充质干细胞在骨髓中的含量非常低，并且随着年龄的增加或体质的衰弱，细胞的数量会逐渐减少，因此，将体内的骨髓间充质干细胞在体外条件下进行分离纯化和扩增就显得尤为重要。目前骨髓间充质干细胞的分离方法主要有以下几种^[7]：①密度梯度离心法，是应用淋巴细胞分离液通过离心分层，将有核细胞和造血细胞分离，获取界面的有核细胞进行细胞培养。②贴壁筛选法，骨髓间充质干细胞具有贴壁生长特性，而造血细胞则悬浮生长，反复冲洗可去除悬浮生长的造血细胞，就可以收集贴壁生长的骨髓间充质干细胞。③细胞表面分子标记分选法，主要是根据骨髓间充质干细胞的细胞表面分子特征来分离。④细胞筛选法，主要是根据细胞大小，利用一种3 µm小孔的塑料培养皿从骨髓中筛选骨髓间充质干细胞。有研究证明高浓度葡萄糖是诱导骨髓间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的不可缺少的刺激因子^[8]。大量体内外研究提示，某些生长因子能促进胰岛细胞的发育和分化^[9]，而可能作为体外骨髓间充质干细胞诱导分化为胰岛样细胞的诱导剂。

根据作者实验室预实验结果以及前人研究，特别是在李艳华等^[10]的二步诱导法的基础上，文章对诱导体系加以改进，更好的模拟胰腺发育条件。第1步，选用肝细胞生长因子、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等作为诱导因子，使之向神经干样细胞分化；第2步，添加影响胰岛细胞增殖、分化的诱导因子如β细胞调节素、肝细胞生长因子、激活素A、全反式维甲酸、胰高血糖素样肽1、尼克酰胺、B27诱导，使之向胰岛样细胞分化，然后对诱导后细胞进行检测，评价是否诱导为胰岛素分泌细胞，然后用于治疗链脲佐菌素所致糖尿病大鼠模型，观察其是否能降低糖尿病大鼠血糖。

文章的目的是观察骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛样细胞的降血糖作用，以此为研究细胞移植治疗糖尿病提供一些实验基础和理论依据，现报告如下。

材料方法

1.1 材料 选取健康成年SD大鼠，雌雄不限，由徐州医学院实验动物中心提供。

主要试剂：

1.2 方法

1.2.1 大鼠骨髓间充质干细胞的分离和培养 脱臼法处死1周龄SD大鼠，超净台无菌条件下取出双侧股骨，10 mL注射器吸取无菌含体积分数10%胎牛血清的生理盐水，反复冲洗骨髓腔收集细胞于无菌离心管中。在4 ℃离心机中2 000 r/min离心15 min，弃上清液，离心后的细胞加入5 mL含有体积分数10%胎牛血清的达氏修正依氏培养基/F12，反复吹打均匀后平均接种于25 cm²塑料培养瓶中(三四瓶)，于37 ℃、体积分数5%CO₂饱和湿度培养箱内培养。

1.2.2 大鼠骨髓间充质干细胞向胰岛样细胞的诱导分化选出生长状态良好的第3代细胞进行诱导，诱导分2步。第1步，将3 mL诱导液1(含10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、肝细胞生长因子及2%B27的达氏修正依氏培养基/F12）诱导6 d。第2步，将 3 mL诱导液2(含10 μg/L β细胞素、肝细胞生长因子、激活素A、胰高血糖素样肽1、全反式维甲酸和10 mmol/L尼克酰胺及2%B27的达氏修正依氏培养基/F12)诱导12 d。放置于37 ℃、体积分数5%CO₂饱和湿度培养箱内培养。1次/d添加诱导因子，首次剂量加倍，以维持诱导因子浓度，每3 d更换一次培养液，共诱导18 d。

1.2.3 诱导后胰岛样细胞的形态及功能的鉴定 ①双硫腙染色检测：弃去旧培养基，PBS冲洗，将双硫腙储存液50.0 µL加入到30 mL无菌PBS中，混匀，每孔加入3 mL混合液，静止5-10 min，倒置显微镜下观察、拍照。②免疫细胞化学染色法检测胰岛素抗体表达：常规制备细胞爬片，操作步骤按试剂盒说明。③透射电镜观察诱导前后细胞微观结构。

1.2.4 大鼠糖尿病模型的建立 30只健康雄性SD大鼠，造模前禁食12 h，链脲佐菌素剂量为55 mg/kg，将其溶于冰冷的柠檬酸钠缓冲液中，避光，立即向大鼠腹腔注射链脲佐菌素。糖尿病大鼠模型建模成功的鉴定标准为大鼠腹腔注射链脲佐菌素5 d后检测大鼠血糖≥16.7 mmol/L，且有明显多饮、多尿等症状，皮毛凌乱，笼中垫料较湿，可判断大鼠糖尿病模型造模成功。

建模成功后随机分组方法分为两组：①对照组经肾包囊注射生理盐水。②实验组经肾包囊移植诱导后的胰岛样细胞。

1.2.5 移植细胞 ①将诱导后细胞制成浓缩单细胞悬液，并计数。②麻醉实验大鼠，碘伏消毒液消毒手术区，经右背侧腰切口暴露右肾。用无菌微量注射器吸入PBS或预先已制备好的细胞，每只接受细胞移植的大鼠注射(5.0-6.0)×10⁶个细胞，轻柔注射到糖尿病大鼠肾包囊内，然后依次缝合肌肉皮肤，消毒手术区。③移植后7，14，21，28 d上午8:00各检测1次血糖水平并称量体质量。

1.3 统计学分析 采用SPSS16.0软件进行统计学处理，数据均采用x(_)±s表示，对数据进行正态性检验及方差齐性分析；计量资料采用独立样本t 检验和单因素方差分析；检验水准α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

1.4 结果

大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养：见图1。

大鼠骨髓间充质干细胞诱导后形态和双硫腙特异染色：大鼠骨髓间充质干细胞在诱导分化第6 天，开始出现胞体变大，不规则，并有聚集倾向，12 d左右可见细胞部分形成团簇状，至18 d时发现细胞形成团状结构，双硫腙染色成红棕色，见图2。

免疫细胞化学检测诱导前后胰岛素表达：将诱导后细胞接种于24孔板，细胞免疫化学检测胰岛素表达，细胞浆染成棕色，见图3，4。

透射电镜观察诱导前后细胞超微结构变化诱导后细胞可见分泌细胞特点：大量分泌空泡和分泌颗粒，有内质网扩张，胞核不规则，见图5，而诱导前干细胞少有此特点，见图6。

糖尿病大鼠细胞移植后变化：实验组大鼠细胞移植后7 d血糖值明显下降(24.52±2.18) mmol/L，体质量未有明显下降，对照组血糖与移植前无明显下降，体质量明显下降。具体移植后血糖仪测血糖、电子秤称量体质量结果，见表1。

讨论

首先，胰腺与中枢神经系统具有相似的发育机制^[21]：细胞分化过程中胰岛样细胞可能来源于神经元样细胞^[22]，某些神经生长因子也是胰腺发育的重要因素。表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子具有扩增神经干细胞的功能^[23]，用表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子可将骨髓间充质干细胞诱导成为巢蛋白阳性的神经干样细胞，杨柏梁等^[24]的研究也证实了这点。而肝细胞和胰岛细胞来源于同一祖细胞，肝细胞中的干细胞也可以转分化为胰岛细胞^[25]，肝细胞生长因子被认为是肝再生特异的细胞因子^[26]，所以，为了更好的使骨髓间充质干细胞向胰腺方向诱导，文章在第1步也添加了肝细胞生长因子，并补充神经培养液因子B27，以使方法更加完善。

第2步诱导即加入胰岛细胞发育所需的各种因子：尼克酰胺是一种内分泌细胞分化诱导剂，能特异的促进胰岛细胞分化^[27]。胰高血糖素样肽1主要由小肠和大肠的内分泌细胞和脑的神经细胞分泌，其生理功能就是促进β细胞的增殖和分化，并促进β细胞分泌胰岛素，最近的研究也证实了这一点^[28]。研究发现，激活素A和Β细胞素组合可以促进β细胞分化^[29]。RA是维生素A类衍生物，近年来研究发现，维甲酸类化合物能明显改善机体胰岛素抵抗，促进胰岛β细胞的胰岛素分泌^[30-31]。体外实验发现维甲酸可以短期内将胚胎干细胞诱导分化成胰岛素分泌细胞，移植到糖尿病小鼠体内可以使其血糖恢复正常^[32]。

此二步法充分考虑了胰腺的生长发育过程所需的微环境：尽量模拟胰腺生长过程，结果证实了此培养体系可以诱导成具有分泌胰岛素功能的细胞。但是实验中发现，诱导组血糖并未完全降至正常水平，第3周后血糖未再明显下降，可能是移植细胞在体内未有继续增殖，而未持续发挥降糖作用；或者诱导细胞还没有真正成熟，还没有达到正常胰岛细胞的功能。毕竟胰腺的真正发育环境是极其复杂的，要找到诱导胰岛细胞的最佳方法还有很长的路要走。

骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛样细胞的降血糖作用

Hypoglycemic effect of bone marrow mesenchymal stem cells in vitro differentiated into islet-like cells

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