去细胞肌肉生物支架与人脐带间充质干细胞的相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.25.008

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (25): 4616-4622.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.25.008

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去细胞肌肉生物支架与人脐带间充质干细胞的相容性

张涛¹，文益民¹，李含²，魏祥科²

1解放军兰州军区兰州总医院脊柱外科，甘肃省兰州市 730050
2兰州大学第二临床医学院，甘肃省兰州市 730000

收稿日期:2012-09-10 修回日期:2013-03-08 出版日期:2013-06-18 发布日期:2013-06-18
通讯作者: 文益民，教授，硕士生导师，解放军兰州军区兰州总医院脊柱外科，甘肃省兰州市 730050 wenyimin007@163.com
作者简介:张涛★，男，1984年生，河南省周口市人，汉族，在读硕士，主要从事脊柱外科方面的研究。 526199753@qq.com
基金资助:
全军医学科学技术研究“十一五”计划课题资助项目(06MA081)。

Biocompatibility of human umbilical cord mesenchymal stem cells and acellular muscle bioscaffolds

Zhang Tao¹, Wen Yi-min¹, Li Han², Wei Xiang-ke²

1 Department of Spinal Surgery, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Command of PLA, Lanzhou 730050, Gansu Province, China
2 Second Clinical Medical College of Lanzhou University, Lanzhuo 730000, Gansu Province, China

Received:2012-09-10 Revised:2013-03-08 Online:2013-06-18 Published:2013-06-18
Contact: Wen Yi-min, Professor, Master’s supervisor, Department of Spinal Surgery, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Command of PLA, Lanzhou 730050, Gansu Province, China wenyimin007@163.com
About author:Zhang Tao★, Studying for master’s degree, Department of Spinal Surgery, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Command of PLA, Lanzhou 730050, Gansu Province, China 526199753@qq.com
Supported by:
“Eleventh Five-Year” Planning Project of Medical Science and Technology Research, No. 06MA081

摘要/Abstract

摘要：

背景：去细胞肌肉生物支架联合人脐带间充质干细胞移植将是治疗脊髓损伤的一项重要措施。但两者是否具有良好的相容性，人脐带间充质干细胞能否在去细胞肌肉生物支架中长期存活并均匀分布，尚未得到证实。
目的：观察大鼠去细胞肌肉生物支架与人脐带间充质干细胞的相容性。
方法：改良化学法制备大鼠去细胞肌肉生物支架，将第3代人脐带间充质干细胞Hoechest33342荧光标记后分为3组进行实验，细胞+支架组、细胞+支架大鼠体内组和单纯细胞组。分别应用苏木精-伊红、Masson染色方法观察去细胞肌肉生物支架的组织形态，以荧光倒置相差显微镜和扫描电镜观察人脐带间充质干细胞的吸附和生长情况。
结果与结论：人脐带间充质干细胞与去细胞肌肉生物支架充分附着，生长增殖活跃，细胞在支架内分布均匀。细胞+支架体内组与细胞+支架组相比在移植后1-7 d人脐带间充质干细胞数量差异无显著性意义(P > 0.05)，在移植14 d细胞+支架体内组人脐带间充质干细胞数量大于细胞+支架组(P < 0.05)。提示去细胞肌肉生物支架与人脐带间充质干细胞有较好的相容性，体内环境更有利于细胞增殖和两者融合。

关键词: 生物材料, 材料生物相容性, 生物支架, 肌基膜管, 荧光标记, 相容性, 组织工程, 其他基金

Abstract:

BACKGROUND: Acellular muscle bioscaffold combined with human umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation is an important method for the treatment of spinal cord injury. But the compatibility between acellular muscle bioscaffolds and human umbilical cord mesenchymal stem cells, and whether the human umbilical cord mesenchymal stem cells can distribute evenly in the acellular muscle bioscaffolds have not been confirmed.
OBJECTIVE: To observe the compatibility of acellular muscle bioscaffolds and human umbilical cord mesenchymal stem cells.
METHODS: The rat acellular muscle bioscaffolds were prepared with improved chemical method, and the passage 3 human umbilical cord mesenchymal stem cells were divided into three groups after labeled with Hoechest33342: cell+scaffold group, cell+scaffold in vivo group and cell group. The morphology of the acellular muscle bioscaffolds was observed with hematoxylin-eosin staining and Masson staining, and the adsorption and growth conditions of human umbilical cord mesenchymal stem cells were observed under fluorescence inverted phase contrast microscope and scanning electron microscope.
RESULTS AND CONCLUSION: The human umbilical cord mesenchymal stem cells were fully attached to and actively grew on the acellular muscle bioscaffold, and distributed evenly. There was no significant difference in the number of human umbilical cord mesenchymal stem cells between the cell+scaffold in vivo group and cell+scaffold group at 1-7 days after transplantation (P > 0.05). At the 14 days after transplantation, the number of human umbilical cord mesenchymal stem cells in the cell+scaffold in vivo group was larger than that in the cell+scaffold group (P < 0.05). There is a good compatibility between human umbilical cord mesenchymal stem cells and acellular muscle bioscaffold, and the in vivo environment is more conducive to cell proliferation and integration of cells and scaffolds.

Key words: biomaterials, material biocompatibility, bioscaffold, muscle basal lamina, fluorescence labeling, compatibility, tissue engineering, other grants-supported paper

中图分类号:

R318

张涛，文益民，李含，魏祥科. 去细胞肌肉生物支架与人脐带间充质干细胞的相容性[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(25): 4616-4622.

Zhang Tao, Wen Yi-min, Li Han, Wei Xiang-ke. Biocompatibility of human umbilical cord mesenchymal stem cells and acellular muscle bioscaffolds [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(25): 4616-4622.

图/表（结果） 5

2.1 人脐带间充质干细胞形态 在倒置相差显微镜下见，第2代细胞呈黄绿色，梭形或多角形；第3代细胞增殖良好，初期个别融合，见图1。

2.2 去细胞肌肉生物支架的大体观察结果 经改良化学法制备的去细胞肌肉生物支架，与制备前的肌肉组织相比体积缩小，质较软，似凝胶状，颜色呈半透明乳白色，见图2。细胞+支架体内组去细胞肌肉生物支架移植14 d后支架体积降解约1/3，与周围组织相容性好。

2.3 苏木精-伊红染色与Masson染色结果 苏木精-伊红染色结果示，肌肉组织经去肌细胞后制备的去细胞肌肉生物支架纤维成纵向排列，孔隙大小均匀，未见残留肌细胞。Masson染色结果可见去细胞肌肉生物支架的主要成分为去细胞后残留的胶原纤维，胶原纤维呈绿色，肌纤维呈红色，基本平行走行，形成的孔隙大小大致相同，见图2。

2.4 荧光显微镜观察结果及细胞计数 Hoechest荧光标记的人脐带间充质干细胞在单纯细胞组生长贴壁良好，成梭型或多角形，边缘清晰。细胞核在荧光下观察成椭圆形淡蓝色，偶可见少量高亮死细胞，见图3。细胞+支架组、细胞+支架体内组去细胞肌肉生物支架中可见多量荧光标记细胞，与支架相容性好，在支架孔隙中分布均匀，细胞+支架体内组荧光颜色较细胞+支架组稍浅。

荧光细胞计数：第1天，3组人脐带间充质干细胞均生长良好，差异无显著性意义(P > 0.05)；第3天，细胞+支架组、细胞+支架体内组人脐带间充质干细胞少于单纯细胞组(P < 0.05)，细胞+支架组、细胞+支架体内组间差异无显著性意义(P > 0.05)；第7天，细胞+支架组、细胞+支架体内组人脐带间充质干细胞少于单纯细胞组(P < 0.05)，细胞+支架组、细胞+支架体内组间差异无显著性意义(P > 0.05)；第14天，细胞+支架组人脐带间充质干细胞少于细胞+支架体内组、单纯细胞组 (P < 0.05)，细胞+支架体内组细胞少于单纯细胞组 (P < 0.05)。细胞+支架组、细胞+支架体内组第14天与第1天相比细胞计数增多，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1及图4。

2.5 扫描电子显微镜观察结果 细胞+支架组、细胞+支架体内组可见去细胞肌肉生物支架三维空间结构规则，孔隙分布及大小均匀。去细胞肌肉生物支架中可见大量人脐带间充质干细胞，贴附在支架内表面，生长良好，在去细胞肌肉生物支架中分布排列均匀，见图5。

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引言

脊髓损伤为患者本人及其家庭均带来巨大痛苦，主要是因其神经损伤后肢体运动及感觉功能丧失以及所导致的心血管系统及呼吸系统并发症^[1]，另外神经损伤后其再生能力差，导致脊髓损伤后病情恢复缓慢。

对于脊髓损伤后的治疗，干细胞移植促进脊髓损伤后神经再生是一项重要措施^[2-3]。为使移植后干细胞在受体内更具有靶向性，且不损伤其分化增殖的潜能，组织工程支架联合干细胞移植治疗脊髓损伤成为了当今国内外研究的热点。干细胞的自我增生及潜在多分化能力是决定是否适合细胞移植的重要因素。人脐带间充质干细胞具有来源丰富，易提取并且能够促进脊髓损伤后运动功能恢复，在脊髓损伤后的特定环境下向神经元发挥替代、桥接作用重建神经通路^[4]，同时还具有减轻继发性损伤的特点^[5-7]，是作为干细胞移植治疗脊髓损伤的一个重要来源。

脊髓损伤最初往往会导致细胞和组织的不断丢失，组织工程支架可以模拟细胞外基质的生理状态，从而有利于细胞的黏附、迁移、扩增和分化，从而有利于损伤区轴突的生长和迁移^[8-9]。去细胞肌肉生物支架(肌基膜管)是由剔除肌肉内肌细胞所剩的肌膜构成，具有取材方便，与受体组织有良好的生物相容性等特点^[9]，是细胞移植生物支架的首选，其联合人脐带间充质干细胞移植将是治疗脊髓损伤的一项重要措施。但人脐带间充质干细胞是否与去细胞肌肉生物支架具有良好的相容性，其能否在去细胞肌肉生物支架中长期存活并均匀分布，尚未得到证实。

基于此实验就去细胞肌肉生物支架与人脐带间充质干细胞相容性进行研究，为二者联合移植治疗脊髓损伤提供支持。

材料方法

设计：细胞学水平，对比观察实验。

时间及地点：于2011年11月至2012年6月在解放军兰州军区兰州总医院骨研所完成。

材料：脐带取自解放军兰州军区兰州总医院产科剖宫产健康足月儿，均由产妇及其家属授权同意，且得到医院伦理委员会批准。

清洁级SD大鼠12只，其中6只用于去细胞肌肉生物支架提取，6只用于人脐带间充质干细胞皮下移植，均为雌性，体质量(200±10) g，由兰州大学动物实验中心提供，动物生产许可证号：SCXK(甘)2009-0004。实验过程中对动物处置方法符合中华人民共和国科学技术部2009年发布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准^[10]。

去细胞肌肉生物支架与人脐带间充质干细胞相容性实验的主要试剂及仪器：

Main reagents and instruments:

方法：

人脐带间充质干细胞的分离培养与鉴定^[11]：脐带取下后，保持无菌置于体积分数10%胎牛血清的低糖DMEM中，4 ℃存放，在超净工作台内，剔除脐带内血管，取出Wharton’s Jelly(华尔通胶，又称脐带基质)，用PBS冲洗残存血液后，剪碎至约1mm×1mm×1mm组织块，接种于低糖DMEM中，饱和湿度孵箱内培养。4-6 d后首次换液，以后每三四天更换1次。10-14 d后去除组织块，细胞至80%融合时，以0.25%胰蛋白酶消化传代培养。取第2代细胞，按作者所在实验室以往鉴定方法行成骨、成脂诱导鉴定^[12]。

去细胞肌肉生物支架的制备及灭菌^[13-14]：取雌性SD大鼠竖脊肌，清除肌腱后修剪成约1 cm×0.5 cm×0.5 cm的肌肉块，浸泡于三蒸水中，水平摇床50 r/min震荡24 h。取出后每块肌肉块用1%SDS 10 mL浸泡，于恒温摇床37 ℃50 r/min振荡24 h。完成后再次三蒸水浸泡，水平摇床50 r/min振荡24 h。每组织块用10 mL 3%TritonX-100浸泡，恒温37 ℃ 50 r/min振荡24 h。在以上各步骤均每8 h更换同样液体，清除漂浮物及杂质。完成后PBS浸泡，水平摇床50 r/min振荡24 h冲洗后 -20 ℃保存。

接种前去细胞肌肉生物支架进行冷灭菌：首先采用⁶⁰Co γ射线辐照剂量10 kGy达到合格灭菌标准。然后再分别浸泡于体积分数75%乙醇5 min，PBS及无血清DMEM各漂洗30 min后置于培养皿中。

实验分组及细胞接种：取第3代对数生长期人脐带间充质干细胞，用Hoechest33342(2 mg/L)染色标记，细胞计数控制浓度约2×10⁸ L^-1。将细胞分为3组，细胞+支架组用微量注射器吸取细胞悬液0.5 mL，多点注射入24孔板内的大小为0.8 cm×0.5 cm×0.5 cm的去细胞肌肉生物支架中，孵箱孵育20 min后，向24孔板中加入全培养基。细胞+支架体内组，在与细胞+支架组相同操作的基础上将移植有人脐带间充质干细胞的去细胞肌肉生物支架分别于大鼠背部左前、右前、左后、右后皮下埋置。单纯细胞组直接接种等量细胞于24孔板中。分别于移植后1，3，7，14 d取材检测。

苏木精-伊红染色：常规制备去细胞肌肉生物支架石蜡切片，进行苏木精-伊红染色，观察肌细胞、杂质去除情况以及支架组织内部结构及走行。

Masson染色^[15]：常规制备去细胞肌肉生物支架石蜡切片，Weigert铁苏木精漂染10 min，流水冲洗3 min，体积分数1%盐酸乙醇分化后流水再次冲洗3 min，丽春酸性品红染色10 min，冲洗，1%磷钼酸染色3 min，加入亮绿5 min，体积分数1%冰醋酸处理，依次经过体积分数95%乙醇脱水，二甲苯透明，然后中性树胶封固。

人脐带间充质干细胞荧光显微镜计数及扫描电子显微镜观察：分别在移植后1，3，7，14 d分别观察并记录3组荧光标记的人脐带间充质干细胞存活数量。每组观察随机抽取6个观察点，荧光显微镜400倍视野观察计数并拍照。将植有人脐带间充质干细胞的去细胞肌肉生物在各时间点取材常规3%戊二醛固定，PBS清洗，放入不同浓度乙醇中梯度脱水，醋酸异戊酯替代后临界点干燥仪干燥，离子溅射仪喷金后电镜观察。

主要观察指标：观察去细胞肌肉生物支架在苏木精-伊红染色及Masson染色后的情况以及人脐带间充质干细胞移植后不同时期在支架中的存活数量。

统计学分析：统计学处理者为第一作者，所有数据采用SPSS 19.0统计软件处理，数据均以x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

组织工程材料治疗脊髓损伤需具备3要素：细胞因子、种子细胞、组织工程支架。种子细胞和细胞因子可以促进神经轴突的生长和迁移，组织工程支架则对于损伤的脊髓有桥接作用^[8]。良好的生物支架需有如下特性：生物相容性好、高孔隙率、机械强度与组织强度适宜以及生物降解性好等。去细胞肌肉生物支架具有相对规则的内部孔隙，结构类似于神经膜管。实验结果苏木精-伊红染色和Masson染色均显示去细胞肌肉生物支架纤维排列整齐，有较高的孔隙率，另外，去细胞肌肉生物支架取材方便，取自于同种异体或同种同体动物，因此具有良好的组织相容性。在大鼠脊髓半切和横断损伤处移植去细胞肌肉生物支架，可以促进轴突的生长迁移，在支架内可检测到新生轴突^[16-19]。

干细胞具有增殖和向其他细胞分化的潜能，因此在再生医学和组织工程中占有重要地位。如今已有一部分干细胞被用于临床治疗^[20-21]。间充质干细胞作为干细胞的一种被广泛研究，研究证实其具有向神经细胞、骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞等分化能力^[22-23]。人脐带间充质干细胞同样具有多项分化能力^[24-25]。人脐带间充质干细胞来自于人脐带华尔通胶，取材丰富且易分离培养。利用特定干细胞培养基分离提纯人脐带间充质干细胞。流式鉴定该细胞不表达单核巨噬细胞标志CD14，内皮细胞CD31，亦不表达造血细胞CD34，CD45，淋巴细胞标志CD19，而特异性阳性表达CD73及CD105。其培养出来的细胞符合国际细胞疗法间充质干细胞委员会制定的鉴定人脐带间充质干细胞的最低标准^[26]。Yang等^[27]实验表明，在大鼠脊髓横断性损伤后移植人脐带间充质干细胞可以刺激损伤处多种神经增长因子表达，有助于损伤后的修复。人脐带间充质干细胞分化形成的许旺细胞联合神经生长因子3移植至大鼠脊髓损伤处，施万样细胞大量增生且明显促进大鼠行为学恢复^[6]。同时经静脉注射人脐带间充质干细胞亦对大鼠脊髓损伤有明显修复作用^[5]。

实验将人脐带间充质干细胞移入去细胞肌肉生物支架并给予相应的细胞生长条件后，细胞可在支架内生长良好。虽该实验是不同种属细胞移植，但未见明显细胞排斥反应。人脐带间充质干细胞能否在大鼠体内长期增殖分化，尚无实验证实。通过对人脐带间充质干细胞的标记观察，可见其在与去细胞肌肉生物支架结合后，细胞数量逐渐增多，可见其生长良好。通过扫描电镜观察到人脐带间充质干细胞在去细胞肌肉生物支架内分布均匀，与周围黏附明显，因此可见人脐带间充质干细胞与去细胞肌肉生物支架具有良好的相容性。通过细胞+支架组与细胞+支架体内组的对比观察，在第1周内，2组人脐带间充质干细胞数量变化无明显区别，而在第2周，细胞+支架体内组人脐带间充质干细胞数量增长较细胞+支架组明显，差异有显著性意义，说明从长期来看，大鼠体内环境更有利于人脐带间充质干细胞与去细胞肌肉生物支架结合后的细胞增殖。

通过改良化学法制备的去细胞肌肉生物支架内部网状结构整齐，孔隙大小均匀，并且机械强度与脊髓组织适宜，是较为理想的治疗脊髓损伤的组织工程支架。实验将人脐带间充质干细胞植入去细胞肌肉生物支架后，干细胞能够在该支架中长期贴附生长，并且分布均匀，说明两者有较好的相容性。另外，通过细胞+支架组与细胞+支架体内组对比可说明与体外细胞培养基相比，大鼠体内环境更有利于人脐带间充质干细胞增殖及其与去细胞肌肉生物支架融合。但实验缺乏对细胞的长期跟踪观察，另外人脐带间充质干细胞是否能在去细胞肌肉生物支架内仍保存向神经细胞分化的能力，还未给予证实。人脐带间充质干细胞与去细胞肌肉生物支架相容后向脊髓损伤处定向移植，能否更好地促进脊髓损伤后功能的恢复亦需大量实验验证。

综上所述，人脐带间充质干细胞与去细胞肌肉生物支架具有良好的相容性，大鼠皮下移植后更有利于干细胞增殖，这为人脐带间充质干细胞与去细胞肌肉生物支架联合移植治疗脊髓损伤提供了更有力的支持。

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Biocompatibility of human umbilical cord mesenchymal stem cells and acellular muscle bioscaffolds

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