三种去抗原异种松质骨材料生物相容性的比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.29.003

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (29): 5275-5281.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.29.003

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三种去抗原异种松质骨材料生物相容性的比较

尹小朋¹，许慧芬²，何惠宇³

新疆医科大学第一附属医院，¹颌面肿瘤外科，³口腔修复科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；²新疆职业病医院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830091

收稿日期:2012-12-14 修回日期:2013-01-05 出版日期:2013-07-22 发布日期:2013-07-22
通讯作者: 何惠宇，博士，新疆医科大学第一附属医院口腔修复科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054 yxp516888@163.com
作者简介:尹小朋★，男，1982年生，山东省莱芜市人，汉族，新疆医科大学毕业，硕士，医师，主要从事颌面部肿瘤及干细胞的研究。 yxp5168@163.com
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81060088)，课题名称：三维打印构建组织工程化牙槽骨的实验研究；新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(2011211A073)，课题名称：荧光蛋白标记的组织工程骨修复颌骨缺损及其成骨能力的观测研究。

Comparison of the biocompatibility of three kinds of antigen-extracted xenogeneic cancellous bone matrices

Yin Xiao-peng¹, Xu Hui-fen², He Hui-yu³

¹Department of Maxillofacial Surgery, First Affiliated Hospital, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; ²Occupational Disease Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830091, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; ³Department of Prosthodontics, First Affiliated Hospital, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2012-12-14 Revised:2013-01-05 Online:2013-07-22 Published:2013-07-22
Contact: He Hui-yu, M.D., Department of Prosthodontics, First Affiliated Hospital, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China yxp516888@163.com
About author:Yin Xiao-peng★, Master, Physician, Department of Maxillofacial Surgery, First Affiliated Hospital, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China yxp5168@163.com
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81060088*; the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2011211A073*

摘要/Abstract

摘要：

背景：经过一系列理化处理去抗原后的异种骨支架材料，其形态与结构类似于人体骨组织。
目的：检测3种不同方法制备去抗原异种骨支架材料的生物相容性。
方法：将经过物理、化学及物理联合化学方法制备的去抗原异种骨支架与羟基磷灰石生物陶瓷4组材料分别植入裸鼠背部皮下组织，术后4，8，12周行组织学观察。以经过物理、化学及物理联合化学方法制备的去抗原异种骨支架材料浸提液分别培养羊骨髓间充质干细胞7 d，观察细胞黏附、生长、增殖及基质分泌情况。
结果与结论：术后4周时，4组材料周围均有较强的炎症反应；术后12周时，物理及物理联合化学制备的去抗原异种骨支架和羟基磷灰石生物陶瓷材料孔隙内及周围组织炎症反应基本消失，极少量炎症细胞存在，材料降解较术后8周时多。化学制备的去抗原异种骨支架材料孔隙内及周围组织炎症反应仍存在；表明物理及物理联合化学制备的去抗原异种骨支架具有良好的组织相容性。羟基磷灰石生物陶瓷和物理联合化学法制备的去抗原异种骨支架材料周围有少量成骨细胞规则排列，并可见少量成骨，表明有异位成骨的趋势。经过物理或物理联合化学方法去除抗原的异种骨支架材料具有良好的细胞相容性；单纯经过化学方法处理的异种骨材料细胞相容性较差，不符合生物材料安全性标准。

关键词: 生物材料, 组织工程骨材料, 异种骨支架材料, 羟基磷灰石生物陶瓷, 生物相容性, 皮下植入, 细胞毒性, 骨髓间充质干细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The form and structure of antigen-extracted xenogeneic cancellous bone through series of physical and chemical treatment are similar to human tissue.
OBJECTIVE: To detect the biocompatibility of antigen-extracted xenogeneic cancellous bone matrix prepared by three different ways.
METHODS: The antigen-extracted xenogeneic cancellous bone scaffold materials which were prepared through physical, chemical and physical-chemical combined methods and hydroxy apatite biological ceramic materials were implanted into the dorsum subcutaneous tissue. Histological observation was done at 4, 8 and 12 weeks after surgery. The antigen-extracted xenogeneic cancellous bone scaffold materials which were prepared through physical, chemical and physical-chemical combined methods respectively was used to culture sheep bone marrow mesenchymal stem cells for 7 days. Cell adhesion, growth, proliferation and stroma secretion were observed.
RESULTS AND CONCLUSION: At 4 weeks after surgery, a strong inflammatory reaction was detected around materials in four groups. At 12 weeks, the xenogeneic bone materials prepared through physical and physical-chemical combined methods and hydroxy apatite biological ceramic materials internal pore and surrounding tissue inflammation disappeared basically, with the presence of thimbleful inflammation cells. The material degradation was more than at 8 weeks. The xenogeneic bone materials prepared through chemical methods material internal pore and surrounding tissue inflammation still existed, suggesting that the xenogeneic bone materials prepared through physical and physical-chemical combined methods exhibited good histocompatibility. A small amount of orderly osteoblasts existed around hydroxy apatite biological ceramic materials and physical-chemical prepared materials, with a small amount of bone. These suggested that there was a tendency for ectopic bone formation. The xenogeneic cancellous bone materials prepared through physical or physical-chemical combined methods have better cytocompatibility. However, scaffold materials prepared through chemical method have poor cytocompatibility and they are not qualified for the safety standards of biological materials.

Key words: biomaterials, tissue-engineered bone materials, xenogenic bone scaffold materials, hydroxyapatite biological ceramic, biocompatibility, subcutaneous implantation, cytotoxicity, bone marrow mesenchymal stem cells, National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

R318

尹小朋，许慧芬，何惠宇. 三种去抗原异种松质骨材料生物相容性的比较[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(29): 5275-5281.

Yin Xiao-peng, Xu Hui-fen, He Hui-yu. Comparison of the biocompatibility of three kinds of antigen-extracted xenogeneic cancellous bone matrices[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(29): 5275-5281.

图/表（结果） 6

2.1 去抗原异种骨支架材料的皮下植入实验 术后所有动物运动和进食正常，手术切口无感染、植入材料无排出现象等，切口一期愈合，无动物死亡。取材时大体观察见材料周围组织颜色、质地正常，同时发现软组织长入材料内部，难以将组织和材料分开。术后4周组织学观察，在4组材料表面和孔隙内可见大量纤维结缔组织及毛细血管，发现有结缔组织增生，其间有大量的巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞等炎细胞浸润，毛细血管扩张、充血；术后8周时，物理组、物理联合化学组和羟基磷灰石生物陶瓷组(对照组)材料周围组织炎症反应减轻，无毛细血管扩张、充血，少量中性粒细胞和单核细胞浸润，同时可见材料开始有少部分降解。化学组材料周围组织炎症反应未见减轻，毛细血管扩张比术后4周时未见明显改善。术后12周时，物理组、物理联合化学组和对照组材料孔隙内及周围组织炎症反应基本消失，有极少量炎症细胞存在，材料部分降解比术后8周时多。化学组材料孔隙内及周围组织炎症反应仍存在，化学组及物理组材料周围未见成骨细胞排列。对照组和物理联合化学组材料周围有少量成骨细胞规则排列，并可见少量成骨，表明有异位成骨的趋势，结果见图1。

2.2 去抗原异种骨支架的细胞毒性实验

材料浸提液对细胞增殖的影响：MTT法检测4组复合培养2，4，6，8，10，12 d时的细胞增殖，经重复测量方差分析结果显示：物理组、物理联合化学组及对照组之间复合培养液的吸光度值差异无显著性意义(P > 0.05)；而化学组复合培养液的吸光度值低于其他各组 (P < 0.05)。提示物理组、物理联合化学组材料对骨髓间充质干细胞的增殖不存在影响，化学组材料对骨髓间充质干细胞增殖有明显影响，抑制细胞的生长，见图2。

物理组复合培养液培养骨髓间充质干细胞第2，4，6，8，10，12天时的细胞相对增殖率在96.64%-104.02%之间，细胞毒性等级为0或1级，表明物理组材料无细胞毒性；物理联合化学组细胞相对增殖率在96.25%- 102.17%之间，细胞毒性等级为0或1级，表明物理联合化学组材料无细胞毒性；化学组细胞相对增殖率在60.28%-67.15%之间，小于75%，细胞毒性等级为2级，表明化学组材料存在细胞毒性，见图3。

羊松质骨支架材料与骨髓间充质干细胞的复合培养情况：倒置相差显微镜观察显示，细胞接种到物理组和物理联合化学组材料上7 d时附着于材料孔隙内及周围的细胞彼此相连，见图4，5。

化学组材料7 d时仅材料周围有极少量的细胞，材料孔隙内不存在细胞，见图6。

扫描电镜观察显示，物理组和物理联合化学组在低倍镜下可见大量骨髓间充质干细胞黏附于材料孔隙中增殖生长，细胞生长密集，在高倍镜下可见细胞分界不清，细胞相互融合成片状，细胞与材料结合较紧密，有大量胶原分泌见图7，8；化学组材料在低倍镜和高倍镜下观察显示材料孔隙内无细胞黏附，见图9。

参考文献

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引言

材料方法

设计：细胞学水平，体内观察实验。

时间及地点：于2011年1至6月在新疆医科大学第一附属医院医学研究中心完成。

材料：

实验动物：SPF级健康4周龄裸鼠30只，体质量20- 23 g，雌雄不拘，由上海斯莱克实验动物中心提供。3月龄雄性阿勒泰大尾羊，普通级，体质量20.5 kg，由新疆医科大学第一附属医院实验动物中心提供，用于骨髓间充质干细胞的制备，实验动物机构许可证号：SYXK (新)2010-0001。

实验方法：

去抗原异种松质骨材料的制备：取新鲜市售的羊椎骨，尽量去尽软组织，去骨膜，将其锯成0.5 cm×0.3 cm× 0.2 cm大小的羊骨块，流水冲洗过夜。按羊椎骨去抗原处理方法不同分为3组：①物理组，先将羊松质骨用去离子水冲洗，再经超声清洗脱细胞1 h，之后浸入 0.09 mol/L焦磷酸钠溶液中，65 ℃电子恒温水浴箱中水浴12 h，干燥后将处理好的羊松质骨块放入室温下的高温微波煅烧炉中，缓慢升温至1 000 ℃，维持2 h，然后关闭煅烧炉，自然冷却至室温，制备去抗原异种松质骨支架材料。②化学组，将羊松质骨先经过体积分数为30%H₂O₂浸泡12 h脱蛋白处理，1∶1甲醇/氯仿浸泡 12 h脱脂处理，以上处理重复3次，去离子水冲洗，再进行超声清洗脱细胞1 h，晾干后制得去抗原异种松质骨支架材料。③物理联合化学组，将羊松质骨先经过以上化学组的方法处理，再进行物理组方法联合处理制备去抗原异种松质骨支架材料。⁶⁰Co照射消毒，置于4 ℃冰箱中备用^[3-5]。

三种去抗原异种松质骨材料的生物相容性比较实验的主要试剂与仪器：

去抗原异种松质骨支架材料浸提液的制备^[6]：实验材料按照ISO10993-1标准要求(试样表面积/浸体介质= 3 cm²/mL)置于生理盐水或培养液中，37 ℃水浴箱中静置72 h，过滤除菌后，制得去抗原异种松质骨支架材料浸提液，然后密封于无菌瓶，置于4 ℃冰箱中备用。

皮下植入实验：

动物模型的建立：所有手术操作均在SPF级动物房的超净工作台内进行。选取裸鼠30只，在无菌条件下以体积分数75%乙醇消毒，阿托品+氯胺酮+安定各一支混合稀释至10 mL(10 mL/kg)腹腔注射进行麻醉。于裸鼠背部脊柱两侧，距中线1.5 cm处，分左上、左下、右上、右下4个区，分别切开皮肤1.0 cm，充分游离周围的皮下组织，制备4个皮下囊，分别植入制备的物理组、化学组、物理联合化学组去抗原异种松质骨支架及羟基磷灰石生物陶瓷材料(实验中使用的“天博齿固”羟基磷灰石生物陶瓷材料在临床上已经应用，产品标志：YZB/国0919-2006《珊瑚羟基磷灰石植入材料》；产品型号：ZC-J基本型，块状，实验中为对照组)。每只裸鼠背部植入4块异种骨支架材料，植入后严密缝合创口，保证植入后材料周围有一定的组织松弛度，相同条件下分笼饲养。

组织学观察：术后4，8，12周3个时间点每组各处死10只动物，将材料与周围组织一起取出，取标本大体观察后，以体积分数10%甲醛固定，24 h后石蜡包埋，切成0.5 μm的石蜡切片，行苏木精-伊红染色，进行组织学观察，不同时点光学显微镜下观察是否有血管长入异种骨材料和成骨情况。

细胞毒性实验：

MTT法检测材料浸提液对羊骨髓间充质干细胞增殖能力的影响：采用全骨髓贴壁法分离培养羊骨髓间充质干细胞，经流式细胞仪鉴定表达CD44阳性后，取生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞，调整细胞悬液浓度为5×10⁷ L^-1。取3块96孔培养板，随机分为物理组、化学组、物理联合化学组和对照组，共192孔。每孔加入100 μL细胞悬液，置入37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱培养24 h。倒置相差显微镜观察细胞贴壁后，弃培养板内原培养液。物理组、化学组、物理联合化学组加入200 μL相应的材料浸提液，对照组加入200 μL DMEM/F12培养液，每3 d换液1次，共培养12d。分别在第2，4，6，8，10，12天每组取5孔测定，每孔加入20 μL 50 g/L MTT液，继续培养4 h，弃去孔中培养液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，振荡10 min，用酶标仪在490 nm波长下测定各孔吸光度值^[7]。并按照以下公式计算细胞相对增殖率：

根据细胞相对增殖率判断细胞毒性等级，分析评定材料的毒性程度^[8-10]：0%为Ⅴ级，细胞相对增殖率1%-24%为Ⅳ级，细胞相对增殖率25%-49%为Ⅲ级，细胞相对增殖率50%-74%为Ⅱ级，75%-99%为Ⅰ级，≥100%为0级。细胞相对增殖率值越大，级数越低，则材料毒性越小。

去抗原羊松质骨支架材料与羊骨髓间充质干细胞的复合培养：无菌条件下将消毒好的物理组、化学组、物理联合化学组材料置于6孔培养板中，加入适量DMEM/F12培养液预湿12 h，将培养液吸干弃去。调整细胞悬液浓度为1×10¹⁰L^-1，于无菌超净台内向每块材料缓慢滴加细胞悬液100 μL，置37 ℃，体积分数为5%CO₂饱和湿度孵箱内孵育。孵育2 h后将6孔板取出，于无菌超净台内沿6孔板壁向每块支架材料缓慢加入DMEM/F12培养液3 mL，放入CO₂培养箱中培养。每日倒置相差显微镜观察材料周围和孔隙内细胞形态、生长情况。复合培养第7天时，将支架材料取出，3%戊二醛固定，用PBS及蒸馏水分别漂洗数次，在 35 ℃下真空干燥后用离子溅射技术喷金处理，用扫描电子显微镜观察细胞在3组材料上的黏附、生长、增殖及基质分泌情况。

主要观察指标：经过物理、化学及物理联合化学方法制备去抗原异种骨支架材料的组织相容新及细胞相容性。

统计学分析：将收集的实验数据，使用Excel软件建立数据库，将数据导入SPSS 17.0软件，由第一作者利用SPSS 17.0软件进行统计分析及结果输出并保存，同一实验组中不同时间点的计量资料实验数据的测量结果采用General Linear Model的Repeated Measures模块进行重复测量方差分析，各实验组、各时间点均数间多重比较采用LSD-t检验，数据以x(_)±s表示，P < 0.05为组间差异有显著性意义。

讨论

支架材料的选择和制备是骨组织工程领域中的一项十分重要的课题。虽然异种骨来源广泛,价格低廉，但异种骨的免疫排斥问题阻碍了其临床应用。异种骨的去抗原处理是植骨取得成功的关键环节，目的是减少或去除异种骨中的抗原成分或是使抗原性降低到骨修复可以接受的水平，降低或消除异种骨移植所引起的排斥反应。众多学者不断尝试去除异种骨抗原的诸多处理方法。实验在总结以往制备工艺的基础上，经过高温煅烧、脱脂、脱蛋白、脱细胞等理化方法^[11-12]，制备去抗原异种骨松质骨支架材料，尽量降低抗原性，从而有望获得安全可靠的异种骨移植材料。

任何一种新的生物材料在临床应用之前除需要达到符合要求的机械性能及理化性能外，还要确保其临床应用的有效性和安全性^[13]，也就是要进行严格的生物相容性评价。评价的意义在于预测生物材料在与人体接触使用过程中的潜在危害性，保证生物材料的应用安全性。实验采用体内外实验结合的手段，选择了皮下植入实验和细胞毒性实验较为常见的生物学方法^[14-16]，对羊源性异种骨支架材料进行了生物相容性评价。

目前动物体内植入实验仍是研究生物材料与机体反应的最为直接的手段，体内植入方法可以直接地观察机体对植入材料的全身或局部反应。通常采用的方法是将生物材料埋植于皮下、肌肉、骨骼系统一定时间后，既可以直接地观察机体对植入材料的全身或局部反应，还可把周围组织制成切片进行组织学观察，客观地分析材料及其降解产物与机体的相互作用。因此，建立动物模型证明材料在动物体内的生物相容性和安全性是新型材料开发及推广过程中的重要步骤和必要基础。实验中体内实验结果表明，皮下植入实验中术后12周组织学观察物理联合化学组材料周围发现有少量成骨细胞规则排列，有异位成骨的趋势。分析原因认为是由未分化间充质干细胞分化而来，经过理化处理后的物理联合化学组材料其中含有具生物活性的骨形态发生蛋白诱导未分化间充质细胞分化为骨系细胞，具有良好的组织相容性。物理联合化学组材料在裸鼠体内存在部分降解，这符合成骨修复的需求，既起到了引导新骨形成，又不会妨碍骨组织的重建和塑型，这说明物理联合化学组材料具有良好的生物相容性。物理组材料周围未发现成骨细胞，原因可能与单纯经过高温煅烧处理的支架材料的机械强度差，比较脆，在动物体内不能保持原有的形状和孔隙，不利于细胞的附着，妨碍骨组织的重建。化学组材料孔隙内及周围组织炎症反应仍存在，材料周围未见成骨细胞排列，分析原因可能为：①羊椎骨在进行去抗原处理时浸泡在化学试剂中处于静态，不易渗透原材料内部，去抗原不充分，仍存在部分免疫原性。②试剂本身的原因：所用的试剂具有挥发性，浓度不断降低，去抗原不彻底；化学试剂氯仿和甲醇具有毒性，阻碍细胞的生长。

在体外生物相容性评价方面，利用细胞培养技术将材料与细胞共同培养，通过材料对细胞生长、增殖、分化的影响来检测材料的细胞相容性成为较为常见的方法，体外细胞培养法具有以下优点：对材料毒性敏感性高；重复性好、简便、易行、快速；易于控制试验条件，使其标准化；易于定量分析等，目前已被国内外学者用于对材料的细胞相容性、界面结合机制研究以及新材料的筛选等，较体内实验更为敏感，与体内实验既相互独立又互相补充^[17-19]，在材料生物相容性评价中起着越来越重要的作用。体外实验结果表明，仅化学组材料存在细胞毒性，原因可能为：①材料中含有的致热源物质，使细胞生存的环境发生了改变，不利于细胞的黏附和生长。②羊骨髓间充质干细胞种植在材料上的不均衡性，密度过高的地方则体外细胞培养扩增时间延长，增加污染机会，另外细胞所依赖的营养及细胞生存空间受到竞争，细胞生长、增殖受到抑制。

实验结果表明，单纯运用化学方法处理异种骨材料，骨内抗原物质、脂肪及细胞成分去除不彻底，残留少量毒性化学成分，存在部分抗原性，不符合生物材料安全性标准；同样单纯经过高温煅烧处理的异种骨材料，机械强度差，材料易碎，植入动物体内不能保持原有的形状和孔隙，不利于细胞的附着，妨碍骨组织的重建，然而化学方法和高温煅烧联合应用可以将材料中的抗原成分去除的更加彻底，并且保留了一定的机械强度；初步验证了自制的物理联合化学组材料具有良好的生物相容性，有广阔的临床应用前景，为重建颌骨缺损奠定了一定基础。

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目前动物体内植入实验仍是研究生物材料与机体反应的最为直接的手段，体内植入方法可以直接地观察机体对植入材料的全身或局部反应。通常采用的方法是将生物材料埋植于皮下、肌肉、骨骼系统一定时间后，既可以直接地观察机体对植入材料的全身或局部反应，还可把周围组织制成切片进行组织学观察，客观的分析材料及其降解产物与机体的相互作用。因此，建立动物模型证明材料在动物体内的生物相容性和安全性是新型材料开发及推广过程中的重要步骤和必要基础。实验中体内实验结果表明，皮下植入实验中术后12周组织学观察物理联合化学组材料周围发现有少量成骨细胞规则排列，有异位成骨的趋势。分析原因认为是由未分化间充质干细胞分化而来，经过理化处理后的物理联合化学组材料其中含有具生物活性的骨形态发生蛋白诱导未分化间充质细胞分化为骨系细胞，具有良好的组织相容性。物理联合化学组材料在裸鼠体内存在部分降解，这符合成骨修复的需求，既起到了引导新骨形成，又不会妨碍骨组织的重建和塑型，这说明物理联合化学组材料具有良好的生物相容性。物理组材料周围未发现成骨细胞，原因可能与单纯经过高温煅烧处理的支架材料的机械强度差，比较脆，在动物体内不能保持原有的形状和孔隙，不利于细胞的附着，妨碍骨组织的重建。化学组材料孔隙内及周围组织炎症反应仍存在，材料周围未见成骨细胞排列，分析原因可能为：①羊椎骨在进行去抗原处理时浸泡在化学试剂中处于静态，不易渗透原材料内部，去抗原不充分，仍存在部分免疫原性。②试剂本身的原因：所用的试剂具有挥发性，浓度不断降低，去抗原不彻底；化学试剂氯仿和甲醇具有毒性，阻碍细胞的生长。

三种去抗原异种松质骨材料生物相容性的比较

Comparison of the biocompatibility of three kinds of antigen-extracted xenogeneic cancellous bone matrices

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