组织工程骨的血管化策略

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.15.019

摘要/Abstract

摘要：

背景：如何在构建组织工程骨的同时重建其血液供应，已成为骨组织工程从基础研究向临床应用过渡的关键性问题。
目的：对组织工程骨构建过程中一系列促进血管化的方法进行综述。
方法：由第一作者检索PubMed数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed)及万方数据库(http://www.wanfangdata.com.cn)1974至2008年有关组织工程骨构建过程中促进血管化方法的文献，检索词为“组织工程骨，血管化，骨缺损，血供”。阅读文献标题和摘要进行初筛，排除与本文研究目的无关及内容重复的研究，共保留61篇文献归纳总结。
结果与结论：组织工程骨构建过程中促进血管化的方法主要包括体内及体外两方面。体外方案例如血管内皮细胞、生长因子，体内方案例如血管束、带血管蒂筋膜瓣、带血管蒂肌瓣、带血管蒂骨膜瓣等均对组织工程骨构建过程中的血管化进程具有促进作用。虽然血管化组织工程骨的研究取得了很大的发展, 但仍然存在诸多不足。相信随着血管形成机制基础研究的深入，控释生长因子及其协同作用能力的提高，优化选择使用种子细胞，改进材料的结构性能，血管化组织工程骨将具有日益广阔的前景。

关键词: 组织构建, 组织构建综述, 组织工程骨, 血管化, 血管内皮细胞, 生长因子, 血管束, 骨缺损, 血供

Abstract:

BACKGROUND: How to rebuild the blood supply during construction of tissue-engineered bone is becoming a critical problem reversed from basic research to clinical application.
OBJECTIVE: To review a series of vascularization methods during tissue-engineered bone construction.
METHODS: A computer-based search of PubMed and Wanfang databases was performed by the first author for the literature about vascularization methods during tissue-engineered bone construction published from 1974 to 2008. The key words were “tissue-engineered bone, vascularized, bone defects, blood supply” in English and Chinese, respectively. Repetitive articles or those with unrelated purpose were excluded, and finally 61 articles were included in result analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: Vascularized methods for construction of tissue-engineered bone are mainly classified as in vivo and in vitro mehtods. Vascular endothelial cells and growth factors belonged to in vitro methods, while vascular bundle, vascular pedicled fascial flap, vascular pedicled muscle flap, vascular pedicled periosteal flap categorized as in vivo methods. Although a great development has been made in vascularized tissue-engineered bone, there are still many inadequacies. We believe that, with the development of mechanism of angiogenesis, vasculared tissue engineered bone will have a promising prospect because of promoting the ability of release-controlled growth factors and their synergies, optimizing the choose of seed cells, and improving the structure and properties of materials

Key words: tissue construction, tissue construction review, tissue-engineered bone, vascularization, vascular endothelial cells, growth factors, vascular bundles, bone defects, blood supply

中图分类号:

R318

郑晓晖，陈振光. 组织工程骨的血管化策略[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.15.019.

Zheng Xiao-hui, Chen Zhen-guang. Vascularized strategy for tissue-engineered bone[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.15.019.

图/表（结果） 1

2.1 体外方案
2.1.1 血管内皮细胞血管内皮细胞做为单层内皮细胞为血管提供了抗凝界面，在止血、控制血管张力、炎症和抑制平滑肌细胞增生中发挥着重要作用。1978年，Herring等[4]首先成功分离内皮细胞，并用其称为内皮细胞接种的方法将细胞移植到人工血管上以改善其通畅度。血管化的关键环节在于内皮细胞的增殖、分化、迁移和聚集。受此启发，学者们提出将内皮细胞做为种子细胞，与成骨细胞联合体外构建组织工程骨。Frerich等[5]将血管内皮细胞联合骨髓基质细胞与支架材料复合后在体外培养，观察其内部的血管形成情况，证实有毛细血管样结构在支架材料内部生长，并形成弥漫的网络，在培养6周后血管总长度达140 mm/mm3，作者认为如将此预构的血管化骨组织植入体内，可改善移植骨的血供，从而促进大块人工骨的骨愈合。相似结果还有较多报道[6-7]。这提示体外复合培养不同细胞并构建血管化组织工程骨是可行的。

研究表明，成骨细胞和内皮细胞间的作用由间接和直接两种机制共同完成。间接机制指两者间通过相互分泌的生长因子进行调控。直接机制指两者通过直接接触完成彼此间的调控。Wang等[8-9]将人碱性磷酸酶阳性的成骨细胞和人碱性磷酸酶阴性的脐静脉内皮细胞以1∶1比例混合后间接培养，发现成骨细胞持续表达血管内皮生长因子mRNA，刺激内皮细胞增殖，而活化的内皮细胞产生胰岛素样生长因子、前列腺素、集落刺激因子等促进成骨细胞增殖和分化。Villars等[10]将人骨髓基质细胞和内皮细胞以直接和间接接触方式混合培养，结果显示直接法的骨髓基质细胞碱性磷酸酶表达活性强于间接法，证明两者之间不仅靠生长因子弥散的相互促进而且涉及细胞间膜蛋白作用。2002年他们利用免疫荧光细胞检测技术对骨髓基质细胞与内皮细胞间功能性接触进行观察[11]，提出两者之间接触连接是由一种特殊的缝隙连接蛋白——连接蛋白43完成的，并通过18α-甘草次酸抑制连接蛋白43合成，发现混合培养中骨髓基质细胞分化能力降低，证明两种细胞之间特异的连接蛋白有传递细胞信号而达到相互促进作用。

虽然内皮细胞和成骨细胞联合种植的成功为完成组织工程骨体外成骨和血供的双重构建创造了条件，但在应用中亦发现有缺点。概括目前存在的困难有：①血管内皮细胞来源困难，操作复杂。②细胞接种密度不易调节。在支架材料有限的空间内培养两种细胞，且要保证足够的有利于增殖的细胞数量，细胞贴附率势必受到影响。③如果是大块支架材料，养分无法深入材料内部以提供两种细胞所需的充足供应。④体外扩增能力有限。⑤异体细胞来源的血管内皮细胞存在免疫原性而较难应用[12]。

由于内皮细胞的体外培养条件很高, 在缺乏生长因子和细胞外基质的情况下很难生存且极易老化, 对载体支架的黏附力也很弱, 故研究者将更多的目光投向内皮祖细胞及其向内皮细胞定向分化上[13-14]。Asahara等[15]的研究证实，人外周血中存在的内皮祖细胞且能分离培养,将这些祖细胞在血管内皮生长因子诱导下培养，可分化成内皮细胞并促进毛细血管的形成。将内皮祖细胞联合骨髓间充质干细胞用于组织工程骨的构建并在体内修复骨缺损的实验研究也显示，内皮祖细胞确实能促进新生血管形成从而加速体内的成骨过程[16]。在内皮祖细胞的获得方式上，以往都是通过外周血单个核细胞梯度离心法获取。目前发现内皮祖细胞可存在于多种组织中。Zhu 等[17]在脂肪组织来源细胞内找到CD31+、CD34+、VE- cadherin+和Von Willebrand factor+的细胞, 经检测证实其具有前体或成熟内皮细胞生物学特征，且进一步的体内及体外实验都证实脂肪组织来源细胞无需额外的生长因子或支持基质就能形成毛细血管网。Reyes等[18]则证明从骨髓中分离得到的骨髓间充质干细胞在血管内皮生长因子的作用下可向内皮细胞表型分化，表达CD31和CD34和Ⅷ因子等，由此考虑使用骨髓间充质干细胞作为内皮细胞的来源细胞, 若使之同时定向分化为内皮细胞和成骨细胞，则可发挥二者的协同作用修复骨缺损，将具有良好前景。

2.1.2 生长因子血管化是多种生物因子参与的复杂病理生理过程，其程度取决于正性和负性调控因子的平衡状态。目前已知的促血管化生长因子可分为以下几类[19-20]: ①仅以内皮细胞为靶细胞，直接促进血管发生和生成，包括血管内皮生长因子和血管生成素。前者作用于血管化的早期，促进原始血管网的形成；后者作用于随后的血管改建、塑形，促进血管网成熟。②作用于含内皮细胞在内的多种细胞，对血管化直接发生作用。包括多种生长因子和趋化因子，典型代表为成纤维细胞生长因子，既能促进内皮细胞分裂又能趋化内皮细胞，具强烈的促进血管再生的作用。③对血管化间接发生作用，主要诱导以上两类因子的释放而刺激血管再生，包括转化生长因子β和血小板衍生因子等。前者主要功能是维持血管壁的完整性, 后者具有促进血管平滑肌细胞分裂从而促进血管成熟和维持血管稳定的作用。抑制血管生成的因子有：血管抑素、内皮抑素和白细胞介素4等。在所有这些因子中，对血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的研究最为深入，文章对此予以重点介绍。

血管内皮生长因子：血管内皮生长因子可由多种细胞分泌，如内皮细胞、平滑肌细胞及一些间质和基质细胞。Ferrara等[21]从牛垂体滤泡细胞体外培养液中首次将血管内皮生长因子分离纯化出来。血管内皮生长因子家族由多个成员组成，其中血管内皮生长因子121和血管内皮生长因子165是主要的分泌成分和效应分子, 对内皮细胞的体外增殖和血管生成作用最强[22]。血管内皮生长因子通过结合内皮细胞膜上的受体——血管内皮生长因子受体1、血管内皮生长因子受体2、血管内皮生长因子受体3和NRP(neuropilin)发挥其重要功能：①引起内皮细胞分裂增生。②增加血管通透性。③促内皮细胞迁移和浸润, 诱导新生血管生成[23]。Kleinheinz等[24]在兔下颌骨的两侧制造孔状骨缺损，然后将Ⅰ型胶原植入体复合0.8 mg血管内皮生长因子165植入一侧缺损区，另侧不加血管内皮生长因子为对照，结果显示实验侧的血管密度、血管面积、成骨密度、成骨面积较对照侧有明显增加。同时，实验研究还证明在体内的骨形成和骨愈合过程中，血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白的表达是一对偶联过程，二者相互促进，起到级联放大效应。Peng等[25]利用反转录病毒载体将骨形态发生蛋白4基因和血管内皮生长因子基因分别导入骨骼肌细胞，然后将两种细胞以一定比例混合后接种明胶海绵支架用于修复小鼠6 mm颅骨缺损。结果表明：①单纯应用骨形态发生蛋白4诱导的内源性血管生成是不充分的，单纯应用血管内皮生长因子也不足以加速骨愈合。但两者联合应用，血管内皮生长因子促进了骨形态发生蛋白4诱导的骨形成。②血管内皮生长因子促进了转染骨形态发生蛋白4细胞诱导骨愈合过程中的血管生成。③血管内皮生长因子增加了细胞募集和存活。④两种细胞以适当的比例接种对保证骨愈合过程中血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白4发挥联合效应至关重要。⑤血管内皮生长因子＋骨形态发生蛋白4基因介导的骨修复是通过软骨化骨方式实现的。在此过程中，血管内皮生长因子增加软骨形成和加速软骨形成之后的吸收。

将血管内皮生长因子导入组织工程骨的各种方法虽然在一定程度上能促进血管生成、增加材料的内部血运，但也存在一些缺点[26]：①血管内皮生长因子与材料在复合制备时，现有技术往往造成其生物活性显著下降。②由于外部血管长入的深度和时间不能与种子细胞的成活同步,难以使材料内部获得快速而充足的血运，因此形成的新生血管的稳定性和功能都不太理想。③血管内皮生长因子局部含量不易调控。由于生长因子对血管生成的作用是网络式的序贯作用，因此单一的低含量因子作用效果是有限的，而高含量可能导致变形的、无功能的血管生成，有潜在的致瘤性。碱性成纤维细胞生长因子：碱性成纤维细胞生长因子由中胚层来源的细胞和内皮细胞分泌。1974年Gospodarowicz等[27]首次从牛神经组织纯化到该物质，因其等电点呈碱性(9.6)而得名。1986年Abraham等[28]首次克隆了碱性成纤维细胞生长因子的cDNA，使其基因的克隆和表达研究取得了重大的进展。碱性成纤维细胞生长因子是一种广谱的有丝分裂原，对来源于中胚层和神经外胚层的细胞具有明显的促进增殖作用。其靶细胞有成纤维细胞、血管内皮细胞、软骨细胞、成骨细胞等，调控细胞分化、增殖、迁移和调亡，并在新生血管形成、血管塑形和肿瘤形成方面发挥重要作用[29]。现在知道碱性成纤维细胞生长因子血管生成作用是通过调节血管内皮生长因子的表达及生成来实现的，碱性成纤维细胞生长因子通过与血管内皮生长因子基因的启动子(SP-1)区结合并使之激活, 导致血管内皮生长因子的表达[30]，从而作用于新生血管形成过程的多个环节中，如毛细血管基底膜降解、内皮细胞迁移增生、胶原合成等。作为一种毛细血管增殖刺激剂，它还能能促使毛细血管向骨断端及移植物中长入，使早期骨修复组织中的软骨岛数量增多，并促进软骨内的血管化，加速了软骨痂的成熟和骨化。Wenger 等[31]培养脐静脉内皮细胞时加入成纤维细胞生长因子，通过测量血管芽的总长度发现碱性成纤维细胞生长因子促进血管生长作用明显。Srivastava 等[32]在股动脉闭塞小鼠后肢内注入碱性成纤维细胞生长因子后，重建了后肢血运，恢复了原有血供的31%。Kawaguchi等[33]对大白鼠腓骨骨折的动物模型进行治疗，局部使用重组人碱性成纤维细胞生长因子，能有效促进正常大白鼠和糖尿病大白鼠(愈合缺陷)的骨折愈合，作者认为这可能与碱性成纤维细胞生长因子促进了骨折修复过程中的早期血管形成有关。

由于碱性成纤维细胞生长因子属生物活性蛋白，单纯的碱性成纤维细胞生长因子在体内扩散快、对热和酸敏感、易被蛋白酶分解、半衰期短，因而不能在有效的时间内作用于更多的靶细胞，其生物学效能难以得到充分地发挥。因此，学者们开始研究碱性成纤维细胞生长因子缓释载体。Perets 等[34]设计了一种复合了聚乳乙醇酸微球的多孔藻酸盐支架，这种微球能控制释放碱性成纤维细胞生长因子，且不影响支架的孔隙率及孔隙大小。碱性成纤维细胞生长因子不仅诱导成纤维细胞增殖而且加速植入鼠腹腔肠系膜处三维支架基质的血管化，长入的血管是对照组的4倍。通过检测内皮细胞周围的壁细胞的层厚提示了碱性成纤维细胞生长因子的控制释放并诱导形成大量成熟的血管。此外，酸性明胶水凝胶、肝素-海藻胶原、聚乳乙醇酸/聚乙二醇等材料都被证明能有效控制碱性成纤维细胞生长因子的释放[35-37]，较持久促进新生血管的形成。与此同时，基因治疗技术也在碱性成纤维细胞生长因子的控制释放方面发挥了积极的作用。郑启新等[38]体外将碱性成纤维细胞生长因子基因转入种子细胞骨髓间充质干细胞，并与β-磷酸三钙多孔基质材料复合，移植修复同种异体兔桡骨长节段骨缺损。以单纯空载体转染骨髓间充质干细胞为对照。扫描电镜观察证实，碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞增殖分化活性明显优于对照组。检测结果显示：实验组骨缺损正常修复，有大量活跃的新骨及丰富的毛细血管生成；对照组各时间点则以纤维结缔组织为主，未见明显的新骨及血管生成。免疫组化结果显示，转基因细胞可持续表达碱性成纤维细胞生长因子至少4周以上。作者认为碱性成纤维细胞生长因子是作为一种促血管形成因子，可加速血管再生，从而促进新骨的形成。

生长因子的联合应用：虽然生长因子对血管生成和血管发生的各个阶段均有调节作用，但单一的生长因子可能不能启动整个新生血管形成的级联反应[39]。因此，在骨组织工程研究中，学者们开始将目光转向多种生长因子的联合使用。Richardson等[40]设计了一种聚合体支架系统, 可控性地释放2种生长因子。并将包埋血小板衍生因子BB与血管内皮生长因子165的缓释支架植入动物皮下。术后发现在联合两种因子的支架较对照组(血小板衍生因子BB或血管内皮生长因子165)有更快速、更致密、更成熟的血管形成。Peirce 等[41]使用藻酸盐支架依次释放血管内皮生长因子164和血管生成素1。将缓释支架植入大鼠皮下后显示，联合两种生长因子的方法较单用血管内皮生长因子164相比，形成了更持久的血管再生反应。Ramboshebi 等[42]的研究表明，单独使用大剂量的转化生长因子β (20 ng)、碱性成纤维细胞生长因子 (500 ng)或骨形态发生蛋白7(1 000 ng)可以在鸡的尿囊绒膜上有明显的血管形成，而联合使用小剂量的转化生长因子β(5 ng)、碱性成纤维细胞生长因子 (100 ng)和骨形态发生蛋白7(100 ng)同样有明显的血管形成，但是，单独小剂量使用某种生长因子则血管形成明显减少，这表明生长因子对血管形成有协同促进作用。李涛等[43]将人骨髓间质成骨细胞、脐静脉血管内皮细胞与经1，25-(OH)2D3处理的珊瑚羟基磷灰石人工骨联合构建组织工程骨并植入裸鼠体内，发现经1， 25-(OH)2D3处理后的组织工程骨的成骨及血管化能力增强。作者认为当成骨细胞和内皮细胞共培养时，作为生物活性因子，1，25-(OH)2D3可以加强成骨细胞与内皮细胞间的相互作用。成骨细胞中结构性地表达血管内皮生长因子mRNA，而且这一过程可被1，25-(OH)2D3加强, 致使条件培养基中血管内皮生长因子分泌量增加。

2.2 体内方案
2.2.1 血管束将血管束植入骨缺损或骨坏死处促进成骨的作用机制是靠植入血管与受区血肿机化形成的毛细血管网吻合，构成新的循环路径促进骨再生[44-45]。

学者们在构建组织工程骨时在细胞-支架复合物内植入血管束，以期在体内促进组织工程骨血管化。杨志明等[46]设计了一种方法：实验组将材料消毒后通过中空管道植入兔隐动、静脉血管束，保持近端的供血；对照组A将同样材料用吸附法复合血管内皮细胞生长因子植入腹股沟肌袋内，不植入血管束；对照组B仅用材料植入腹股沟肌袋内，不加入血管内皮细胞生长因子，也不植入血管束。发现在术后8周，各植入材料表面均有周围血管长入。墨汁灌注实验组可见整个移植骨墨染已完全血管化，对照组A在12周时尚未完全血管化，对照组B血管化仅为材料表层。提示用血管束植入中空材料内，可有较快的血管化过程。在临床应用时可在受区解剖出非主干血管植入材料内，不需专门分离血管蒂和行血管吻合，操作简便，具有较好的应用前景。有学者于大鼠体内植入聚乙醇酸与胎牛来源的成骨细胞复合构成的组织工程骨，贯穿以隐血管束，14 d后观察发现血管束生长枝芽进入组织工程化骨组织内。于近端血管束注入染料，植入物被染色，证明该方法可使组织工程化骨建立血液循环。用这种带血管蒂的组织工程化骨修复自体股骨干缺损，用钢板置入内固定，12周后组织工程化骨与受体骨两端愈合，测试结果显示具有较好的生物力学性能。目前，血管束植入促进组织工程骨的体内血管化和骨化在国内外均有报道，并进行了成功的大动物实验[47-50]。
2.2.2 带血管蒂筋膜瓣深筋膜的血供相当丰富，对此目前已有共识。显微外科手术中，携带深筋膜的组织瓣常用于包裹或覆盖缺血组织，以建立新的血液循环。国内学者在这方面有较深入的研究，为组织工程化骨血管化提供了一个确切的可借鉴的方案。陈滨等[51]在羊胫骨中段制备了一个带蒂深筋膜瓣，用以修复羊胫骨中段2 cm的骨缺损，该瓣包裹了含有成骨细胞的细胞-支架材料复合物。术后用组织学切片以及动态放射性核素等方法观察，发现术后筋膜包裹组较未加筋膜包裹组在放射性核素浓聚灶的浓度和面积、新生血管的数量和面积上均有明显的优势，提示筋膜包裹可显著促进组织工程化骨体内的血管化进程。

樊征夫等[52]在兔前臂设计了一个带无名血管蒂的深筋膜瓣，用以包裹复合细胞的支架材料来修复兔桡骨中段1.5 cm骨缺损。结果发现筋膜瓣包裹的组织工程骨内再血管化的速度明显快于未加筋膜瓣包裹的对照组。组织学上见到许多方向杂乱的粗大、多分支的断面。血管化作用活跃的部位有成团或成片的间充质细胞群，伴有较少的纤维肉芽组织。其再血管化的方式主要是毛细血管活跃增生，可能是在窦隙状毛细血管形成基础上，彼此相互交通、吻合，形成复杂球形毛细血管网络。揭示了其促进血管化的靶目标可能是通过早期快速毛细血管增生，大量运转宿主定向间充质细胞至骨移植体中，其促血管化作用环节是在成骨过程前段。

2.2.3 带血管蒂肌瓣肌肉的血供充沛，间充质细胞和各种生长因子来源丰富。肌瓣移植临床上常用来修复软组织缺损、填塞慢性骨髓炎和骨囊肿等的术后死腔。研究组织工程的学者们很早就认识到肌瓣的这些特点，将体外复合培养的种子细胞－支架复合物种入肌肉内，用于异位预构带蒂肌骨瓣。Vacanti等[53]在1994年就报道了用该方法预构出带蒂新生骨组织。随后，Casabona等[54]将人骨髓基质细胞复合羟基磷灰石植入裸鼠背阔肌内，8周后进行组织学检测，证实材料内有骨组织形成，血运丰富，作者认为用此生物技术预构的方法可以将肌瓣转化为肌骨瓣。由于支架材料的外形可以根据骨缺损区的形状设计，所以预构的肌骨瓣如果用于修复骨缺损可以获得类似自体带血供骨移植的效果，还能避免取骨供区的并发症。Terheyden等[55-57]的实验则进一步接近临床实践，他们将骨形态发生蛋白7 和块状异种矿化骨复合后植入微型猪预先制备的带胸背血管蒂的背阔肌内，6，12，24 周行CT、血管造影及组织学检查显示含骨形态发生蛋白7的支架材料内有大量新骨形成，血运丰富。然后将生长6周的预构组织工程肌骨瓣移植到下颌角骨缺损处，预构肌骨瓣的胸背血管蒂与受区的颈外血管的分支吻合。对照组为骨形态发生蛋白7/异种矿化骨复合材料。实验证实移植后的组织工程预构骨依然保持存活，成骨效果明显优于对照组。此类预构骨瓣具有以下明显的优点: ①可以按照受区形状制成相应的模式。②植入受区后可较快实现与宿主骨的连接。③移植骨内部塑形快，能较快的适应宿主骨的力学环境。④有独立的血供，即使在感染或血液循环差的部位也可存活。⑤能够修复大段骨缺损。当然，其也有先天的缺点，那就是在体内需要2次手术完成，即首先要完成预构手术，之后才能进行移植修复手术，需要有一个较长的治疗过程，患者需忍受巨大的创痛。不过对于那些面临截肢的骨缺损患者来说，这应当是个可以接受的治疗方案，将来可能在组织工程骨修复骨缺损的领域内占有重要的地位。

2.2.4 带血管蒂骨膜瓣骨膜是骨组织血液供应的主要来源，其内含有大量骨原细胞,在各种生长因子的诱导下可被激活、增殖、分化为成骨细胞。Finley等[58]1978年发表关于吻合血管的骨膜移植动物的实验报告。由于带血管蒂骨膜瓣移植后与受区建立血液循环快、促进成骨作用明显，国内从20世纪70年代末开始了大量基础和临床研究，涌现出一批新的骨膜瓣供区和新术式，以治疗骨不连、骨缺损、骨坏死等难题。蒋祖言等[59]用带血管股骨骨膜瓣联合同种异体脱钙骨移植治疗实验性犬股骨大段骨缺损，发现其可获得等同于骨折愈合的治疗效果。国外Levine等[60]也进行了类似的实验，他们将羟基磷灰石/骨形态发生蛋白复合物分别植入兔耳前血管供养区域的骨膜深层和浅层，以单纯羟基磷灰石植入对侧相同位置做对照。在术后4，8周分别进行血管造影、扫描电镜及组织学观测。证实羟基磷灰石/骨形态发生蛋白骨膜下植入组获得最佳的血管化和成骨表现。有学者在Lewis鼠胫骨内面解剖出带隐动静脉的骨膜瓣(外附肌肉和筋膜)，然后分10组研究添加或不加重组人骨形态发生蛋白2、聚乳酸材料对成骨的影响：①带蒂骨膜瓣。②带蒂骨膜瓣＋重组人骨形态发生蛋白2。③结扎血管蒂的骨膜瓣＋重组人骨形态发生蛋白2。④去除骨膜层的带蒂组织瓣，且将深层翻向外。⑤带蒂骨膜瓣+聚乳酸。⑥带蒂骨膜瓣+聚乳酸+重组人骨形态发生蛋白2；以上为异位预构组，放置在腹股沟部皮下。⑦单纯聚乳酸。⑧带蒂骨膜瓣+聚乳酸。⑨聚乳酸+重组人骨形态发生蛋白2。⑩带蒂骨膜瓣+聚乳酸+重组人骨形态发生蛋白2；以上为修复股骨 1 cm骨缺损组。在术后4周和8周分别行放射和组织学分析，显示不论是异位预构还是原位移植，包含带蒂骨膜瓣、聚乳酸、重组人骨形态发生蛋白2的组均表现出最佳的成骨状态。作者认为理想的骨形成应该包括4个因素：骨形态发生蛋白、可降解材料、骨祖细胞、血供。以上实验因没有包含细胞和材料复合的体外构建阶段，尚不能称为经典意义的组织工程骨，但为进一步开展带血管蒂骨膜瓣预构组织工程骨打下坚实基础。近期，国内有学者以骨形态发生蛋白2基因转染的兔骨髓间充质干细胞并复合支架材料，体外构建基因修饰的组织工程骨，并以基因修饰组织工程骨+带血管蒂骨膜包裹、基因修饰组织工程骨+血管束植入、基因修饰组织工程骨+游离骨膜包裹、基因修饰组织工程骨、单纯支架等5种方法修复兔桡骨大段骨缺损，结果显示，组内部血管化快速而全面，新骨形成质量和速率均明显优于其他组。认为带血管蒂的骨膜瓣既提供了血运又提供了骨膜成骨细胞, 同时具有良好的骨生成、骨诱导和骨引导作用，其内部的成骨模式既有膜内化骨又有软骨内化骨。目前有关带血管蒂骨膜瓣在组织工程骨体内预构的文献尚少，是个值得深入探究的方向，但应该考虑到不论在人体或动物身上，切取大片带血管蒂骨膜瓣以预构组织工程骨，修复大段骨缺损都会掣肘于供区来源困难的窘境，为此郑晓晖等[61]在实验中设计了一组带血管蒂骨膜瓣贯穿支架材料的模型，获得较好的血管化和成骨效果，为解决该问题探索了一种方法。

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引言

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采用骨组织工程技术修复骨缺损与其他骨移植相比有以下优点：①需要的供体组织少(细胞可在体外培养、增殖)，供给来源不受限制，供体损伤小。②无抗原性或抗原性甚微。③可根据修复缺损的需要将植入物制成精确的三维形状。④可利用仿生设计技术，设计出与天然骨相似的组织工程化人工骨，为长管状骨的大段或较大范围骨缺损的修复提供新的途径。⑤组织工程骨具有生命力，是一种活骨移植，可缩短骨缺损的修复时间并使骨缺损修复的质量提高。

在具有上述优势的同时，组织工程骨也面临迅速血管化的关键问题。体外培养构建的组织工程骨复合物植入体内后，脱离了体外培养时通过更换培养基获得营养、维持代谢，转而由血液-细胞间液完成细胞的营养供应。小块复合物可通过周围组织血管长入，使其与周围组织建立血液循环并获得营养，但这种供养范围仍很有限，研究显示，种子细胞的存活范围仅在血供弥散的150-200 μm内[1]。而大块复合物植入后依靠周围组织血管长入的速度太慢，所需时间较长且很难使长入的血管达到大块组织工程骨的内层，故在尚未建立新的血液循环之前，复合在材料上的种子细胞可能因缺乏足够的营养，其增殖、分化、分泌功能受到影响甚至死亡，导致移植物失效而成为异物[2]。如何在构建组织工程骨的同时重建其血液供应已成为骨组织工程从基础研究向临床应用过渡的关键性问题[3]。

对血供问题重要性的认识催生了组织工程骨构建过程中的一系列促进血管化的方法，本文略对这方面的一些策略进行综述。